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Nutricin, Aislamiento, Preservacin e Identificacin

Sierra Hernndez Karen Susana

Microbiologa Vespertino

Francisco Alejo Iturbide

Irapuato, Gto., 04 de Febrero de 2013

NUTRICIN MICROBIANA
Los requerimientos nutricionales de un microorganismo estn determinados por la composicin qumica de la clula, su constitucin gentica y por factores del medio ambiente. Cualquier sustrato puede constituir una fuente de nutrientes para ciertos microorganismos. Sin embargo, cada grupo de organismos vara ampliamente en sus caractersticas genticas y en sus propiedades fisiolgicas y en su capacidad para utilizar y transformar los diferentes compuestos qumicos. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo con: a) la fuente C, N, S, P y O que utilicen, y b) segn la fuente de energa [1].

Los macronutrientes son compuestos requeridos por las bacterias en cantidades significativas y los micronutrientes (elementos traza) en cantidades muy pequeas. Estos penetran en las clulas por difusin facilitada por protenas transportadoras, sin consumo de energa y mediante reacciones de membrana con consumo energtico.

Macronutrientes bsicos El nitrgeno forma parte de los aminocidos, cidos nucleicos y peptidoglicanos. Las bacterias obtienen este elemento del amonio o los nitratos. El fosforo es necesario para la sntesis de los cidos nucleicos y de los fosfolpidos. La mayor parte de este elemento se encuentra en la naturaleza como fosfato inorgnico, siendo asimilado de esta forma. El azufre forma parte de la composicin de los aminocidos cistena y metionina y de numerosas vitaminas, es obtenido a partir de fuentes inorgnicas como sulfato y fosfato. El potasio es activador especfico de varias enzimas, incluyendo las que participan para la sntesis de protenas. El hierro forma, asimismo, parte de la composicin de enzimas implicadas en las cadenas de oxidoreduccin del ciclo respiratorio celular y otras molculas. El agua es componente esencial del desarrollo del ciclo bacteriano, representando el 80-90% de su peso. [2]

Micronutrientes. Oligoelementos El cobalto es necesario para la sntesis de vitamina B12, pudiendo sustituirse por la adicin de pequeas cantidades de la misma a los medios de cultivo. El cobre est presente en algunas enzimas respiratorias como fijador del O2 igual que el hierro. El manganeso acta como activador de determinadas enzimas. El nquel, tungsteno y selenio son requeridos por grupos muy reducidos de bacterias. [2]
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Las bacterias pueden ser categorizadas segn la fuente de carbono que utilicen (es decir, si se trata de carbono orgnico o inorgnico), y segn de donde obtengan la energa necesaria para llevar a cabo las distintas reacciones propias del metabolismo. [3]

Segn la fuente de carbono, las bacterias son auttrofas o littrofas, mientras que otro grupo se encuadra en las hetertrofas u organtrofas. Las primeras utilizan dixido de carbono y las segundas requieren una fuente de carbono orgnica. [3]

De acuerdo con el origen de la energa que emplean las bacterias, son fottrofas cuando captan la luz o la energa radiante y quimitrofas cuando son incapaces de aprovechar esta fuente y obtienen la energa a partir de reacciones qumicas. [3]

Fotohetertrofos. Utilizan energa lumnica pero incorporan carbono en forma de compuestos orgnicos, como alcoholes, cidos grasos, cidos orgnicos e hidratos de carbono.

Quimioauttrofos. Obtienen la energa que necesitan de las reacciones qumicas, pero incorporan carbono a partir del dixido de carbono. Quimiohetertrofos. Obtienen energa por medio de reacciones qumicas, el carbono provienen de compuestos orgnicos (glucosa, lpidos, protenas). La fuente de energa y carbono es la misma. [3]

De acuerdo a los requerimientos de oxgeno, los microorganismos se clasifican en: Aerobios: necesitan de la presencia de oxigeno libre. Facultativos: prefieren un ambiente con oxgeno, pero pueden vivir sin l. Anxicos: en ausencia de oxgeno disuelto emplean el oxgeno combinado. Anaerobios: solo viven en ausencia de oxgeno.

