Dra.

DELIA GAMARRA
 INTRODUCCIÓN
Los avances de la ciencias moleculares como la
biotecnología, ingeniería genética, biología
molecular, nanotecnología y el profundo
conocimiento sobre la constitución y función de los
ácidos nucleicos ha hecho posible la utilización de
tecnologías en genómica, proteómica y diagnóstico
molecular de microorganismos.
 Son técnicas de biología molecular empleadas para la identificación
y caracterización de microorganismos benéficos o aquellos que
causan enfermedades infecciosas, ya sean de origen vírico,
bacteriano, fúngico.
 Eldiagnóstico e identificación molecular
ha permitido la existencia de bancos de
genes y creación del sistema de códigos
de vida, donde se almacenan todos los
secuenciamientos de ADN o ARN de los
organismos vivos y microorganismos
patógenos ya identificados y clasificados.
 APLICACIÓN DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR
 Detecta el genoma de los microrganismos patógenos
en todo tipo de muestra
 Detectar cantidades mínimas de microrganismos en
muestras de plantas infectadas o muestras biológicas.
 Diagnóstico de patógenos obligados intracelulares en
plantas con síntomas causados por m.o. que no se
cultivan: bacterias fastidiosas, virus, fitoplasmas,
espiroplasmas y patógenos de bajo título o lento
crecimiento.
 Identificación de genes de virulencia o de resistencia a
fungicidas.
 Genotipificación de cepas, razas o subespecies.
 PRINCIPIOS BÁSICOS DEL ADN Y ARN
Se encuentran en todas la células vivas.
Se llaman así porque dan una reacción ácida al
suspenderse en agua.
Son enormes compuestos en forma de cintas de
gran longitud, con peso molecular de millones pb.

Función biológica de los ácidos nucleicos

El ADN contiene la información hereditaria.

Almacena, replica, recombina y transmite la información genética.
El ARN principalmente permite la expresión fenotípica del ADN y sintetiza proteínas.
Estructura del ADN
NUCLEOTIDO Pares de bases
nitrogenadas
TIPOS Y ORGEN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
ADN nuclear (núcleo de los eucariontes)
ADN celular (procariontes)
ADN plasmidal (procariontes)
ADN mitocondrial (mitocondria de los
eucariontes)
ADN de los cloroplastos
ADN viral (virus animales, vegetales y
bacterianos)

ARN mensajero (procariontes y eucariontes)

ARN ribosomal (procariontes y eucariontes)
ARN de transferencia (procariontes y eucariontes)
ARN nuclear pequeño (eucariontes)
ARN subviral (moléculas de ARN libres)
Componentes monoméricos (nucleótidos).
 Tamaño relativo del ácido nucleico de un organismo o
patógeno

Nucleótidos
Escherichia coli 5 000 000
Virus del mosaico del
6 396
tabaco
ARN mensajero 1 800

Viroide de la papa 359

 Propiedades del ADN Propiedades del ARN
Insolubles en soluciones Soluble en soluciones
diluidas de NaCl diluidas de NaCl

Soluble en soluciones Insoluble en soluciones

concentradas de NaCl concentradas de NaCl

Insoluble en alcohol Insoluble en alcohol

Puede ser disociado de las Puede ser disociado de las

proteína por tratamiento con proteínas por tratamiento
un detergente o un fenol con detergente o un fenol
 REPLICACIÓN DEL DNA
Consiste en:
Separación de las dos cadenas que forman
la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas
y proteínas presentes en la célula.
Unión de los cebadores ('primers' o
iniciadores) de RNA en una de las hebras
separadas.
Unión de la polimerasa a los lugares donde
se encuentra el 'primer' para comenzar a
copiar la hebra de DNA, ya que la polimerasa
necesita un cebador que le indique dónde
empezar, por ser incapaz de copiar DNA
monocatenario.
El sentido de la síntesis es siempre 5'  3'.
Constitución de las nuevas copias siempre
formadas por una hebra madre y otra hija
(replicación semiconservativa del DNA)
REPLICACIÓN DEL ADN
Replicación
semiconservativa del
ADN. Las dos hebras de
ADN “parentales” se
separan para dar origen
a dos hebras “hijas”
por complementariedad
de bases
 CLASIFICACIÓN DE LAS
TÉCNICAS MOLECULARES
Las técnicas
moleculares han
revolucionado las
diversas ciencias y
conceptos respecto
a las relaciones
entre individuos,
poblaciones y
especies,
volviéndose parte de
un repertorio de
herramientas
necesarias para los
fines de las ciencias
básicas y aplicadas.
Técnicas moleculares basadas en
hibridación
Las técnicas de hibridación,
han evolucionado desde las
más sencillas como Southern
blot o Northern blot hasta
otras más sofisticadas como la
hibridación genómica
comparada.

