DETERMINACIÓN DE UNA CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA POR MEDIO DE LA

FOTOCOLORIMETRÍA

Andrea Sierra, José Danilo Rosero

Universidad Nacional sede Medellín, Facultad de Ciencia, Programa de Ingeniería Biológica

RESUMEN

El objetivo principal de la fotocolorimetría es hallar concentraciones de diferentes

muestras. Esta técnica consiste en medir la absorbancia a una longitud de onda específica
por una solución. La máxima absorción ocurre en una longitud de onda característica para
cada compuesto. Se cree que a mayor concentración será mayor la absorción.
La metodología consistió en primera instancia en determinar el espectro de absorción para
la albúmina. Luego se busco hallar la concentración de una solución problema mediante la
elaboración de una curva de calibración y el uso de la ley de Beer.
Se determino que la máxima absorción de la albúmina ocurre a una longitud de onda de
540 nm y a su vez que la concentración de la muestra problema era de 2.88.
Se concluyo que la intensidad de energía absorbida varía según la concentración de la
sustancia, es decir entre mayor sea la concentración mayor va a ser la absorción.

Palabras clave: curva de calibración - espectro de absorción - albúmina - fotocolorímetro -

blanco

incoloras, al hacerlas reaccionar con una

INTRODUCCIÓN
Ciertas sustancias tienen color y al ser
mezcladas unas con otras un color
distinto. Todas las sustancias pueden
obtener color después de ser tratadas de
cierto modo específico. A su vez se puede
relacionar la intensidad del color con la
cantidad de sustancia a analizar. Para
realizar cálculos surgieron distintas
técnicas y una de ellas es la
fotocolorimetría, la cual basa su
funcionamiento en que las sustancias
coloreadas tienen la capacidad de
absorber diferentes frecuencias de luz. El
método de la fotocolorimetría también
puede ser utilizado para sustancias
especie que genere un producto
coloreado. Una sustancia es capaz de
absorber y transmitir radiación
electromagnética dentro del espectro
visible, que es la región del espectro
electromagnético que el ojo humano es
capaz de percibir (400 a 700 nm). Cada
sustancia coloreada absorberá luz a
determinada longitud de onda, y la
intensidad de la luz y esta variara
dependiendo de la concentración de la
sustancia en la solución. (Álvarez Betin,
s.f).Cuando una molécula absorbe
radiación visible, es decir un fotón de
energía, el electrón adquiere la
capacidad de ocupar un orbital
antienlazante, generando una transición,
la cual dependiendo de la que sea
requiere diferente energía y por ende
diferente longitud de onda. Esta energía
requerida será inversamente
proporcional a la longitud de onda.

