PRACTICA N°16

Virus enfermería

PUEBAS INMUNOLOGICAS: ELISA, WESTERN BLOT

PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA
OBJETIVO. -Los estudiantes deben conocer las pruebas inmunológicas de ELISA, Western
Blot, inmunofluorescencia para el diagnóstico de los virus.
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GENERALIDADES

Las infecciones virales requieren ser detectadas por métodos de fácil acceso y además de
bajo costo. Además de las pruebas rápidas muy útiles en el tamizaje inicial, existen las
pruebas de Inmunofluorescencia (IF).

Las pruebas de Inmunofluorescencia son una herramienta útil para la confirmación

diagnóstica de varias infecciones virales. Luego de la aplicación de pruebas rápidas para
el diagnóstico de algunas infecciones virales, es necesario proceder a confirmar el
diagnóstico con un método de mayor especificidad. Este método puede utilizarse para
vigilancia epidemiológica de virus respiratorios(1) (2) (3) , la confirmación diagnóstica del
VIH (4) (5) (6) y rabia (7) (8), entre otros.

La técnica de Inmunofluorescencia es un método serológico de diagnóstico que permite

detectar los antígenos del microorganismo. Este método se basa en el análisis de patrones
de fluorescencia observados a través del microscopio de fluorescencia en láminas
preparadas en base a cultivo del virus, con una tinción especial.

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este

conjugado (compuesto fluorescente + anticuerpo) a los antígenos correspondientes en
cortes detejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única.
Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia
observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un
anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite
fluorescencia.

El test de inmufluorescencia puede ser directo o indirecto.

MATERIALES

La práctica es demostrativa. Durante la práctica se revisarán láminas de

Inmunofluorescencia procesadas previamente. Se observarán las imágenes de
fluorescencia. Se detalla a continuación el caso del procedimiento de Inmunofluorescencia
para diagnóstico de virus respiratorios.
PROCEDIMIENTO

Obtención y transporte de muestras:

Se deben obtener muestras de hisopado nasal y faríngeo. Las muestras son transportadas
en 1 a 2 ml del medio de transporte. Si las muestras no son procesadas inmediatamente,
conservar entre 2°C y 8°C hasta máximo de 48 horas. Para periodos más prolongados
conservar entre -70°C y 90°C.

Procedimiento de preparación de la muestra para la tinción:

1. Agitar en un Vortex el tubo que contiene el hisopado para desprender las células.
2. Transferir las muestras a un tubo de centrifuga cónico y centrifugar a 300 — 500 g.
durante10 minutos a 2-8°C.
3. Retirar y descartar el sobrenadante, incluido el moco que puede rodear el botón de
células.
4. Golpear el tubo suavemente para soltar las células, añadir el PBS y resuspender las
células pipeteando nuevamente.
5. Repetir la centrifugación.
6. Retirar y descartar el sobrenadante.
7. Golpear el tubo y añadir suficiente PBS para obtener una suspensión celular opalescente.
8. Poner aproximadamente 25u1 del sedimento en un pocillo de un portaobjetos de
múltiples pocillos, y observar al microscopio para asegurar que la concentración
celular es adecuada.
9. Dejar secar el portaobjetos completamente a temperatura ambiente.
10. Fijar las células introduciendo el portaobjetos en un baño de acetona durante 10
minutos a 2- 8°C
11. Sacar los portaobjetos de la acetona y dejar secar completamente a temperatura
ambiente.