Uno de los campos con más

futuro es la aplicación de
técnicas de hibridación a las
secciones histológicas
(hibridación in situ), incluyendo
su variación fluorescente para
el análisis de cromosomas
(FISH, hibridación in situ con
fluorescencia).
 Conceptos básicos de la hibridación

 Hibridación
(Renaturalización), proceso en el que se
combinan dos cadenas sencillas y
complementarias de ácidos nucleicos. Una de
ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la
sonda empleada para localizar ese ácido nucleico
diana.
 Sonda. Es un fragmento monocatenario de DNA
o RNA marcado con una molécula reporter, y que
se emplea para el reconocimiento específico del
ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un
proceso de hibridación.
 Conceptos básicos de la hibridación
Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:
 Fragmentos de ADN
 Fragmentos de ARN
 Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.

Moléculas reporter. Son moléculas químicas unidas a

la sonda y que van a permitir la detección de esta
después de un proceso de hibridación. Pueden ser:
 Radiactivas (32P, 35S),
 De afinidad (Biotina, Digoxigenina),
 Enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa)
 Quimioluminiscentes (ésteres de acridina).
 Clases de hibridación
1. Hibridación en fase sólida

El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran

inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa
(fijado por calor) o de nylon (fijado por luz ultravioleta).
Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada
que buscará su secuencia complementaria en el ácido
nucleico diana que queremos identificar.
La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones
inespecíficas son eliminados mediante lavados.
Las hibridaciones en fase sólida más empleadas en
Biología Molecular son las siguientes:
Hibridaciones ADN – ARN
: Hibridaciones ADN – ADN
Utiliza moléculas fluorescentes para detectar
ADN de preparados celulares.
Técnica molecular FISH, que se basa en el uso de moléculas
fluorescentes permiten localizar cromosomas genes o
fragmentos de ADN a partir de preparados celulares
TÉCNICAS MOLECULARES
BASADAS EN REACCIONES
ENZIMÁTICAS
1. Polimerase Chain Reaction
Es una técnica molecular basada en la acción de la
enzima termoestable Taq ADN polimerasa.
Fue desarrollada originalmente por Kary Mullis entre
1983 y 1985.
El propósito es producir grandes cantidades de ADN a
partir de una molécula de ADN molde.
Toda la reacción se lleva a cabo a través de un
proceso que comprende un número de ciclos de
denaturación, hibridación o anilamiento y extensión.
Su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más
fácil identificar con una muy alta probabilidad virus,
bacterias, hongos, nematodos, plantas, etc. identificar
personas (cadáveres) o hacer investigación científica
sobre el ADN amplificado.
Ver en youtuve.com
https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
 VARIANTES DE PCR
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Es la combinación
de los métodos de PCR y análisis de fragmentos de restricción, con
el fin de detectar polimorfismos debidos a modificaciones en la
secuencia de ADN que comprende los sitios de corte de las enzimas
de restricción. Este cambio se percibe como un patrón diferente, en
número y tamaño, de bandas generadas.
Nested PCR. Comprende dos rondas de amplificación con distintos
pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de
incrementar la sensibilidad de detección.
Real-Time PCR. Descripta como “Kinetic PCR” por Higuchi et al. en
1993. Se basa en la detección y cuantificación simultanea de la
fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan
durante el proceso de amplificación.
RT-PCR. Se realiza una transcripción reversa a partir de ARN para
sintetizar el ADN complementario que luego es amplificado mediante una
PCR convencional
Secuenciamiento de ADN. Permite la
identificación y caracterización de los
genes o regiones genéticas de manera
directa. Se basa en el uso de
dideoxinucleótidos (ddNTP) terminales
marcados con radioactividad o
fluoróforos. Cada uno de los fragmentos
generados son resueltos en geles de
poliacrilamida o en capilares y luego
procesados a través de una computadora
que interpreta los fragmentos de ADN
como cada uno de los nucleótidos que
conforman la molécula de ADN
Resultados del secuenciamiento de los fragmentos 16S rRNA de fitoplasmas
aislados en Zanahoria (Fito Junio 05 y Fito Junio 02) y del fitoplasma aislado
de maíz (MSJb2) provenientes de Chupaca y Huancayo, respectivamente
3.
Electroforesis en campo pulsado.
 Separa moléculas de ADN de gran tamaño (desde 30
kB hasta 10 Mb), proteínas facilitado por la
aplicación de un campo eléctrico en dos
dimensiones.
 Esta técnica ha permitido caracterizar cromosomas
enteros desde organismos simples a complejos.
 Permite magnificar las bandas de ADN, ARN o
proteínas .
electroforesis
APLICACIÓN DE TÉCNICAS
MOLECULARES
 Salud
 En las enfermedades transmisibles, para
diagnóstico molecular, epidemiología,
clasificación del agente etiológico, vacunas y
terapia génica.
 En las enfermedades no transmisibles, ha
permitido mapear más de 1000 enfermedades
genéticas en regiones especificas de los
cromosomas y mas de 300 definidas por la
estructura del gen y las mutaciones
presentes.
 Las pruebas pueden englobarse en las
