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Trabajo práctico Nº 10: Separación de proteínas de la leche.

Identificación de aminoácidos.

Objetivo: Obtención de la caseína de la leche; identificación de aminoácidos


presentes en dicha proteína.

Introducción:

AMINOÁCIDOS

El término aminoácido define a cualquier molécula que contiene un grupo amino y


un grupo ácido; sin embargo, este término casi siempre se utiliza para designar a un α -
aminoácido.

Aminoácidos esenciales

Los seres humanos pueden sintetizar aproximadamente la mitad de los aminoácidos


que forman las proteínas, el resto de los aminoácidos, denominados aminoácidos
esenciales, han de ser ingeridos en la dieta.
A las proteínas que proporcionan todos los aminoácidos esenciales en la proporción
correcta para la nutrición humana se las denomina proteínas completas.

Propiedades de los aminoácidos

A pesar de que generalmente los aminoácidos se escriben con un grupo carboxílico


(-COOH) y un grupo amino (NH2), su estructura real es iónica y depende del Ph. El
grupo carboxílico pierde un protón, dando lugar a un ión carboxilato, y el grupo amino
se trotona y da lugar a un ion amonio. A esta estructura se la denomina ión bipolar o
zwiterión.

La naturaleza bipolar de los aminoácidos que estos tengan algunas propiedades


características:

- Los aminoácidos tienen puntos de fusión altos, generalmente superiores a


200ºC.
- Los aminoácidos son más solubles en agua que en éter, diclorometano y otros
disolventes orgánicos comunes.
- Los aminoácidos tienen momentos bipolares mucho más grandes que las
aminas o los ácidos por separados.
- Los aminoácidos son menos ácidos que la mayoría de los ácidos carboxílicos y
menos básicos que la mayoría de las aminas. De hecho, la parte ácida de una
molécula de aminoácido es el grupo –NH3+, no el grupo – COOH; la parte
básica es el grupo –COO– y no el grupo -NH2.

Como los aminoácidos tienen el grupo ácido (–NH3+) y básico (–COO –), son
anfóteros. La forma predominante del aminoácido depende del pH de la solución. En
una solución ácida, el grupo –COO– se trotona y se obtiene el grupo –COOH, y la
molécula tiene una carga total positiva. Si el pH aumenta, el grupo –COOH pierde su
protón aproximadamente a pH= 2. A este punto se lo denomina pKa1, primera constante
de disociación ácida. Si el pH sigue aumentando, el grupo –NH 3+ pierde su protón a un

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pH entre 9 y 10. A este punto se lo denomina pKa2, segunda constante de disociación
ácida. Por enzima de este pH, la molécula tiene una carga total negativa.

Puntos isoelectrónicos y electroforesis

Los aminoácidos presentan una carga positiva en medio ácido y carga negativa en
soluciones básicas. Hay un pH intermedio donde las dos formas del aminoácido se
encuentran en la misma proporción, como el zwiterión bipolar con una carga neta de
cero. A ese pH se lo denomina punto isoeléctrico o punto isoelectrónico.
La diferencia en los puntos isoeléctricos se puede utilizar para separar mezclas de
aminoácidos y purificarlos por electroforesis, ya que por lo general, la solubilidad
mínima se presenta en el punto isoeléctrico. También se pueden identificar
aminoácidos, ya que el punto isoeléctrico es característico para cada aminoácido.

Obtención de aminoácidos: Hidrólisis ácida

Muchos de los aminoácidos se obtienen todavía preferiblemente por hidrólisis


ácida o enzimática de las proteínas. Se evita la hidrólisis alcalina debido a que la
presencia de un hidrógeno sobre el átomo asimétrico de carbono adyacente al grupo
carbonílico de la amida permite una rápida racemización en presencia de bases. La
racemización no es tan rápida en soluciones ácidas pero le triptófano es destruido por
los ácidos debido a la presencia del núcleo pirrólico.

Reacción con Ninhidrina

La mayor parte de los ácidos α -amino carboxílicos cuando se tratan con una
solucióndiluída de Ninhidrina dan un producto de color azul púrpura. La pirolina,
hidroxiprolina y la asparagina dan soluciones amarillas a anaranjado-pardas. La
reacción se usa no solamente para localizar a los aminoácidos sobre las cromatografías
de papel, sino también para la estimación colorimétrica cuantitativa.

PROTEÍNAS

Clasificación de proteínas:

Las proteínas se agrupan en simples o conjugadas. Las proteínas simples son las
que cunado se hidrolizan sólo dan lugar a aminoácidos. Las proteínas conjugadas están
enlazadas a un grupo postético no proteico como un azúcar, un ácido nucleico, un lípido
o algún otro grupo.
Las proteínas se clasifican como fibrosas o globulares dependiendo de si forman
filamentos largos o se enrollan en si mismas. Las proteínas fibrosas son alargadas,
fuertes y generalmente insolubles en agua, y su función principal es formar las partes

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estructurales del organismo. Las proteínas globulares se encuentran enrolladas, con
formas prácticamente esféricas, y principalmente forman parte de las enzimas, las
hormonas o proteínas de transporte.