Figura 2. Espectro de absorción

Figura 1. Espectro visible

Ecuación 1. Ecuación de Planck

En el laboratorio lo que se busco en

primera instancia fu determinar el
espectro de absorción y se realizó con el
propósito de determinar la energía de la
transición que ocurrió en la molécula al
ser irradiada con luz. Para su realización
fue necesario la elaboración de una tabla
que relacione longitud de onda y la
absorbancia graficando así la absorción
vs. La longitud de onda y así con esta se
puede deducir a que longitud de onda el
compuesto absorbe mayor radiación, en
otras palabras donde ocurre la transición.
El paso siguiente en el laboratorio fue la
elaboración la curva de calibración, que
arroja una línea recta y esta se construyo
a partir con los datos de la solución
patrón de su absorbancia en la máxima
longitud de onda a diferentes
concentraciones. Con esto se pudo
graficar la Absorbancia (eje de
ordenadas) frente a la Concentración (eje
de abscisas). Con esta curva es posible
determinar concentraciones
desconocidas de la solución problema.
Figura 3. Curva de calibración
Los objetivos propuestos para esta
practica fueron en si aprender los
conceptos básicos de la fotocolorimetría
y aprenderá realizar esta técnica, a su vez
poder realizar el espectro de absorción
de la albúmina y así mismo la curva de
calibración para esta. Y por ultimo
determinar con la ley de Beer las
concentraciones desconocidas de la
muestra problema.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales utilizados en esta práctica
fueron los siguientes:
 Equipos:
o Fotocolorímetro
o Celdas de un centímetro
 o Tubos de ensayo
o Pipetas volumétricas
o Pera
 Sustancias:
o Reactivo de Biuret
o Solución de albumina
(3mg/ml)
o Solución Salina
o Muestra de albumina de
concentración
desconocida
Para la determinación del espectro de
absorción de la albumina se siguió el
siguiente procedimiento:
1. En un tubo de ensayo se preparó
la muestra de albumina
adicionando 4ml de esta a
3mg/ml, más 1ml de reactivo de
Biuret y 1ml de solución salina.
Posteriormente se mezcló y se
depositó en la oscuridad durante
20 minutos, formándose un
complejo coloreado.
2. Se prosiguió a depositar en una
celda el blanco (solución salina) y
en otra la muestra del complejo
coloreado.
3. Posteriormente en el
fotocolorímetro se seleccionó la
longitud de onda de interés y se
introducía el blanco y se calibro el
fotocolorímetro para que tomara
la absorción de este como cero.
4. Se prosiguió a introducir la
muestra del complejo coloreado y
se reportó la absorbancia
marcada.
5. Los pasos 3 y 4 se repitieron a
distintas longitudes de onda hasta
que la absorción marco cero.
6. Finalmente se realizó el espectro
de absorción de la albumina.
Para la preparación de la curva de
calibración de la albumina se siguió el
siguiente procedimiento:
1. Se tomaron 10 tubos de ensayos;
y en cada uno de ellos se preparó
una solución distinta, como se
puede ver en la tabla 1.
Tabla 1. Soluciones a preparar.
2. Se depositaron los 10 tubos de
ensayo en la oscuridad por 20
minutos, formándose así el
complejo coloreado.
3. Se siguió a seleccionar en el
fotocolorímetro la longitud de
onda en donde se obtuvo la
mayor absorbancia en el
procedimiento anterior y se
introdujo al blanco y se calibro el
fotocolorímetro para que
asumiera la absorbancia de este
como cero.
4. Se midió la absorbancia de los
siguientes 9 tubos y se reportó la
absorbancia de cada uno de ellos.
5. Se hicieron los cálculos para hallar
la concentración de las muestras
siguiendo la formula
C1*V1=C2*V2.
6. Se realizó con la absorbancia y
concentración de los primeros 6
tubos la curva de calibración de la
albúmina y con la ecuación de
esta se determinó la
 concentración de las muestra El siguiente resultado que se pudo
problema. obtener fueron las concentraciones de la
solución patrón (la cual corresponde a los
RESULTADOS tubos 1-6) mediante la ecuación:

Espectro de absorción: C1*V1=C2*V2

El primer resultado obtenido fue la Despejando C2 se obtiene:

absorbancia de la albumina a diferentes
longitudes de onda, se pudo observar
que la longitud de onda de máxima
absorbancia obtenida en el espectro de
absorción fue de 540nm, esto se puede Dónde:
corroborar en la tabla 2 y en la gráfica 1.
C1: fue la concentración que suministro
el laboratorista para la albúmina y esta
λ Absorbancia λ Absorbancia fue de 3mg/ml.
(nm) (nm)
400 0.092 600 0.164 V1: el volumen de albumina que varía
420 0.045 620 0.127 con cada tubo. Estas se pueden ver en la
440 0.039 640 0.091 tabla 1.
460 0.068 660 0.060
480 0.110 680 0.040 V2: siempre será 6ml y corresponde al
500 0.161 700 0.024 volumen final de cada tubo.
520 0.200 720 0.013
540 0.218 740 0.008 C2: la concentración buscada.
560 0.212 760 0.003
580 0.194 780 0.000 Para el tubo 1 se realizaron los siguientes
Tabla 2. Absorción de la albumina a cálculos:
diferentes longitudes de onda.

