Curso de Inmunología General Laboratorio

Semestre 2015-I

EJERCICIO EXPERIMENTAL 5
Determinar la cantidad de C4 en el plasma humano.
Inmunodifusión Radial (RID). Técnica de Mancini.

OBJETIVO

Cuantificar la proteína C4 del complemento en una muestra de suero problema.

¿CÓMO?

Mediante el método de inmunodifusión radial simple (RID) descrito por Manzini, Carbonara y
Hermans, que consiste en un gel de agar que contiene el antisuero específico y el antígeno difunde
radialmente a partir de un orificio en la capa de agar de grueso uniforme con formación de
precipitados de forma circular, cuya superficie es proporcional a la concentración de antígeno.

MATERIAL

 I caja petrí de 60X100mm.

 1 Micropipeta de 20 y 50 μL.
 1 nivelador.
 1 mechero
 1 tripie y tela de asbesto para mechero
 1 baño de agua a 45º C (por grupo).
 5 mL. de solución de agar noble al 1.5 % en PBS.
 1 mL. de solución de agar noble al 0.3 % en PBS.

INTRODUCCIÓN

La Inmunodifusión radial o Mancini es un tipo de prueba que utiliza un soporte sólido, compuesto
por diferentes sustancias siendo la más común el agar o la agarosa; en este gel existen una serie
de poros a través de los cuales la sustancia que se coloca en ellos puede difundir libremente. Esta
técnica se hace generalmente en una placa, caja petri o porta objeto; consiste en agregar una
determinada cantidad de agar al cual se le ha incorporado, generalmente, un anticuerpo contra lo
que se quiere medir, y colocarlo en alguno de los soportes anteriormente mencionados.

Una vez solidificado el agar con el anticuerpo se hacen orificios y en ellos se coloca el antígeno
que desea probarse. Después de un periodo de 12, 24 o 48 hrs. de incubación, dependiendo de lo
que se este midiendo, se forman halos de precipitación alrededor del orificio, este fenómeno se
debe a la formación de complejos antígeno-anticuerpo hasta llegar el momento de equivalencia en
el cual se produce el precipitado. El diámetro de la zona de precipitación es directamente
proporcional a la concentración del antígeno.

Esta técnica puede considerarse como cuantitativa si se coloca un volumen medido con exactitud
tanto de un estándar cuando menos en tres diluciones de concentración conocida, como de los
sueros problema.

Esta prueba se puede utilizar para aquellas sustancias que se encuentren en orden de mg/mL, el
anticuerpo incorporado determina la sensibilidad de la técnica.

Este método se aplica en inmunología clínica para la cuantificación de antígenos,

fundamentalmente de las fracciones plasmáticas humanas, como son la albúmina sérica humana,
las inmunoglobulinas G, A y M, los componentes C3 y C4 del complemento, factores de
coagulación, etc.
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Esta técnica se utiliza en el campo para identificar la existencia de diversos problemas que pueden
tener el ganado., por ejemplo para detectar Leucosis bovina, el virus causante de la lengua azul,
Neumonía ovina progresiva y anemia equina infecciosa se utiliza bastante para saber con certeza
cuales vacas están vacunadas con B. abortus S-19.

Las aplicaciones que puede tener la inmunodifusión radial son bastantes, ya que su fundamento y
realización son fáciles de aplicar. Básicamente, esta técnica se puede aplicar a demasiados
antígenos y anticuerpos, siempre y cuando éstos se puedan estar incorporados en el soporte
utilizado (gel de agarosa).

Por su utilidad se puede llevar a campo y a lugares en donde se requiera de una prueba rápida y
barata. Del químico depende aplicar la imaginación para aplicar esta técnica en sus diferentes
retos y en nuevas aplicaciones que ayuden a un diagnostico seguro, rápido y barato.

METODOLOGÍA

1. Prepara una solución de agar noble al 1.5 % en amortiguador de fosfatos (PBS) pH 7.2.
2. Prepara una solución de agar noble al 0.3 % en PBS, pH 7.2.
3. Fundir utilizando un baño de agua hirviendo.
4. Colocar el tubo con 5 mL. de solución de agar al 1.5% en un baño de agua a 45º C,
mantener el tubo con gel a esa temperatura durante 15 min. (hasta que se estabilice)
5. Manteniendo el tubo dentro del baño de agua a 45º C, incorporar al gel de agar 50 μL de
anticuerpos anti-C4 humano.
6. Tapar el tubo, sacarlo del baño y mezclar por inversión rápida, pero suavemente para
evitar que se forme espuma.
7. Verter el agar sobre la placa de plástico para RID. Sobre una superficie perfectamente
nivelada.
8. Homogenizar con movimientos de rotación suaves y en seguida dejar solidificar sobre la
placa de vidrio perfectamente nivelada.
9. Realizar 5 horadaciones en el gel con un perforador de 4 mm. de diámetro interno.
10. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
11. Depositar 10 μL de solución de agar al 0.3 % en cada horadación para sellar la superficie.
12. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
13. Depositar 25 μL. de muestra o estándares en los pocillos designados a tal efecto.
14. Permitir que la muestra comience a difundir hacia en interior del agar.
15. Incubar en posición horizontal el tiempo deseado (48-72 hrs)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

La determinación de la cantidad de C4 dentro de una muestra, se realiza de la siguiente manera:

Se realiza una curva estándar con concentraciones conocidas del antígeno, una vez obtenidos los
halos de precipitación, se mide el diámetro de los mismos, de tal manera que se construye una
gráfica con el valor de los diámetros al cuadrado contra la concentración de los mismos; una vez
obtenida esta curva, se extrapola el cuadrado del diámetro de la muestra, y se obtiene la
concentración de C4 en el suero humano problema.