UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NÚCLEO DE SUCRE

ESCUELA DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 6
ÁCIDOS NUCLEICOS: EXTRACCIÓN

PROFESORA: REALIZADO POR:

Hellen Bruzual Br. Montaño Á. Aymeth F

C.I: 27.626.949

Grupo n° “04”

CUMANÁ, JULIO DE 2021

 Introducción

Los ácidos nucleicos, ARN (ácido ribonucleico y) y ADN (ácido

desoxirribonucleico) son polímeros de nucleótidos, responsables de la transmisión de la
información genética. El ADN en organismos procariotas, se encuentra en forma libre a
nivel citosólico, y en eucariotas puede encontrarse en el núcleo y en otros organelos como
mitocondrias y cloroplastos.

Existen diferentes variedades de ARN (mensajero, ribosómico, de transferencia,

nucleares y citosólicos pequeños). La estructura química del ARN se conforma por
polímeros de ribonucleótidos, con funciones específicas que van desde la transmisión de la
información genética hasta la catálisis de reacciones.

Las células poseen los dos tipos de ácidos nucleicos, mientras que los virus, por no
ser células, únicamente poseen uno u otro de ellos. En la presente práctica, se pretende
extraer ADN de diversos vegetales, utilizando procedimientos y sustancias para aislarlo de
los demás componentes celulares.
 Metodología

Materiales y Reactivos Utilizados:

 Licuadora
 Vasos de vidrio
 Tul
 Plato de plástico
 Vasos de plástico transparentes
 Palillos de madera
 Gotero
 Cuchillo de cocina
 Hielo
 Alimentos: cambur, cebolla
 Reactivos: agua de grifo, alcohol absoluto (C2H5OH), sal de mesa, bicarbonato de
sodio (NaHCO3), jabón líquido

Preparación de la solución utilizada:

 Solución de extracción: Se disolvió una cucharada de sal y 2 cucharadas de

bicarbonato de sodio (NaHCO3) en un vaso con 120 ml de agua (H2O). Luego se le
adicionó 5 ml de jabón líquido, se mezcló y se enfrió; colocando el vaso en un plato
plástico que contenía agua (H2O) con hielo y sal, evitándose que el agua salada
entrara en el vaso plástico.

En la primera parte experimental, luego de la preparación de la solución de extracción

se cortó en pequeños trozos medio cambur que se agregó a la licuadora con 100 ml de agua
(H2O). Luego se licuó la mezcla con pulsos de licuado (10 segundos cada uno), esperando
30 segundos entre cada pulso hasta que se obtuvo un licuado completo. Seguidamente se
tomaron 50 ml del licuado y se le agregaron los 120 ml de solución de extracción fría; se
licuó esta mezcla en 3 pulsos de 2 minutos, esperándose 30 segundos entre cada pulso; se
filtró sobre un tul y se recogió el filtrado en un vaso que se mantuvo en un baño de hielo. A
continuación se tomaron 3 ml del filtrado y se transfirió a otro vaso, se le agregó 3 ml de
alcohol absoluto (C2H5OH) frío y se observó la formación de una fase acuosa y una fase
orgánica, en medio un material gelatinoso y blanco (ADN) que se retiró con ayuda de
palillos de madera a un recipiente con etanol. (Fig.1)

Finalmente en la segunda parte experimental, en seguida de la preparación de la

solución de extracción se cortó una cebolla pequeña que se agregó a la licuadora con 100
ml de agua (H2O). Luego se licuó la mezcla con pulsos de licuado (10 segundos cada uno),
esperando 30 segundos entre cada pulso hasta que se obtuvo un licuado completo.
Seguidamente se tomaron 50 ml del licuado y se le agregaron los 120 ml de solución de
extracción fría; se licuó esta mezcla en 3 pulsos de 2 minutos, esperándose 30 segundos en
cada pulso; se filtró sobre un tul y se recogió en un vaso que se mantuvo en un baño de
hielo. A continuación se tomaron 3 ml del filtrado y se transfirió a otro vaso, se le agregó 3
ml de alcohol absoluto (C2H5OH) frío y se observó la formación de una base acuosa y una
fase orgánica, en medio un material gelatinoso y blanco (ADN) que se retiró con ayuda de
palillos de madera a un recipiente con etanol.
 Resultados y Discusiones

Figura 2. Aislamiento del ADN a partir de una muestra de Cambur

Al principio tenemos una mezcla semi líquida, luego parcialmente líquida; al

filtrarlo aumento su volumen. Luego de agregarle alcohol absoluto (C 2H5OH) poco a poco
apareció una capa de fibras de color blanco, que se situaron sobre la mezcla de cambur. Al
extraer el ADN forma un aspecto mojado, pequeño y pegajoso.