De acuerdo con la temperatura de desarrollo ptimo se clasifican en: Sicroflicos: Viven en 0 Promedio mesoflicos: los ms comunes viven entre 15 y 40 C Termoflicos: se desarrollan entre 50 y 70 C
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Segn el pH, se pueden clasificar tambin los microorganismos en: Basfilos: necesitan un pH elevado para poder vivir (7,5 a 11,5) Neutrfilos: requieren un pH neutro, alrededor de 7. Acidfilos: requieren un pH bajo (1-4).[4]

Existe otra clasificacin en cuanto a la presin osmtica: Osmfilos: necesitan una elevada presin osmtica para poder desarrollarse. Suelen ser microorganismos de vida libre, cercanos a las salinas, por ejemplo.[4]

AISLAMIENTO MICROBIANO
Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podran ser tiles al hombre, mientras que otros podran ser patgenos. La separacin de cada una de estas variedades es lo que se conoce como el aislamiento de microorganismos. [5]

Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar diferentes especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios complementarios. Los sustratos energticos y la materia orgnica sinttica, pueden suministrarse por sustancias nutritivas contenidas en la maceracin de carne y vsceras. Los aminocidos y pptidos los aportan las peptonas, que contienen todos los productos de degradacin de las protenas, sin vitaminas y su composicin exacta vara segn el tipo de sustrato y enzima utilizados, como pepsina, tripsina, papana, entre otras. Los factores de crecimiento se suministran por maceracin y adicin de sangre, suero, extracto de levaduras, liquido asctico, etc. [6]

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5 Los medios de cultivo pueden clasificarse segn su consistencia, origen, composicin y utilizacin.

Consistencia Lquidos. Contienen los nutrientes antes citados, a los cuales se les adiciona una sustancia capaz de mantener un pH adecuado. Ejemplos: caldo nutritivo y caldo peptona. Slidos. Se obtienen agregando agar (sustancia polisacrida e inerte obtenida de algas marinas del gnero Gellidium) a un medio lquido determinado. Ya esterilizado se vierte en una caja de Petri o un tubo de ensayo. Estos medios ofrecen la posibilidad de obtener colonias aisladas unas de otras. Semislidos. Son semejantes a los medios slidos, con la diferencia que a estos de les disminuye la concentracin del agar. Se utilizan para la conservacin de cepas bacterianas y observacin y registro de bacterias mviles.[6] Origen Medios sintticos. Compuestos por productos qumicos conocidos y se usan para estudios metablicos. Ejemplos: agar nutritivo, agar blando, caldo nutritivo, etc. Medios naturales. Son aquellos preparados a partir de sustancias naturales animales o vegetales de composicin no rigurosamente constante. Ejemplo: el suero, leche, papa, etc.[6] Composicin y utilizacin Medios simples. Poseen los requisitos nutricionales mnimos para permitir el desarrollo bacteriano en general. Ejemplo: agar nutritivo, caldo nutritivo, etc. Medios enriquecidos. Son medios simples a los que se aaden ciertos componentes como sangre, suero, huevo, glucosa, entre otros, que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores del crecimiento en bacterias exigentes nutricionalmente. Ejemplo: agar sangre, enriquecido con sangre. Medios selectivos. Se consiguen aadiendo al agar nutritivo, compuestos qumicos nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa o tambin alterando las condiciones fsicas del medio. Por ejemplo el cristal violeta, impide el crecimiento de bacterias Gram positivas sin afectar las Gram negativas.

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6 Medios diferenciales. A estos se les adicionan sustancias para que solo crezcan determinadas bacterias y as se puedan diferencias de otras especies diferentes. Medios de enriquecimiento. Lquidos que favorecen la multiplicacin de bacterias cuando la muestra obtenida es muy pobre. Ejemplo: el caldo de Thioglicolato favorece el crecimiento de bacterias anaerobias. Medios de recuento. Sirven para determinar el contenido bacteriano de sustancias como leche, agua, carnes. Ejemplo: el agar cuenta grmenes sirve para determinar el nmero total de bacterias que existen en una muestra. Medios de transporte. Se utilizan para asegurar la viabilidad de las bacterias y evitar que se reproduzcan alterando el nmero de bacterias iniciales, desde el momento de la toma de la muestra hasta su posterior siembra en el laboratorio. No presentan nitrgeno que es un elemento indispensable para la divisin celular. Ejemplo: medio de Stuart.[6]

