Universidad Autónoma de Baja California

“UABC” Facultad de ciencias químicas e ingeniería.

LABORATORIO DE INMUNOLOGIA.

Químico Farmacobiólogo.

Profesor: Laderos Sánchez Bertha

Práctica de laboratorio #4: RESISTENCIA NO ESPECÍFICA

FAGOCITOSIS

Alumno:

Liera Jimenez Jezreel Daniel

Grupo 451-2
Laboratorio de Inmunologia
Semestre 2022-2
Tijuana, B.C. Septiembre 27 de 2022
PRACTICA No. 4
RESISTENCIA NO ESPECÍFICA FAGOCITOSIS
INTRODUCIION
En 1984, Elie Metchnikoff, observo la ingestión de diversos microorganismos
por leucocitos de conejo y de humano, fenómeno que el denomino Fagotocitosis.
También noto que la fagocitosis aumentaba cuando los animales estaban
recuperándose de alguna infección o después de una vacunación. Posteriormente,
el mismo Metchnikoff demostró la existencia de dos tipos de leucocitos circulares
capaces de fagocitar: los polimorfonucleares (PMN), y los macrófagos, proponiendo
el término general de fagocitos para todas estas células.
La fagocitosis efectuada por los PMN se puede dividir, para su estudio, en
cinco etapas relacionadas: quimiotaxis, opsonización, ingestión, desgranulación, y
destrucción.
Quimiotaxis: Es el proceso mediante el cual los fagocitos son atraídos al lugar
de la invasión microbiana.
Opsonizacion: Las opsoninas presentes en el suero interaccionan con los
microorganismos y los hacen más susceptibles a la ingestión por los fagocitos.
Ingestión: Los seudópodos citoplasmicos de los fagocitos se extienden al
ponerse en contacto con las bacterias, fusionándose sobre el lado distal del material
que va a ser ingerido, englobando a la partícula y formando una visión fagocitica
denominada fagosoma.
Desgranulación: A medida que se forma el fagosoma, los gránulos
lisosomales del PMN adquieren movimiento en la proximidad del fagosoma, se
fusionan con la vacuola fagocitica y desaparecen del citoplasma.
Destrucción: En los fagocitos existen múltiples sistemas microbicidas. Estos
mecanismos antimicrobianos pueden dividirse en dos categorías: dependientes de
oxigeno e independientes de oxígeno.
Como ejemplos de los primero se tiene al sistema de la mieloperoxidasa, al
H₂O₂ al anión superóxido y al singlete de oxígeno.
Dentro de los mecanismos independientes de oxigeno se encuentran las
proteínas catiónicas, la lactoferrina, la lisosima y la elastasa.