Podemos concluir que el ADN se encuentra en el interior del núcleo de las células
eucariotas rodeado de proteínas (histonas) que lo mantienen unido y compactado. Para
poder aislarlo y observarlo se deben deshacer la membrana plasmática y la envoltura
nuclear y también se precisa la desnaturalización de las proteínas. Al triturar el cambur en
la licuadora incrementan el área superficial del cambur, ayuda a hacer la superficie de la
membrana más fácil de disolver y también permite una absorción más efectiva del calor
Con el detergente las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos con
proteínas transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de
fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la
membrana se descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la
membrana junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan
de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y
eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente. El agua fría ayuda a
mantener el ADN intacto durante el proceso de extracción. El enfriamiento de la solución
ayuda a prevenir la desnaturalización que podría destruir el ADN si se expusiera al calor de
manera prolongada (protege el ADN de enzimas que pueden destruirlo como las DNAasas
ya que la refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas). La filtración permite separar
los restos de los tejidos del plátano y de las células que hemos roto en los pasos anteriores.
El líquido filtrado que conseguimos es el que contiene el ADN libre de la membrana
nuclear. El ADN es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja
temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado
justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El ADN es el único
componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace visible porque las
diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar debido a la acción de fuerzas
físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la capa del
extracto.

Figura 3. Aislamiento del ADN a partir de una muestra de Cebolla

Al principio, el líquido estaba verde claro, al añadirle los productos que había que
ponerle cambió a un verde más oscuro (efecto del lavavajillas). Más tarde, después de
dejarlo reposar, en el líquido se habían entrelazado un conjunto de tiras de ADN.

Podemos concluir que en la naturaleza, el ADN se localiza en el núcleo de las

células eucariotas en forma de desoxirribo nucleoproteína. El aislamiento del material
genético de la cebolla se consideró la destrucción de las interacciones entre las moléculas
que conforman la pared celular y nuclear. El detergente y la sal, ayudadas por la acción de
la licuadora son capaces de romper primero la pared celular, luego las membranas
plasmáticas y por último la pared nuclear (lugar donde está contenido el ADN). Y el
alcohol precipita el ADN que es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol frío
se desenrolla y se precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.

Post – Laboratorio

1. ¿Cómo está formado un nucleótido?

 Los nucleótidos están formados por la unión de:

a) Una pentosa, que puede ser la D-ribosa en el ARN; o la D-2- desoxirribosa en el

ADN.

b) Una base nitrogenada, que puede ser Púrica, como la Guanina (G) y la Adenina
(A) o Pirimidínica, como la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U).

C) Ácido fosfóricos, que en la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de
una unión fosfodiester. Esta unión se hace entre el C-3´de la pentosa, con el C-5´de la
segunda.

2. ¿Qué otras reacciones químicas sirven para cuantificar los ácidos nucleicos y
en que se basan?

