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PRÁCTICA 3.
MICROSCOPIA Y SU UTILIZACIÓN EN EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA. EL
ESTEREOSCOPIO COMO HERRAMIENTA DEL ANÁLISIS BIOLÓGICO
PROPÓSITO
Al finalizar esta sesión el estudiante debe estar en capacidad de reconocer las diferentes partes del
microscopio compuesto binocular y del estereoscopio y sus respectivas funciones, conocer las
diferencias entre microscopio compuesto y estereoscopio y tendrá la destreza en la preparación y
observación de muestras para uso de estos equipos.
MARCO TEÓRICO
EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento óptico que produce una imagen aumentada de los objetos. En los
últimos tres siglos ha permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido
en el instrumento básico para establecer nuevas fronteras en la biología. La lupa es el microscopio
más simple y fue utilizada inicialmente por algunos investigadores para adquirir los primeros
conocimientos del mundo microscópico; posteriormente se perfecciono y en la actualidad hay varios
tipos de microscopios, algunos de ellos altamente específicos, para una gran variedad de usos, tales
como: microscopio simple, compuesto (invertido, de fluorescencia, de luz ultravioleta, de luz
polarizada, de contraste de fase, de campo oscuro) y electrónico (de transmisión y de barrido).
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Figura 2. Trayectoria de la luz a través del microscopio compuesto (Tomado de Brock Biología de
los microorganismos)
La mayoría de los microscopios compuestos tienen los mismos componentes básicos. Sin embargo,
la disposición de muchos de esos componentes varía según el modelo y la marca, mientras que otras
piezas son opcionales.
Base: parte inferior del microscopio, que hace contacto con la mesa. Es su punto de apoyo.
Columna (brazo): estructura rígida ubicada en la parte posterior del microscopio, que sostiene sus
diferentes partes. Hay un interruptor para prender y apagar el bombillo y una perilla reguladora del
voltaje, con una escala entre 1 y 5. Para prolongar la vida útil del bombillo, se recomienda no pasar
del punto 4 el voltaje de este sistema (reóstato)
Perilla macrométrica: está en la parte lateral inferior, tanto derecha como izquierda, de la columna
y se utiliza para acercar la platina al objetivo y para alejarla. Por medio de estos movimientos se
obtiene una imagen poco nítida de la muestra, o sea el “enfoque grueso”.
Perilla micrométrica: está unida a la macrométrica, en la parte externa de ésta. Sirve para obtener
el “enfoque fino” o nítido de la imagen mediante movimientos suaves de acercamiento o alejamiento
de la platina.
Palanca de freno del enfoque grueso: está ubicada hacia el interior, en la parte izquierda del sistema
de perillas macrométrica y micrométrica. Cuando la palanca se mueve hacia abajo, la perilla
macrométrica puede subir la platina únicamente hasta un punto determinado (pre enfoque), y el
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enfoque se hace entonces utilizando solo la perilla micrométrica. De esta manera, se protegen las
lentes de 40X y de 100X y la muestra, ya que quedan demasiado cerca durante el proceso de enfoque.
(Atención: el punto de pre enfoque está previamente calibrado por el profesor. Por tanto, no se debe
liberar la palanca correspondiente)
Platina: lamina cuadrada, con un orificio central, en donde se coloca la muestra que se va a observar.
Carro: sistema de pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la muestra en el eje
X (o sea, izquierda-derecha) y en el eje Y (o sea, adelante-atrás), mediante las perillas que para tal
efecto posee éste.
Diafragma (iris): estructura con apariencia laminar que se emplea para regular el cono de luz que
pasa a través del condensador de abertura y llega a la muestra. El numero en la escala de abertura del
diafragma, que regula el cono de luz, debe coincidir con la abertura numérica del objetivo. Este ajuste
se hace con la palanca que tiene el diafragma para abrirlo y cerrarlo.
Condensadores: hoy dos: uno de ellos, el de abertura, está debajo de la platina y es un sistema de
lentes convergentes cuya función es concentrar los rayos de luz en el centro de la platina. Por tanto,
sirve para enfocarlos hacia la muestra que se va a examinar. El otro es el de campo, que está en la
base del microscopio y se utiliza para concentrar la luz que viene de la fuente y para dirigirla hacia el
condensador de abertura.
Objetivos: son sistemas de lentes que producen imágenes de la muestra, aumentadas 4, 10, 40 y 100
veces según se indique en los mismos. Al mover en forma circular el revólver, se puede poner
cualquier objetivo en posición perpendicular a la platina. Al hacerlo, se nota un tope indicativo de la
posición correcta de la lente.
Normalmente, los objetivos tienen información inscrita sobre diversas características propias de cada
uno de ellos.
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A: significa que estos objetivos son acromáticos, es decir, que vienen corregidos para ciertas
longitudes de onda (de los colores verde y rojo en este caso), con el fin de que coincidan en el mismo
plano y que, de este modo, la imagen obtenida tenga mejor definición. Algunas lentes, de otros
microscopios, vienen corregidas para más de dos longitudes de onda
Apertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que pasa
a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La apertura numérica es directamente
proporcional al índice de refracción del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de
inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el cono de luz, lo cual
origina un mayor poder de resolución.