Para el tubo 2 se realizaron los siguientes

cálculos:

Gráfica 1. Espectro de absorción de la Para el tubo 3 se realizaron los siguientes

albúmina. cálculos:

Curva de calibración de la albúmina:

Para el tubo 4 se realizaron los siguientes
cálculos:

Tubo Absorbancia Concentración

Para el tubo 5 se realizaron los siguientes blanco

cálculos: 1 0.007 0.05mg/ml
2 0.030 0.15mg/ml
3 0.054 0.25mg/ml
4 0.068 0.35mg/ml
5 0.097 0.45mg/ml
Para el tubo 5 se realizaron los siguientes 6 0.147 0.6mg/ml
cálculos: 7 0.043
8 0.119
9 0.132

Posteriormente se prosiguió a medir la

absorbancia tanto de los tubos con
solución patrón como los de solución
problema, y se obtuvieron los siguientes
resultados reportados en la tabla 3: Gráfica 2. Curva de calibración de la
albúmina.
Tabla 3. Concentración tubos 1-6 y
absorbancia tubos 1-9. Esta curva arrojo la siguiente ecuación:

Una vez obtenidas las concentraciones de Y= 0.2461X-0.0087

los tubos 1-6 y las absorbancias de las
muestras, se pudo elaborar la curva de R2=0,98431
calibración para los tubos 1-6 en una
gráfica de absorbancia vs. Donde
Concentración, como se puede ver en la
Y: absorbancia
gráfica 2:
0.02461 = el coeficiente de extinción

X: la concentración desconocida

0.0087= la corrección del blanco a la

ecuación

Mediante un despeje sencillo se obtiene

la siguiente ecuación:
 Tubo Absorbancia Concentración

Blanco
Esta ecuación fue utilizada para 1 0.007 0.05mg/ml
determinar la concentración de los tubos 2 0.030 0.15mg/ml
7-9. 3 0.054 0.25mg/ml
4 0.068 0.35mg/ml
Para el tubo 7, se realizaron los siguientes 5 0.097 0.45mg/ml
cálculos: 6 0.147 0.6mg/ml
7 0.043 0.22mg/ml
8 0.119 0.53mg/ml
9 0.132 0.59mg/ml
C2: es la concentración hallada para cada
Para el tubo 8, se realizaron los siguientes uno de los tubos 7-9
cálculos:
V2: 6ml y corresponde al volumen final
de cada tubo.

Mediante un despeje sencillo queda la

ecuación:
Para el tubo 9, se realizaron los siguientes
cálculos:

Se prosiguió a utilizar la ecuación anterior

para determinar la concentración de la
Después de realizar los siguientes muestra problema mediante el promedio
cálculos se reportaron en la tabla 4: de las tres concentraciones.

Concentración de la muestra problema

en el tubo 7:
Tabla 4. Concentración y absorbancia

Para obtener la concentración de la

solución problema fue necesario el uso
de la formula:
Concentración de la muestra problema
C1*V1=C2*V2 en el tubo 8:

