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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

MINISTERIO DEL PODER POPULAR PARA LA EDUCACIÓN UNIVERSITARIA,

CIENCIA Y TECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL SUR DEL LAGO “JESÚS MARÍA

SEMPRUM” - CONVENIO ULAC-FCSF

El aislamiento viral en cultivos celulares como diagnóstico en infecciones por

Parvovirosis Canina

Asignatura: Bioanálisis

Profesor: José Fernández

Integrantes:

Lorena Abate Querales

C.I. V- 20-221-12

Luisana Marcano

C.I. V- 28.424.025

Caracas, Julio del 2021

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1El diagnóstico del Parvovirus canino se basa en la signología y en exámenes de

2laboratorio fundamentales para la confirmación del cuadro. 1 Para esto se requiere

3que las muestras se recojan, transporten y procesen adecuadamente. En la

4actualidad, la mayoría de los métodos de laboratorio emplean equipos comerciales

5y en todo momento deben seguirse las instrucciones de los fabricantes. 2

6Tipo de muestras a utilizar

7Preferiblemente se utilizan muestras de fecas obtenidas en la fase aguda de la

8enfermedad, aunque también se pueden utilizar trozos de epitelio del intestino

9delgado, ganglios linfáticos mesentéricos y/o bazo. 1 La toma de muestra fecal

10puede ser directa o a través de hisopados anales. 3

11Hay dos maneras en las que se puede recolectar excrementos en perros; con asas

12rectales (en el interior del recto del paciente) o directamente del suelo tan pronto

13como defeque el animal.4

14Se debe disponer de los siguientes materiales:

15 - Asas rectales de plástico.

16 - Recipiente recolector de plástico limpio o estéril.

17 - Gel lubricante.

18 - Hisopos (en caso de realizar hisopado rectal).

19Se recomienda no refrigerar la muestra, mantenerla alejada de la luz y en un

20espacio fresco mientras la misma es enviada al laboratorio. 4

21Aislamiento viral en cultivos celulares

22Los virus necesitan células vivas para replicarse. Muchos virus se replican de forma

23activa en cultivos celulares. Los sistemas de cultivo celular son monocapas de

24células vivas que sostienen el crecimiento de los virus. La replicación del virus se

25detecta mediante el efecto citopático en la monocapa celular. Se denomina efecto

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26citopático a las alteraciones morfológicas visibles características en una línea

27susceptible debido a la replicación del virus. 5

28Las líneas celulares pueden propagarse y/o mantenerse en el laboratorio, aunque lo

29más habitual es adquirir los cultivos celulares monocapa comerciales. Existen tres

30sistemas celulares generales: primarios, diploides y continuos. Las líneas celulares

31primarias son las que proceden directamente de tejidos animales o humanos y se

32preparan troceando el tejido y tratándolo con tripsina. Las líneas celulares diploides

33son aquellas que mantienen la infección vírica hasta de 20 a 50 pasadas y

34proceden de células fetales o de recién nacidos. Un ejemplo son los fibroblastos

35humanos diploides. Las líneas celulares continuas son las que proceden de

36cánceres humanos o animales o son células transformadas in vitro. Así, estas

37líneas celulares continuas tienen un cariotipo heteroploide y pueden subcultivarse

38de forma indefinida sin que se pierda la sensibilidad a la infección por el virus. Las

39líneas celulares continuas más utilizadas son la HeLa y la HEp-2.5. 5

40Para el diagnóstico del parvovirus canino las heces se diluyen en medio Eagle u

41otro medio de cultivo celular, se centrifugan y filtran a través de filtros esterilizantes.

42El filtrado se inocula en cultivos celulares de riñón canino, felino, bovino u otros. 1

43Para proceder al aislamiento viral en cultivos de células de las líneas MDCK, (riñón

44de perro) y CRFK (riñón de gato). Estas líneas celulares se siembran en

45concentración de 5x 10 5 cél/ml y se cultivan periódicamente para luego inocularlas

46a partir de las muestras tratadas con antibióticos. Se centrifugaron a 2000 rpm por

4710 minutos a 4 º C, para obtener los sobrenadantes que constituyen el inóculo. Se

48realizan tres pases sucesivos de inoculaciones en las células hasta pesquisar

49claramente el efecto viral sobre el monoestrato celular, “efecto citopático”, (ECP).

50Como control viral se inocula los mismos tipos de células con PVC2 de referencia
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51Ames, Iowa, catálogo K-35. Como controles negativos se dejan células sin inocular.

52Las muestras son incubadas por 48 h. a 37º C, con una atmósfera de 5% de CO2 y

5393 % de humedad relativa.3

54Se deben investigar la presencia de cuerpos de inclusión intranucleares basofílicos

55o detectar antígenos virales específicos mediante la técnica de

56inmunofluorescencia. La observación al microscopio electrónico, requiere

57concentrar el virus, cualquiera sea el origen de la muestra. Se utiliza la tinción

58negativa con fosfotungstato de K (KPT), y con aumentos de 40.000 a 65.000 se

59observan típicas partículas virales, que solamente se pueden confundir con el virus

60diminuto canino.1

61Otra manera de detectar la presencia de parvovirus canino en los cultivos celulares

62inoculados con una muestra sospechosa, consiste en verificar la capacidad de

63aglutinar eritrocitos de cerdo por el sobrenadante del cultivo colectado 7 días

64después de la inoculación.1

65Efecto citopático observado

66Se puso en evidencia mediante su inoculación en cultivos celulares CRFK y MDCK,

67presentando efecto citopático antes de los 6 días post-infección en todas las

68muestras en las que se había obtenido un resultado positivo. Mediante

69inmunofluorescencia indirecta se evidenció la presencia de virus en todas las

70muestras positivas en, al menos un test cromatográfico. Se consideró como positivo

71la presencia de marcaje citoplásmico o nuclear, implicando la presencia de

72infección sobre los cultivos celulares en las dos líneas empleadas. 6

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74Anexo extra (lesiones producidas por Parvovirus canino) 7

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82Referencias bibliográficas

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