Desnaturalización de las proteínas

Con excepción de la estructura primaria que viene definida por una conectividad
covalente, todos los otros niveles estructurales (secundaria, terciaria y cuaternaria) se
mantienen por solvatación débil y por enlaces de hidrógeno o por interacciones de Van
der Walls. Pequeños cambios en el ambiente que rodean las proteínas pueden producir
un cambio conformacional o químico, originando desnaturalización, esto es, la
modificación de la estructura normal y pérdida de la actividad biológica. Hay muchos
factores que pueden producir la desnaturalización, pero los más comunes son el calor y
el pH.
Cunado se somete una proteína a un pH ácido, algunos de los grupos carboxilos de
las cadenas laterales se protonan y pierden su carga iónica, produciéndose cambios
conformacionales que dan lugar a la desnaturalización. En solución básica, los grupos
amino se desprotonan y, de forma similar, pierden su carga iónica, dando lugar también
a cambios conformacionales y a la desnaturalización.
Cuando el pH es ácido, las proteínas de la leche se desnaturalizan y precipitan. A
este proceso se lo denomina coagulación.
En muchos casos la desnaturalización es irreversible. Tal es el caso de la clara de
huevo: al calentarla coagula, pero si se enfría no recobra su estructura inicial. Sin
embargo, la desnaturalización puede ser reversible si a la proteína solo se la ha sometido
a una desnaturalización suave.

El enlace peptídico

Un aminoácido, como tiene un grupo amina y un grupo ácido, es muy apropiado


para formar uniones amida. En condiciones adecuadas, el grupo amino de una molécula
condensa con el grupo carbonilo de otra. El producto que se obtiene es una amida
denominada dipéptido, ya que está formada por dos aminoácidos. La unión amida entre
aminoácidos se denomina enlace peptídico.
Este enlace, al igual que el enlace amida, es muy estable, esto se debe a la fuerte
interacción por resonancia entre los electrones no enlazantes del nitrógeno y del grupo
carbonilo. El nitrógeno del grupo amida ya no es una base fuerte y el enlace C-N tiene
restringida la rotación debido a su carácter de doble enlace parcial.

Desarrollo:

REACTIVOS

Para la separación de la caseína de la leche se utiliza ácido acético; y, para su


posterior redisolución utiliza NaOH (medio básico) y NaCl (sustancia isotónica). La
obtención los aminoácidos presentes en la caseína se realiza con HCl.
En la determinación del contenido proteico, después de la coagulación y luego de
la hidrólisis, se utiliza el reactivo de Biuret (CuSO4, tetrato de sodio y potasio, NaOH,
Ioduro de Potasio, agua destilada).
Para la cromatografía en placa delgada se utilizan como solvente de corrida n-
butanol, ácido acético y agua; como revelador se utiliza Ninhidrina y piridina en etanol.

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PLAN DE TRABAJO

En la extracción de la caseína de la leche primero se procede a dilución leche


descremada en agua; luego, a la coagulación de la proteína, que se realiza con Ácido
Acético y calentamiento (40-42ºC). El coagulo se debe separar del resto de la solución
por centrifugación y se descarta el sobrenadante.
Para obtener nuevamente una solución, se realiza la redisolución de la caseína
con NaCl y NaOH. Después de esto se somete a la solución obtenida a la primera
prueba del contenido proteico de la solución, por medio de la reacción de Biuret.
Luego se procede a la separación de aminoácidos de la proteína mediante una
hidrólisis ácida (HCl 6 N); esto ocurre en un tubo de combustión con tapón perforado
haciendo vacío, y luego se la coloca en estufa a 120ºC durante 24 horas. Después de
este proceso se realiza la segunda prueba con el reactivo de Biuret para comprobar la
finalización de la hidrólisis.
Para determinar la composición en aminoácidos de la proteína estudiada, se
realiza una cromatografía en placa delgada con n-butanol, ácido acético y agua como
solvente de corrida, sembrando como patrones los aminoácidos que es posible encontrar
en la caseína. El revelado se realiza con Ninhidrina y piridina en etanol.