Dónde,

C1: la concentración de la muestra

Concentración de la muestra problema
problema.
en el tubo 9:
V1: el volumen de la muestra problema
que se puede ver en la tabla 1.
Al promediar las 3 concentraciones se
obtiene:
Para finalizar los cálculos se procedió a
calcular el porcentaje de error:
3  2, 92
%error  x100  2.6%
3
DISCUSIÓN
Determinación del espectro de
absorción de la abúmina:
La albumina en solución es por
naturaleza translucida por lo que es
necesario agregar una sustancia que le
de color para así poder ser testeada con
el fotocolorímetro, esta sustancia es el
reactivo de biuret formado por una
solución alcalina y sulfato de cobre la
cual al entrar en contacto con enlaces
peptídicos forma un complejo iónico
entre el ion cobre y cuatro átomos de
nitrógeno del enlace peptídico con par de
electrones libres, este complejo toma
una coloración violeta la cual tiene la
capacidad de absorber longitudes de
onda del espectro visible.
Para tomar los resultados del espectro de
absorción y determinar a que longitud de
onda la muestra coloreada de albumina
absorbía mayor cantidad de luz, fue
necesario calibrar el fotocolorímetro con
una solución blanco cada vez que se
cambiara la longitud de onda emitida,
dándole así un valor base al aparato del
cual partir. La solución blanco está
formada por solventes diluidos y
sustancias que estén presentes en la
muestra pero no sean parte de la
sustancia a tratar y su importancia radica
en el hecho de que estas otras sustancias
también son capaces de influir en la
absorbancia de la muestra como tal, por
lo cual se calibra el fotocolorímetro con
el blanco esperando así eliminar la
absorbancia de estas sustancias y solo
obtener la del compuesto coloreado.
Al cambiar la longitud de onda es
importante recalibrar el fotocolorímetro
usando la solución blanco ya que esta al
igual que la muestra coloreada se ven
afectadas de manera diferente por las
distintas longitudes de onda, con lo que
la calibración con blanco para una
longitud de onda determinada es
diferente para una distinta.
Al terminar el testeo con el
fotocolorímetro encontramos que el
complejo formado por la reacción de
biuret alcanza su mayor absorbancia de
luz a la longitud de onda de 540nm.
Preparación de la curva de calibración
de la albúmina.
Al determinar la curva de calibración es
necesario tomar varias muestras de una
solución patrón con concentración de
albumina conocida para así tener un
margen dentro del cual el complejo
coloreado de albumina absorbe luz a
distintas concentraciones, dándonos así
una idea de la manera en la este cambia
su absorción al aumentar o disminuir su
concentración, debemos recordar de la
ley de Lambert-Beer que entre mayor sea
la concentración de un compuesto
coloreado mayor será su capacidad para
absorber un tipo de radiación
determinada, este efecto es causado por
el incremento de moléculas del
compuesto en la solución, lo cual
conlleva a un incremento en la incidencia
de radiación sobre estas dándonos como
resultado una disminución en la
transmitancia o luz que logra atravesar la
solución y aumento en la absorbancia o
luz absorbida por la solución. Luego al
tener los datos de absorbancia de la
solución patrón construimos una gráfica
con la curva de absorbancia dada por el
compuesto a diferentes concentraciones
en la solución, con esta podemos
comparar los datos obtenidos de la
solución problema ubicando así su
concentración en el punto en el cual este
las dos líneas se crucen entre sí, esto en
base a que las dos soluciones patrón y
problema contienen el mismo compuesto
por lo cual se deben comportar de
manera similar.
Para los cálculos de las concentraciones
usamos la ley de Lambert –Beer
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴ó𝐴 /𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴ó𝐴 = 
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐴𝐴𝐴 𝐴 /𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 la cual nos
dice que al relacionar la absorbancia y la
concentración de una sustancia
obtendremos una constante que es
diferente para cada tipo de compuesto,
de esta igualdad nosotros somos capaces
de despejar la concentración problema
conociendo los datos de absorbancia de
la solución patrón y problema, y, la
concentración de la solución patrón,
recalcando que las soluciones contienen
el mismo tipo de compuesto.
En nuestro caso obtuvimos como
resultado una concentración de
2.92mg/ml en la solucion problema
frente a 3 mg/ml que era la
concentración real, lo que arrojo un
porcentaje de error del 2.6%, lo que
indica que la práctica fue exitosa.
CONCLUSIONES
 La fotocolorimetria es un método
útil para medir concentraciones
en diversas soluciones, ya que no
se basa en principios como la
acides o basicidad de las
sustancias como es el caso de la
titulación. Con esto nos abre la
posibilidad de conocer
concentraciones desconocidas de
muchas sustancias orgánicas.
 Las radiaciones del espectro
electromagnético visible y su
interacción con las sustancias
químicas, pueden ser
aprovechadas por métodos y
tecnologías para diversos fines en
este caso para encontrar
concentraciones desconocidas de
una sustancia en solución.
 Para cada tipo de sustancia existe
una radiación con una longitud de
onda específica a la cual esta
responde más eficientemente.
Una solución de una sustancia
irradiada por la longitud de onda
con la cual tiene mayor afinidad,
se comporta de manera
coherente o similar al cambiar las
concentraciones, aumentando o
bajando su absorbancia al subir o
bajar la concentración.
 En compuestos incoloros como la
albumina es posible usar
colorantes para lograr medir su
concentración en el
fotocolorímetro. El colorante
debe formar un complejo con la
muestra para así poder tomar una
medición más certera.
 El aparato como el
fotocolorímetro la calibración es
fundamental y para esto se usan
soluciones blanco las cuales
contienen los componentes que
no son de interés al buscar la
concentración de una sustancia.
 Una de las limitaciones del
fotocolorímetro es que solo
trabaja con el espectro de luz
visible teniendo así que agregar
más sustancias a las soluciones
problema para poder testearlas.
REFERENCIAS

- FOTOCOLORIMETRIA Carlos Álvarez.