Existen diferentes pruebas de laboratorio empleadas en la clínica para

evaluar la función fagocitica en pacientes con diversas enfermedades; todas estas
pruebas pretenden, en su conjunto, evaluar las cinco etapas principales del proceso
de la fagocitosis.
OBJETIVO
El alumno será capaz de determinar algunas etapas del proceso fagocitico
por observación microscópica después de ensayos in vitro.
MATERIALES Y METODO.
Material por grupo
Centrifuga refrigerada.
Incubadora ajustada a 37 °C y 7 % de CO₂.
Microscopio óptico.
Portaobjetos para lavado.
Resina sintética.
Safranina.
1 litro de solución salina al 0.85% (SS).
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL.
3 pipetas serológicas de 10 mL.
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
3 pipetas serológicas de 1.0 mL.
2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm.
Material por equipo
1 jeringa desechable de 10 mL con aguja de 20 X 25 mm.
1 ligadura.
1 frasco con torundas con alcohol.
5 tubos de ensaye de 13 X 100 mm.
4 cajas de Petri de 60 X 15 mm de diámetro conteniendo sendos cubreobjetos
previamente desengrasados.
3 pipetas serológicas de 5.0 mL.
3 pipetas serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur con bulbo de hule.
1 gradilla.
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL.
 1 tubo de ensaye 18 X 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9 perlas de
vidrio.
1 frasco tipo Gerber.
1 pinza con extremos planos.
2 Portaobjetos.
2 mL de levaduras opsonizadas y ajustadas a una concentración de 5 X 10 ⁸
levaduras/mL y 2 mL de levaduras sin opsonizar, a la misma concentración.
2 mL de NAT al 0.1% en SS.
10 mL de medio mínimo esencial (MEM) pH 6.8 – 7.0.
Papel absorbente.
Método.
1. Colocar cuatro cubreobjetos perfectamente limpios y desengrasados
dentro de cuatro cajas de Petri, con papel absorbente húmedo en las
tapas a fin de mantener una cámara húmeda.
2. Obtener 5.0 mL de sangre venosa sin anticoagulante y después de retirar
la aguja depositar la muestra en el tubo con tapón de rosca con perlas de
vidrio. Agitar el tubo suavemente evitando la formación de espuma hasta
una completa desfibrinación. Depositar aproximadamente 0.8% mL de
sangre desfibrinada sobre la superficie de los cubreobjetos.
3. Incubar las preparaciones durante 30 min a 37° C.
4. Eliminar el exceso de sangre, depositando 2 mL de SS en la caja de Petri,
cuidando de no vaciar directamente la solución sobre las preparaciones.
Agitar la caja de Petri suavemente con movimiento rotatorio. Retirar el
líquido de lavado con la ayuda de una pipeta Pasteur, lavar hasta que ya
no se observen eritrocitos sobre la preparación.
5. Adicionar a los cuatro cubreobjetos 2 mL de MEM y 0.5 mL de NAT. A dos
de ellos agregar 10⁷ levaduras opsonizadas, y a los otros dos el mismo
número de levaduras sin opsonizar.
6. Incubar las preparaciones a 37°C durante 30 min.
7. Retirar el líquido sobrenadante de cada una de las cajas, con la ayuda de
una pipeta Pasteur, cuidando de no tocar la preparación.
8. Retirar los cubreobjetos de las cajas con ayuda de las pinzas y pasarlos
al portaobjetos, que debe estar sumergido en SS.
9. Agitar el portaobjetos con movimientos verticales y horizontales. Cambiar
el líquido de lavado por lo menos cinco veces.
10. Introducir los cubreobjetos en safranina al 0.5% durante 10 min.
 11. Enjuagar perfectamente con agua las preparaciones ya tenidas para
eliminar el exceso de colorante.
12. Dejar secar los cubreobjetos y montar las preparaciones con resina
sintética sobre portaobjetos limpios.
13. Una vez que la resina haya secado, observar los fenómenos de ingestión
y reducción del NAT en un microscopio óptico bajo objetivo de inmersión
(100x).

RESULTADOS

Observar las células fagociticas la diferencia en la endocitosis de levaduras

opsonizadas y levaduras no opsonizadas. Distinguir entre células que redujeron el
NAT (levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solamente
levaduras rojas).
 El grado de endocitosis ocurrido y la capacidad de las células para reducir el
NAT se puede evaluar determinando el porcentaje de células que, habiendo
endocitado, han reducido el colorante.
OBERVACIONES
Debido al horario del laboratorio de inmunología no fue suficiente para llevar a cabo
de manera satisfactoria y adecuada la practica destinada a conocer y observar
células fagocíticas, se tuvieron que llevar a almacenar las muestras, por ello, el día
que finalmente se pudo visualizarlas en el microscopio no se observó nada, a raíz
de eso la maestra del curso nos facilitó unas imágenes que tomo en otro semestre
anterior.

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Stites, D.P.; Terr, A.I. & PArslow, T.G. 1997. Medícal Inmunology. 9th. Ed.
Appleton & Lange, a Simón & Schuster Co., Stamford, Connecticut.
2. Roitt, I. M. Brostoff, J. & Male, D. 1996 Inmunology. 4th ed. Mosby Publ.
London.