Cultivos puros y mixtos En ciertos procesos bioqumicos es imprescindible que se encuentre un solo tipo de microorganismo, mientras que en otros, es necesaria la presencia de un conglomerado de ellos para alcanzar los objetivos esperados. Por lo tanto, las caractersticas especficas de cada proceso van a definir la conveniencia de utilizar un cultivo puro o uno mixto. [5]

Un cultivo puro es aquella poblacin de microorganismos de un mismo tipo que, generalmente, se producen a partir de una sola clula. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae para producir cerveza es un ejemplo tpico de un cultivo puro. En contraste, un cultivo mixto est compuesto por varios microorganismos, cuya presencia en conjunto cumple una determinada funcin. Las poblaciones de microorganismos utilizados para el tratamiento de desechos lquidos (aguas residuales) representan un caso comn de la utilizacin de cultivos mixtos. [5]

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PRESERVACION MICROBIANA
La preservacin de los microorganismos consiste en la conservacin de ellos y de sus caractersticas por largos periodos. A travs de los aos, se han desarrollado varios mtodos de conservacin de microorganismos, que se basan en la reduccin de su actividad metablica [7]. La seleccin del mtodo de conservacin depende de varios factores, entre los que se pueden mencionar:

La susceptibilidad del microorganismo al proceso de conservacin. La facilidad con la que puedan ocurrir cambios genticos en la cepa. El nmero de muestras por conservar El costo del proceso de conservacin El periodo durante el cual se desea conservar el microorganismo El tipo de equipo disponible La probabilidad de contaminacin que exista en el medio. [7]

En muchos pases, hay entidades que tienen colecciones de cultivos y se dedican al mantenimiento de los microorganismos, los cuales brindan garanta de sus caractersticas. Muchas de estas colecciones son reconocidas internacionalmente; por medio de ellas, se puede adquirir la mayora de los microorganismos existentes. En la figura 1, se indican algunas de estas instituciones. Cuando se adquiere un microorganismo de una coleccin, viene identificado con las abreviaturas de la coleccin de la que proviene; por ejemplo, el microorganismo Phanerochaete chrysosporium CDBB H-298 pertenece a la coleccin de cultivos del Departamento de Biotecnologa y Bioingeniera del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) del Instituto Politcnico Nacional, adems, est identificado dentro de la coleccin como la cepa H-298. [7]

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NOMBRE

ALGUNAS COLECCIONES MICROBIANAS EN EL MUNDO PAIS MICROORGANISMO Bacterias, actinomicetos, hongos, algas, protozoarios Hongos, bacterias

American Type Culture USA Collection (ATCC) Coleccin de Cultivos del Mxico Departamento de Biotecnologa y Bioingeniera del CINVESTAV (CDBB) National Collection of Escocia Industrial Bacteria (NCIB) Instituto Pasteur Francia Fig. 1. Algunas colecciones microbianas en el mundo. [7]

Bacterias Bacterias

Existen varios mtodos para la conservacin de los microorganismos; todos buscan que las clulas sufran el dao mnimo y se preserven por el mximo periodo posible. [7] 1. Liofilizacin. Es una forma de secado en frio que sirve para conservar sin dao los diversos materiales biolgicos. El producto deshidratado se conserva a temperatura tambin, manteniendo todas sus propiedades al rehidratarse. Algunos

microorganismos son muy sensibles a esta tcnica por que los niveles de supervivencia disminuyen significativamente despus de ser sometidos a este proceso, e incluso su mantenimiento prolongado hace que la viabilidad celular disminuya an ms. Se conoce que algunos factores pueden afectar la viabilidad de los microorganismos liofilizados, entre los que se citan la naturaleza de la cepa, las condiciones de cultivo, la fase de crecimiento, la concentracin celular, la formulacin de los medios protectores contra la liofilizacin, los parmetros de la liofilizacin y el modo de rehidratacin.[8]