(n.d.). Recuperado en marzo 2, 2015, de
http://www.academia.edu/4264776/FOT
OCOLORIMETRIA_carlos_lavarez

- FOTOCOLORIMETRIA. (n.d.). Tomado

marzo 2, 2015, de
http://es.slideshare.net/juandavidlopezn
orena/fotocolorimetria

- Ondas - Explicación y definición de una

onda. (n.d.). Tomado el 2 de mazo,
2015, de http://www.quees.info/que-es-
una-onda.html

- Fundamentos de colorimetría - Dialnet.

(n.d.). Tomado el 2 de marzo, 2015, de
http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo
?codigo=981879

- Espectrofotometría. (n.d.). Tomado

Febrero 16, 2015, de
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/esp
ectrofotometria.htm
 Anexos :
1. En qué longitudes de onda el complejo coloreado absorbe mayor energía, de una
explicación del fenómeno?

En las longitudes de onda de 540nm y 560 nm el complejo coloreado presenta su mayor

absorbancia.
al agregar el reactivo de sulfato de cobre (CuSO4) en medio alcalino a la solución con
proteína se forma un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de
entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma
parte de los enlaces peptídicos, este complejo presenta su máxima absorción a 540nm.

En los complejos y iones coloreados de los

metales de transición (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.),
los electrones de los orbítales “d” de baja
energía se promueven a orbítales “d” de alta
energía cuando la molécula absorbe radiación
visible. Estas transiciones ocurren porque las
moléculas que se acomplejan al ion metálico
dividen a los orbítales “d” del ion en dos grupos:
de alta y baja energía.

Imagen 1. Complejo coloreado

2. Explique cuál es la importancia de colorear las moléculas durante el análisis de su

concentración mediante colorimetría. ¿Se puede tomar un espectro de absorción
de la solución de albúmina sin colorear en la región visible?

Es esencial colorear las muestras de proteínas como la albumina en la práctica con el

fotocolorímetro ya que este mide la absorbancia de un compuesto solo el espectro visible,
sin hacer la coloración no obtendríamos resultados fiables.

3. Consulte la estructura o forma molecular del complejo coloreado el cual permite

absorber luz visible. ¿Cuál es el color dentro del espectro visible que absorbe el
complejo y cuál refleja?
La longitud de onda a la que el complejo coloreado presenta su mayor absorbancia es a
540nm que es la longitud correspondiente para las tonalidades verdes.

Imagen2. Espectro de luz visible Imagen 3. Complejo coloreado

4. Explique qué significado que tiene la pendiente de la gráfica y su coeficiente de

correlación (R2) y cómo puede interpretar la ecuación obtenida.

La ecuación de una linea recta se puede expresar como Y=mx+b

Y esta se puede interpretar como:
Y=absorbancia
m=es la pendiente en este caso particular vendría siendo el coeficiente de extinción
x =es la concentracion de la sustancia
b=es la correcion que se le hace a la ecuación debido al blanco

El coeficiente de correlación mide el grado relación entre las variables. Este coeficiente se
aplica cuando la relación que puede existir entre las varables es lineal . Va entre -1 y 1 e
indica que tan cercanos los datos a una recta. El resultado del valor absoluto entre mas
cercano este a uno indica una mayor cercania a una linea recta, en nuestro caso el
coeficiente fue de 0.98431 lo que fue un resultado positivo.

5. ¿Por qué razón se eligió la longitud de onda de máxima absorbancia para hacer
todas las mediciones?

La longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía , es

donde ocurre la transicion electrónica, por esto para hacer nuestra curva de calibración
utilizamos la longitud de onda en la cual ocuria la máxima absobancia , ya que en esta
longitud de onda es cuando el complejo coloreado presenta una mayor absorción de luz
arrojando así resultados mas fiables , esto se puede comparar a cuando uno selecciona la
mejor luz para tomar una foto .