Aumento: cada objetivo tiene un número específico (4, 10, 40, 100) que indica cuantas veces se
aumenta la imagen del objeto observado. En microscopia se utiliza la letra X para indicar “veces”
y por eso se acostumbra, al referirse a un aumento particular, escribir o decir 4X, 10X, etc.
Oculares: son sistemas de lentes cuya función es aumentar la imagen procedente del objetivo tantas
veces como indique el numero escrito en ellos, 10 en este caso. Los dos oculares pueden moverse
hacia los lados y hacia el centro, de manera que se ajusten a la distancia interpupilar de quien esté
utilizando el microscopio. Algunos microscopios poseen una sola lente ocular, y por eso se les llama
monoculares.
De igual manera que en los objetivos, en los oculares también hay algunas indicaciones. En los
microscopios de este laboratorio, por ejemplo, ambos oculares tienen inscrito lo siguiente: 10X/18L.
La cifra de la izquierda (10X) indica el número de veces que cada ocular aumenta la imagen
procedente del objetivo; y la de la derecha (18L) es el llamado número de campo, que sirve para
calcular el tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando.
Este número de campo puede variar según el microscopio de que se trate y normalmente esta entre
12 y 36.
Anillo de dioptrías: en este microscopio está en el ocular izquierdo y sirve para ajustar la visión
binocular.
a. Cuando transporte el microscopio cójalo siempre con las dos manos, como se indica en la figura
3.
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EL ESTEREOSCOPIO
Parte Mecánica
El pie o base: constituye la estructura sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general
forma de Y o bien es rectangular el tubo.
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La columna o brazo: pieza colocada en la parte posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción
superior y por el extremo inferior se adapta al pie.
La platina: pieza de vidrio en la que se coloca la preparación u objeto que se va observar. Presenta
un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso delos rayos luminosos a la preparación.
Cuya función es de sostener la muestra permite que llegue la luz colocándola en la posición correcta
para la visualización de la muestra. En el microscopio estereoscopio de la marca CARL ZEISS se
resalta que la platina es de doble color (blanco y negro) y es removible. Por consiguiente se debe
utilizar de la siguiente manera, si la muestra es de color claro la platina debe ser de color contrario es
decir negra, y si la muestra es de color oscura la platina debe ser clara.
Ganchos de la platina: permiten sujetar la muestra para lograr una mejor visualización de la misma
e impide que esta se mueva de su lugar.
Parte Óptica
Oculares: Esta constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto y su función
es aumentar la imagen formada por el objetivo.
Fuente de luz: dirige los rayos luminosos hacia el condensador, tiene una lámpara halógena de
intensidad graduable
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Manejo y Enfoque
En forma sistemática se debe seguir el siguiente modelo para un adecuado manejo y la técnica del
enfoque:
Colocar la caja Petri en el estereoscopio. Si el equipo tiene la lámpara incorporada, iluminar
la preparación desde arriba; de lo contrario, colocar la lámpara externa en un ángulo de unos
45º. Observar el relieve de las colonias, luego inclinar la placa hasta un ángulo de 45º o más
con respecto al plano de observación, sin modificar el sistema de iluminación que se esté
empleando. Anotar las diferencias apreciadas en la imagen.
Dejar la muestra colocada sobre la platina de observación y apagar la luz propia del equipo,
iluminar la preparación con la lámpara externa, variar el ángulo de iluminación desde unos
45º hasta un ángulo rasante, lo más pequeño posible.
Recomendaciones
MATERIALES Y EQUIPO
Microscopio compuesto binocular Hilos de color
Estereoscopio Flores de besito (Impatiens balsamina)
Portaobjetos Flores de lirio (Hemerocalis sp.)
Cubreobjetos (laminillas) Hojas de guarda parques (Setcreasea
purpurea)
Vidrio reloj Cabellos
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PROCEDIMIENTO BASICO
Lave el portaobjeto con jabón y abundante agua, secándolo preferiblemente con un pedazo de tela
que no deje residuos encima del vidrio. Con un gotero eche una gota de agua en el centro del
portaobjeto y después ponga en ella un pedazo de hilo de color de un centímetro de largo
aproximadamente. Apoye luego el cubreobjetos en un ángulo de 45º con relación al portaobjeto y
sosténgalo con un lápiz de modo que haga contacto con el agua, como se muestra en la figura 6. Por
último, déjelo caer lentamente. De esta manera se evita la formación de burbujas que podrían
dificultar la observación. Si queda agua por fuera del cubreobjeto, séquela con papel absorbente.
Igualmente, seque el portaobjeto si este queda mojado por debajo, ya que la humedad lo pega a la
platina y le impide desplazarse cuando el carro se mueve.