a) Electroforesis de ácidos nucleicos: La aplicación de la electroforesis en la

separación de ácidos nucleicos permite hacer tareas simples, como verificar su
síntesis o integridad, y complejas, como seguir los pasos enzimáticos de
modificación durante la construcción de elaboradas colecciones de ADN. Su
fundamento químico reside en que los ácidos nucleicos son polímeros de carga
negativa unidos por enlaces covalentes fosfodiester. De esta manera, el ADN y el
ARN se moverán en un campo electroforético hacia el polo positivo.
b) Secuenciación: ADN, ARN y Proteínas forman el orden del flujo de la información
genética en todas las células y los tres son polímeros lineares. El objetivo de la
secuenciación es conocer exactamente el orden de sus monómeros. Del orden de los
nucleótidos en el ADN y ARN se puede inferir su evolución y su función (al menos
en teoría), lo mismo ocurre con los aminoácidos de las proteínas.
c) Clonación: La clonación de ADN fue posible gracias a la acumulación de
conocimiento básico sobre las enzimas de restricción (er). Las ER fueron
descubiertas en el estudio de los mecanismos bacterianos de defensa ante las
infecciones virales (Kelly y Smith, 1970). Las ERs cortan de forma precisa
secciones de ADN y hacen compatibles los extremos de los productos escindidos
con otras moléculas de ADN, como adaptadores, plásmidos, promotores y regiones
codificantes, a los que se unen en una reacción in vitro catalizada por la enzima
 ligasa. Estas nuevas construcciones de ADN formadas por moléculas de orígenes
genéticos distintos, se denominan quimeras. Las quimeras a su vez pueden ser
escindidas para ligarse a otro fragmento de ADN, en un proceso llamado
subclonación. Mediante programas de cómputo se puede simular la mejor estrategia
para obtener quimeras en el laboratorio (Invitrogen, 2008b). Las quimeras son útiles
para comprobar hipótesis sobre la función génica, así como para la producción en
masa de proteínas recombinantes (Goeddel et al., 1979, Chan et al., 2010).
d) Detección de biomoléculas por hibridación: Cuando los ácidos nucleicos o las
proteínas en solución interactúan con superficies sólidas pueden llegar a adsorberse
en ellas. Las superficies más utilizadas son las membranas de nitrocelulosa y de
nylon. Esta propiedad de interacción no ha sido clarificada del todo pero se plantea
la hipótesis de que reside en interacciones no covalentes como interacciones
hidrofóbicas o de cargas parciales entre las biomoléculas y la superficie (Dubitsky y
Perrault, 2012). En el caso de los ácidos nucleicos, estas interacciones se pueden
hacer covalentes con luz ultravioleta. Esta propiedad de interacción con fases
sólidas, en conjunto con la capacidad de los ácidos nucleicos de formar puentes de
hidrógeno con otras moléculas de ADN complementarias a su secuencia
(hibridación), se han utilizado para detectar y cuantificar su abundancia en extractos
celulares de las más variadas condiciones.
e) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La PCR es un método que permite la
amplificación o copiado masivo in vitro de un fragmento específico de ADN. La
longitud del fragmento copiado está indicada por dos secuencias pequeñas de ADN
(llamadas oligonucleótidos) que son adicionadas a la reacción y que flanquean al
fragmento que se desea amplificar. Estas secuencias pequeñas indican además el
sitio desde el cual debe iniciarse la reacción de amplificación. La reacción es
llevada a cabo por la ADN polimerasa.

3. ¿Por qué razón los ácidos nucleicos tienen su máximo pico de absorción a
260 nm?

Una característica del ADN es la de presentar un pico de absorción en presencia de

radiación a 260nm. Este pico de absorción se debe la presencia de las bases púricas y
pirimídicas. El ADN bicatenario presenta una absorción menor que el monocatenario,
debido a que el emparejamiento de las bases (por enlaces de puentes de hidrógeno) reduce
la absorción de la luz ultravioleta. Esta particularidad es aprovechable en la cuantificación
de ADN; sin embargo, así como encontramos ADN en la muestra, también se encuentran
contaminantes tales como proteínas o fenol residual que pueden incurrir en un falso
positivo. Es decir, la absorbancia a 260nm no es específica para ADN. La cuantificación
espectrofotométrica también permite estimar la cantidad de ARN presente en un extracto.
La absorbancia del ARN se puede analizar en términos de proporciones, lo que genera
información útil de pureza. Por ejemplo, si la proporción entre la absorbancia de ARN a
260nm y 280nm es menor a 1.75, el extracto contiene contaminantes de tipo proteínico, y si
la proporción entre la absorbancia a 260nm y 230nm es menor a 2.0, existe contaminación
por carbohidratos en el extracto.

4. ¿Cuál es el efecto del alcohol en el aislamiento de ácidos nucleicos?

El ADN es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja
temperatura hace que se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado
justo entre la capa con etanol líquido y la capa con el extracto. El ADN es el único
componente de la solución que no es soluble en el etanol, y se hace visible porque las
diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al precipitar debido a la acción de fuerzas
físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto y por eso flota sobre la capa del
extracto.