siguientes categorías:
 Salud
1. Caracterización e identificación de anomalías
genéticas en pacientes que padecen el
trastorno así como la detección de
portadores. (Corea de Huntinghton, Fibrosis
quística, etc.
2. Diagnósticos, pronóstico y seguimiento de
enfermedades neoplásicas. (leucemias,
linfomas etc.)
3. Diagnóstico de predisposición a padecer
enfermedades del adulto con reconocida
base genética. (Enfermedades asesinas, tales
como trastornos cardiovasculares, Alzheimer,
trastornos psiquiátricos etc.)
 Criminalística
 Refuerza la investigación para el hallazgo de presuntos
responsables de delitos perpetrados.
 Dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense estudia
básicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad
entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones
polimórficas del ADN.
 Así, analizando un determinado número de regiones
polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean
genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso
de gemelos univitelinos).
 Para la investigación de delitos, es necesario el uso de
modernos laboratorios de biología molecular, en donde se lleva
a cabo el DNA fingerprinting, la cual se observa como un código
de barras distinto para cada persona y de esta manera se
pueden atrapar a homicidas y violadores, identificar a personas
desaparecidas, etc.
 Es importante señalar que los primeros casos de Criminalística
fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs .
 Mejoramiento genético
 Optimiza los cruces de razas para mejorar la producción de
carne.
 Ofrece una serie importante de posibilidades para la mejora
genética animal, pero requiere soluciónar un número
importante de problemas técnicos para aprovechar toda la
información disponible de un modo eficiente, reducir los costos
de generar información genómica y obtener estimaciones
confiables de los efectos de genes mayores con efectos en
características productivas (QTLs) y de la aplicación de la
selección asistida por marcadores (SAM) y la información
genómica en general para la mejora animal.
 Ayudar a mejorar el entendimiento de fenómenos aún no bien
comprendidos como la epistasis interacciones entre alelos en
distintos loci) y las interacciones genotipo x ambiente, al
posibilitar el análisis del efecto de genes específicos en
caracteres de herencia compleja como los involucrados en el
mejoramiento animal.
 Taxonomía microbiana
 Clasifica correctamente a los microorganismos, de acuerdo a su
filogenia.
 Estos estudios pueden ser realizados mediante el estudio de la
secuencia total de nucleótidos del genoma del microorganismo,
pero actualmente se utilizan estudios de rRNA de 16S o 23S ya que
son secuencias que se han mantenido bastante uniformes a lo largo
de la evolución y por eso se ven claramente las diferencias entre los
distintos microorganismos y se pueden realizan árboles
filogenéticos y esquemas evolutivos.
 En tres décadas los investigadores han recopilado un robusto mapa
de la evolución de la diversidad, enseñando, que la principal fuente
de la diversidad de vida es la microbiana, distribuida entre los tres
grupos o dominios: Archeae, Bacteria y Eucarya.
 Las aplicaciones de los métodos de la filogenética molecular para el
estudio de los ecosistemas naturales microbianos, sin el
requerimiento tradicional del cultivo, han originado el
descubrimiento de linajes evolutivos inesperados; miembros de
algunos de estos linajes están sólo lejanamente relacionados con
organismos conocidos.
 Producción agropecuaria
 Se han hecho intentos para seleccionar caracteres con utilidad
agronómica utilizando marcadores morfológicos (denominados
también alelos mutantes en contraposición al alelo normal).
 Se han observado asociaciones entre los caracteres seleccionados
y determinados marcadores morfológicos. Ej. entre el mayor
rendimiento del grano del trigo y la menor talla de las plantas.
 La contribución directa de estos mutantes al carácter seleccionado
no esta cuantificada, pero es muy probable que en estos casos el
incremento de rendimiento no se deba a su asociación directa con
los marcadores sino a una causa indirecta como es permitir un
aumento de la densidad de plantas y del nivel de fertilización en el
cultivo.
 Obtención de variedades resistentes a enfermedades

 CONCLUSIONES

 Se realizado una revisión de las principales

técnicas moleculares desarrolladas hasta la
actualidad, sus ventajas de especificidad y
velocidad y sus aplicaciones en las diferentes
disciplinas, los mismos que han generado
profundos cambios conceptuales, económicos y
sociales.
 Es importante señalar que el estudio del ADN no
solo ha permitido profundizar los conocimientos
en las ciencias biológicas, sino también en otras
disciplinas que vienen aplicando las técnicas
moleculares en el quehacer diario.
 CONCLUSIONES
 El desarrollo de las técnicas moleculares viene
resolviendo muchos problemas tanto en el
campo de la ciencia básica como aplicada,
asumiendo como consecuencia un rol
protagónico en el desarrollo de la vida humana y
su relación con la naturaleza.
 Estos avances sin embargo deberán estar
circunscritos en salvaguardar la identidad
genómica de los elementos que conforman
nuestro ecosistema, a fin de evitar el
desequilibrio de la interacción de las formas
vivientes que lo integran.