(Nota: No siempre las muestras en fresco se preparan con agua. En algunos casos es necesario utilizar
otras sustancias, o soluciones adecuadas, según el tipo de material que se quiera observar)
De la forma como usted utilice el microscopio depende el éxito de sus observaciones. Por tal motivo
se recomienda seguir siempre el procedimiento que a continuación se explica:
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a. Colocación de la muestra
Ponga sobre la platina la placa de hilo que acaba de hacer y fíjela a ella utilizando las pinzas que para
el efecto tiene el microscopio. Centre la muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro.
c. Obtención de la imagen
Mirando por los oculares, aleje lentamente la platina con la perilla macrométrica hasta que aparezca
la imagen. Si en ese momento lo considera necesario, mejore la iluminación con la perilla reguladora
del voltaje y con la del condensador de abertura. Moviendo los oculares, ajuste la visión a su distancia
interpupilar; igualmente, ajuste la visión binocular con el anillo de dioptrías, de la siguiente manera:
mire con el ojo derecho por el ocular respectivo (derecho), manteniendo cubierto el ocular izquierdo
con una hoja de papel o con algo similar, y enfoque con la perilla micrométrica lo mejor posible.
Ahora proceda a ajustar el izquierdo así: cubra el ocular derecho, mire con el ojo izquierdo por el
respectivo ocular y enfoque con el anillo de dioptrías.
Haga lo mismo, es decir, enfocar con 4X, 10X y 40X, y dibujar lo observado, con otros materiales
que le suministre su profesor: cabellos, granos de polen, epidermis superior o inferior de hojas de
guardaparques, etc.
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5. Características de la imagen
a. Como se ve la imagen
Haga una preparación en fresco de una letra asimétrica (no utilice las letras o, x, s, ni las mayúsculas
I, H, N y Z). Pongala en la platina en posición normal de lectura y enfoque con el objetivo de 4X.
Haga el esquema correspondiente. ¿Cómo se ve la imagen con relación a la posición de la letra en el
portaobjeto?
Enfoque esa misma letra con el objetivo de 10X y dibújela. ¿Qué proporción aproximada de ella
puede ver con relación a la obtenida con el objetivo de 4X?
Tome ahora la otra perilla del carro y muévalo hacia adelante y hacia atrás. Al hacer cada uno de
estos movimientos, ¿en qué dirección se desplaza la imagen?
Seleccione la luz incidente, ajusta el control de la luz para proporcionar una iluminación adecuada
y uniforme sobre la placa.
Ajuste los oculares a la separación entre los ojos.
Coloque el ejemplar a observar sobre la placa.
Enfoque mediante el control de enfoque
El aumento se puede varía, cuando sea necesario, mediante el cambio del tambor para el cambio
de aumento. El aumento de la lupa se calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento
que indica el tambor de cambio
7. Observación en el estereoscopio
Con cada uno de los materiales traídos por el grupo van a seguir el mismo procedimiento de
observación al estereoscopio.
1. Escoja el material de acuerdo al orden establecido en el listado de material traído por el estudiante.
2. Ponga el material o elemento en una caja de Petri o sobre una lámina portaobjetos (nota: no es
necesario el uso de laminillas cubreobjetos)
3. Proceda a colocar el preparado sobre la base del estereoscopio.
4. Prenda y ajuste la fuente de luz. Asegurándose de que la fuente de luz esté iluminando el elemento
a observar.
5. Enfoque el objeto que desea ver y muévalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados con sus manos
Pregunta adicional a responder de la metodología. ¿Hacia dónde se mueve la imagen? ¿Puede explicar
estas observaciones? ¿Cuál es la diferencia con el microscopio?
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Referencias
URIBE A., Frank; MORENO M., Jaime; ALDANA E., Daniel y PINEDA G., Nubiola. Manual de
Laboratorio de Biología General. Reimpresos, Universidad de Antioquia. 1998.
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INFORME
Para qué tipo de muestras se utilizan los montajes en fresco y para cuales placas fijas?
Esquematice las observaciones de la muestra preparada, describa color, forma, detalles y señale las
estructuras observadas
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Descripción
5. Características de la imagen
a. Como se ve la imagen
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Enfoque esa misma letra con el objetivo de 10X y dibújela. ¿Qué proporción aproximada de ella
puede ver con relación a la obtenida con el objetivo de 4X?
Muestra: Objetivo:10x Aumento total:
Descripción
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Empleando la misma preparación anterior en 10X, desplace el carro hacia la derecha, sin dejar de
mirar por los oculares. ¿En qué dirección se mueve la imagen?
Desplácelo luego hacia la izquierda y fíjese de nuevo en la dirección en que se mueve la imagen.
Tome ahora la otra perilla del carro y muévalo hacia adelante y hacia atrás. Al hacer cada uno de
estos movimientos, ¿en qué dirección se desplaza la imagen?
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7. Observación en el estereoscopio
Pregunta adicional a responder de la metodología. ¿Hacia dónde se mueve la imagen? ¿Puede explicar
estas observaciones? ¿Cuál es la diferencia con el microscopio?
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