5. ¿Cuál es la estructura del ADN (primaria, secundaria, terciaria) que

visualizamos a través del vaso?

Estructura terciaria que se refiere a como se almacena el ADN en un volumen

reducido. Varía según se trate de organismos procariontes o eucariontes. En eucariontes el
empaquetamiento ha de ser más complejo y compacto y para esto necesita la presencia de
proteinas, como son las histonas y otras de naturaleza no histona (en los espermatozoides
las proteinas son las protaminas). A esta unión de ADN y proteinas se conoce como
cromatina, en la cual se distinguen diferentes niveles de organización: Nucleosoma, collar
de perlas, fibra cromatínica, bucles radiales, cromosoma. Los nucleótidos que forman al
DNA están constituido por el azúcar 2′-desoxirribosa unido mediante enlace éster a ácido
fosfórico y mediante enlace N-glucosídico a una de las cuatro bases nitrogenadas (adenina,
guanina, timina o citosina). Los nucleótidos del DNA forman una hélice constituida por dos
hebras antiparalelas que se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno. Para
empaquetarse, el DNA se une a nucleoproteínas, denominadas histonas; y cuando se
quieren separar estos componentes, se aplica tratamiento con ácidos o con concentraciones
altas de sales.

6. ¿Qué se hace para remover las proteínas asociadas al ADN, para poder
obtener ADN puro?

Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las

moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN. Para realizar una extracción pura
ocurrirá que el detergente contiene lauril sulfato de sodio, el cual limpia los trastes
removiendo grasas y proteínas. Éste actúa de la misma manera en el protocolo de
extracción de ADN, separando las grasas (lípidos) y las proteínas que constituyen las
membranas que rodean la célula y el núcleo. Una vez que estas membranas se han roto, el
ADN es liberado de la célula

7. Dibuje la estructura de la adenina y la timina e indique cómo se unen los

puentes hidrógeno entre las dos bases nitrogenadas.

La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de hidrógeno, mientras que
la citosina enlaza con la guanina, mediante tres puentes de hidrógeno.
 8. ¿Cuál es la utilidad de triturar los vegetales? ¿Podríamos obtener ADN sin
triturar los vegetales?

Mediante fricción con el mortero o por el licuado del material, se rompen las
uniones entre las células y la pared celular. Esta homogeneización facilita el efecto de lisis
o ruptura que ayuda a liberar el material genético. No ya que, aplastándolo o triturándolo se
muestra una ruptura total del tejido, es decir, se separan las células unas de otras. Es la
primera destrucción física de la muestra para aislar el ADN.

9. ¿Cuán largas fueron las fibras del ADN obtenido?

La cebolla tenía fibras delgaditas, como de 3cm de largo aproximadamente, en

cambio las del cambur eran más gruesas y menos largas como de 1,5 cm aproximadamente.

10. ¿Qué fue lo que quedó en la solución luego de sacar las fibras de ADN?

Nos queda el alcohol absoluto empleado para hacer la separación del ADN de las
fases acuosa y orgánica.
 Conclusiones

Para lograr extraer el material genético y observarlo fueron necesarios todos los
procedimientos anteriores, ya que el ADN se encuentra protegido por varias membranas en
las células vegetales del plátano, en el interior de su núcleo, y enrollado en proteínas
(histonas) que lo mantienen condensado.

La solución de lisis nos ayuda romper la membrana celular y acceder al núcleo, así
mismo obtener el ADN.

Al agregar el etanol a la muestra, queda dividida en dos fases: la acuosa la cual

queda en la parte de arriba, que es de donde se desprende el ADN, y en la parte de abajo
queda el etanol.

Mediante la oxidación-reducción podemos identificar partes de la estructura del

ADN como el grupo fosfato.

Referencias Bibliográficas
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8) Peña-Castro, J. M., Gregorio-Ramírez, O., & Barrera-Figueroa, B. E. (2013).

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explicación). Recuperado 09 de julio de 2021, de Todamateria.com sitio
web: https://www.todamateria.com/extraccion-adn-experimento/
 Anexos

Figura 1. Preparación de la muestra de cambur