2. Congelado. Con frecuencia se usan temperaturas bajo el punto de congelacin para almacenamientos por periodos largos. Sin embargo, hay que tomar en cuenta que a temperaturas muy bajas se pueden formar cristales de hielo que pueden provocar la destruccin de los microorganismos. Cuando se lleva a cabo una congelacin rpida, entre un 60 y 80% de los microorganismos son destruidos. La respuesta de los microorganismos a la congelacin son variables, unos resisten, pero son susceptibles a sufrir lesiones durante el almacenamiento a congelacin, o durante la descongelacin. Otros son sensibles y finalmente otros se ven inactivados por la congelacin. La desnaturalizacin de las protenas es la principal causa de dao en los
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9 microorganismos. Los rangos de temperatura que son usados para el congelamiento a largo tiempo varan desde los -20C hasta las -70C.[8]

3. Temperatura ambiente. Algunos virus son capaces de sobrevivir por horas, das o incluso meses bajo condiciones ambientales, mientras que otros se inactivan en pocos minutos bajo las mismas condiciones. Periodos de almacenamiento a altas temperaturas pueden provocar disminucin en el periodo de incubacin de los granulovirus. El conocimiento de la interaccin entre los efectos de la temperatura con relacin a la actividad biolgica y replicacin de los virus en su hospedero permiten establecer parmetros de temperatura para la produccin masal de los mismos.[8]

IDENTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Un esquema de clasificacin proporciona una lista de caractersticas y un mtodo de comparacin para ayudar a la identificacin de un organismo. Una vez identificado el organismo puede ubicarse en un esquema de clasificacin concebido con anterioridad. Los microorganismos se identifican con fines prcticos, por ejemplo, para determinar un tratamiento adecuado para una infeccin. No siempre se los identifica con las mismas tcnicas con las que se los clasifica. Casi todos los procedimientos de identificacin se realizan con facilidad en un laboratorio y utilizan la menor cantidad posible de procedimientos o pruebas. Por lo general los protozoos, los gusanos y los hongos pueden identificarse por microscopia. El Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey, las bacterias no se clasifican segn su relacin evolutiva, sino que se proporcionan esquemas de identificacin basados en criterios como la composicin de la pared celular, morfologa, tincin diferencia., requerimientos de oxgeno y pruebas bioqumicas.

Caractersticas morfolgicas Durante 200 aos, las caractersticas morfolgicas han ayudado a los taxonomistas a clasificar a los organismos. Sin embargo muchos organismos son demasiado semejantes para ser clasificados segn sus estructuras. [9]

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10 Para toda identificacin bacteriana es importante destacar las caractersticas claves de una colonia bacteriana. Los criterios utilizados con frecuencia para caracterizar el crecimiento bacteriano son: Tamao de la colonia (calculado en milmetros o descrito en trminos relativos como cabeza de alfiler, pequeo, medio, grande) Pigmentacin de la colonia Forma de la colonia (incluye forma, elevacin y bordes de la colonia) Aspecto de la superficie de la colonia (por ejemplo, brillante, opaca, mate, transparente) Cambios en los medios con agar como resultado del crecimiento bacteriano Olor. Ciertas bacterias producen olores caractersticos que ayudan a su identificacin. [9] El aislamiento de colonias individuales durante los cultivos no solo es importante para examinar la morfologa y las caractersticas sino que tambin es necesario para la realizacin oportuna de la tincin Gram y los subcultivos. [10] Para evitar confusiones se tien los microorganismos provenientes de cada colonia. En muchos casos debe teirse cada colonia que presenta una morfologa diferente en la placa primaria. [10] La identificacin de un aislamiento bacteriano requiere el anlisis de la informacin obtenida por las pruebas de laboratorio que describen los perfiles caractersticos de las bacterias. Las pruebas y el orden en el que se las utiliza para la identificacin del microorganismo a menudo se denominan esquemas de identificacin. Estos se basan en 1) caractersticas genotpicas de las bacterias y 2) caractersticas fenotpicas. [10]