METODOLOGÍA

En la extracción de la leche se utiliza leche descremada, de lo contrario hay que


separarla de la grasa por solvente, en un paso previo a la extracción de la proteína.
Debido a que la caseína no precipita por acción del calor, se la separa de la leche
haciéndola coagular con un ácido débil como lo es el Ácido Acético al 10% a
temperaturas de entre 40 y 42ºC, en este paso se produce la desnaturalización de la
proteína. Es muy importante realizar la coagulación con un ácido débil y en baja
concentración a temperaturas no tan elevadas para no afectar el enlace peptídico. Con
un ácido débil, la proteína solo pierde solubilidad, y la desnaturalización es reversible
con la utilización de una base.
Una vez realizada la coagulación de la caseína, ésta queda suspendida en la
solución, para separarla mas rápidamente de ésta, se realiza la centrifugación.
Luego, se redisuelve el coagulo de la caseína en NaOH, ya que tiene la propiedad
de disolverse en bases; también utiliza NaCl, que es una sustancia isotónica por lo que
no afecta la composición de la caseína, tiene la misma densidad que ésta y se la utiliza
para aumentar el volumen de la solución.
Con la proteína ya disuelta, se procede a la primera prueba con el reactivo de
Biuret; este ensayo se realiza para comprobar la presencia de proteínas en solución, ya
que el ión cúprico en solución alcalina y en presencia de enlaces peptídicos, forma un
compuesto cúpricos de quelación de color azul oscuro. Puede utilizarse para la
estimación colorimétrica, ya que la intensidad del color que toma la solución es
proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes en ella.
Para obtener los aminoácidos se realiza una hidrólisis ácida, debido a que la
recemización en medio ácido es mucho mas lenta que en medio básico. Se realiza en
condiciones drásticas (ácido fuerte y concentrado, vacío y altas temperaturas por un
tiempo prolongado) debido a que el enlace peptídico es muy fuerte y difícil de romper.
Para comprobar la finalización de la hidrólisis se realiza la ensayo con el reactivo de
Biuret, que debe dar negativo, ya que si la hidrólisis fue completa, no debe quedar
ningún enlace peptídico en la solución.

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Por último se realiza una cromatografía en placa delgada (papel), sembrando las
siguientes proteínas como patrones: Triptófano, Fenilalanina, Alanina y Glicina. Para el
revelado reutiliza la Ninhidrina que otorga diferentes coloraciones dependiendo de que
aminoácido se trate. Por comparación de colores y alturas (que dependen de la polaridad
de la molécula de aminoácido) de la muestra con los patrones se puede estimar que
aminoácidos estaban presentes en la caseína.

RESULTADOS

Ensayos con el reactivo de Biuret:

Ensayo 1: Ensayo testigo, sólo el reactivo. El color es turquesa característico del


reactivo.

Ensayo 2: El reactivo con diferentes aminoácidos. Con todos los aminoácidos el


color se mantiene turquesa indicando que el ensayo es negativo.

Ensayo 3: El reactivo con la leche. A pesar de la coloración de la leche se puede


observar claramente que el color ya no es turquesa sino es un azul violáceo mas intenso,
esto indica que el ensayo es positivo.

Ensayo 4: El reactivo con el hidrolizado. El color es turquesa por lo que es


negativo, indica la ausencia de uniones peptídicas, por lo tanto, ausencia de proteínas

Cromatografía:

Comparando las corridas y color de revelado de las muestras de caseína


hidrolizada con los patrones sembrados (Fenilalanina, Triptófano, Glicina y Alanina), se
observó que sólo la Fenilalanina y Triptófano si coincidan en Rf y color con la muestra
de aminoácidos, pero los resultados no son del todo claros. La Glicina y Alanina no
coincidieron en altura ni color con ninguna de las manchas observadas en la muestra
sembrada.

Conclusión:

Se puede concluir que en la coagulación la desnaturalización fue reversible, ya que


al redisolverla y realizar el ensayo de Biuret, éste dio positivo, lo que indica que los
enlaces peptídicos no fueron afectados.
En cuanto a la hidrólisis, ésta se realizó satisfactoriamente y fue completa, ya que
nuevamente, se comprobó con la reacción de Biuret negativa que no quedaban enlaces
peptídicos presentes en la solución, lo que indica que no hay proteínas en dicha
solución.
En cuanto a la cromatografía se puede decir que es probable la existencia de
Fenilalanina y Triptófano en la caseína debido a que las corridas y los colores de
revelado coincidieron con las de algunos de los aminoácidos de la muestra de la caseína
hidrolizada, pero no se puede afirmar ya que el resultado no es muy claro. Si se puede
afirmar que la Glicina y Alanina no se encontraban presentes en la caseína ya que ni los
colores ni las corridas de las mismas coincidían con las de los aminoácidos de las
muestras.

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Bibliografía:

- L.G. WADE, JR.; “Química Orgánica” Quinta Edición; Ed. Pearson Prentice Hall;
Pág. 1114-1155; 2000.
- BREWSTED, R.: VANDERWERF, C.; Mc EWEN. W.; “Curso práctico de
Química Orgánica”; Editorial Alhambra; Pág. 149-152; 1979.
- NOLLER, C. R.; “Química de los compuestos orgánicos”; Editorial
Ineramericana; Madrid; Pág. 558-585; 1968.

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