Pruebas bioqumicas Las actividades enzimticas son ampliamente utilizadas para diferenciar a las bacterias. Incluso las bacterias estrechamente relacionadas pueden ser separadas con especies diferentes mediante el empleo de pruebas bioqumicas, por ejemplo para determinar su capacidad de fermentar un conjunto de hidratos de carbono seleccionados. Adems las pruebas bioqumicas pueden proporcionar datos. [9]

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] Olivas Evangelina; Luis Roberto Alarcn. Manual de prcticas de microbiologa bsica y microbiologa de alimentos. Pg. 23 [2]Garca- Rodrguez; Picazo. Compendio de microbiologa mdica. Pgs. 31 y 32. http://books.google.com.mx/books?id=OykG04ClBUC&lpg=PA23&dq=nutricion%20microbian a&hl=es&pg=PP1#v=onepage&q&f=false

http://books.google.com.mx/books?id=OaSu2eow g_wC&lpg=PA31&dq=macronutrientes%20y%20mi cronutrientes%20microbiologia&hl=es&pg=PA32#v =onepage&q=macronutrientes%20y%20micronutri entes%20microbiologia&f=false http://books.google.com.mx/books?id=GxmuivjZBgC&lpg=PA46&dq=fuente%20de%20carbono% 20microorganismos&hl=es&pg=PP1#v=onepage&q =fuente%20de%20carbono%20microorganismos&f =false http://books.google.com.mx/books?id=WB3lngLAY jAC&lpg=PA52&dq=fuente%20de%20ph%20microo rganismos%20clasificacion&hl=es&pg=PA52#v=one page&q=fuente%20de%20ph%20microorganismos %20clasificacion&f=false http://books.google.com.mx/books?id=KFq4oEQQj dEC&lpg=PA16&dq=aislamiento%20de%20microor ganismos&hl=es&pg=PA16#v=onepage&q=aislami ento%20de%20microorganismos&f=false

[3]Negroni. Microbiologa estomatolgica. Fundamentos y gua prctica. 2 edicin. Pg. 46

[4]Manual del tcnico superior de laboratorio de anlisis clnicos. Pgs. 51 y 52.

[5] Hernndez Alicia. Microbiologa Industrial Pg. 16

[6]Montoya Villafae Hugo Humberto. Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines. Pgs. 73, 74 y 75

http://books.google.com.mx/books?id=5RjS6B0X5 RgC&lpg=PA73&dq=clasificacion%20de%20medios %20de%20cultivo&hl=es&pg=PA73#v=onepage&q =clasificacion%20de%20medios%20de%20cultivo& f=false http://books.google.com.mx/books?id=KFq4oEQQj dEC&lpg=PA18&dq=preservacion%20microbiana& hl=es&pg=PA18#v=onepage&q=preservacion%20m icrobiana&f=false

[7] Hernndez Alicia. Microbiologa Industrial. Pgs. 18 y 19

[8]Herrera Andino M. E. (2007) Evaluacin de mtodos de multiplicacin, obtencin y almacenamiento de dos cepas de virus entomopatgenos de Tecia solanivora. Tesis presentada como

http://books.google.com.mx/books?id=2YQzAQAA MAAJ&lpg=PA13&dq=preservacion%20de%20cepa s&hl=es&pg=PA13#v=onepage&q=preservacion%2 0de%20cepas&f=false

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12 requisito parcial para obtener el ttulo de Ingeniero Agrnomo. Facultad de Recursos Naturales. Escuela Superior Politcnica de Chimborazo. Riobamba, Ecuador. Pgs. 13 y 14 [9]Tortora; Funke; Case. Introduccin a la Microbiologa. 9 Edicin. Pgs. 293, 294 y 295 http://books.google.com.mx/books?id=Nxb3iETuw pIC&lpg=PA292&dq=identificacion%20de%20micro organismos&hl=es&pg=PA292#v=onepage&q=iden tificacion%20de%20microorganismos&f=false

[10]Forbes; Sahm; Weissfeld. Diagnostico Microbiolgico. 12 Edicin. Pgs. 103-108

http://books.google.com.mx/books?id=239cauKqS t0C&pg=PA106&dq=identificacion+de+microorgani smos&hl=es&sa=X&ei=JmQQUeq6NLWyQH124Ew&ved=0CDwQ6AEwAg

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