Procedimiento de Tinción:

1. Añadir una gota del reactivo para screening o una gota del reactivo para identificación,
a cadapocillo o cubreobjetos de la técnica de cultivo tradicional. Asegurarse de que el
reactivo recubra toda la superficie de células.
2. Incubar durante 30 minutos a 36- 38°C en cámara húmeda
3. Enjuagar brevemente el portaobjetos con PBS. Sumergir el portaobjetos durante 10
minutos en PBS. Dar un ligero lavado con agua desionizada.
4. Secar y añadir una gota de medio de montaje.
5. Colocar un cubreobjetos y presionar suavemente para eliminar burbujas.
6. Observar al microscopio de fluorescencia a 400 x.
7. El control positivo y Negativo debe incluirse para comprobar el correcto
funcionamiento deltest cada vez que un nuevo kit es abierto.
RESULTADOS

El modelo de fluorescencia que debe observarse será:

- Control Positivo: células fluorescentes verde manzana y aspecto característico.

- Control Negativo: patrón celular

rojo.

- Por lo tanto:

- Una muestra Positiva es aquella en que dos o más células intactas muestran un patrón
de fluorescencia verde manzana característica con una intensidad igual o superior de
2+.
- Una muestra Negativa es aquella que contiene un adecuado número de células típicas
(al menos 20) y en la que todas ellas muestran una mínima fluorescencia (< 1+) o
ausencia de fluorescencia (0).
- Las muestras con una tinción débil y/o una sola célula positiva deben ser consideradas
dudosas.

CUESTIONARIO

1. ¿Explique cuál es la diferencia entre la Inmunofluorescencia directa e indirecta?

2. ¿En qué casos se puede utilizar cada tipo de Inmunofluorescencia? ¿Cuáles son los tipos
de muestras biológicas para realizar Inmunofluorescencia en el diagnóstico de rabia
canina, VIH y virus influenza?
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Ampuero JS, Ocaña V, Gómez J, Gamero ME, Garcia J, Halsey ES, et al. Adenovirus Respiratory
Tract Infections in Peru. PLoS ONE. 2012;7(10).

2. del Valle Mendoza J, Cornejo-Tapia A, Weilg P, Verne E, Nazario-Fuertes R, Ugarte C, et al.

Incidence of respiratory viruses in peruvian children with acute respiratory infections. J Med
Virol. 2015;87(6):917-24.

3. Huaman JL, Carrion G, Ampuero JS, Gomez J, Ocaña V, Paz I, et al. Non-rhinovirus
enteroviruses associated with respiratory infections in Peru (2005-2010). Virol J. 2014;11.

4. Inmunofluorescencia y Confirmación Diagnóstica [Internet]. Disponible en:

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVrevistas/Medicina_Experimental/v14_n1/inmunofluorescen
cia_indirecta.htm

5. Boshell J, Alvarez C, Marrugo S, Rojas MC, Rodríguez BM, González M, et al. La

inmunofluorescencia indirecta como prueba suplementaria para confirmar infección por VIH-
1: experiencia del Instituto Nacional de Salud, 1993-2000. Biomédica. 2002;22(1):30-8.

6. Kiptoo MK, Mpoke SS, Ng’ang’a ZW. New indirect immunofluorescence assay as a
confirmatory test for human immunodeficiency virus type 1. East Afr Med J. 2004;81(5):222-
5.

7. Silva SR, Katz ISS, Mori E, Carnieli Jr. P, Vieira LFP, Batista HBCR, et al. Biotechnology advances:
A perspective on the diagnosis and research of Rabies Virus. Biologicals. 2013;41(4):217-23.

8. Vargas-Linares E, Romaní-Romaní F, López-Ingunza R, Arrasco-Alegre J, Yagui-Moscoso M.

Rabies in Potos flavus identified in Madre de Dios, Peru. Rev Peru Med Exp Salud Pública.

2014;31(1):88-93.
 OBSERVACION AL MICROSCOPIO

PRUEBAS INMUNOLÓGICAS EN EL DIAGNOSTICO DE VIRUS

I.- GENERALIDADES
No existe ninguna manifestación clínica que sea característica de la infección por el virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH) o del SIDA (Síndrome de la Inmunodeficiencia
Adquirida) y, aunque la presencia de alguna de ellas pueda sugerir en un contexto
determinado la presencia dela infección, no es posible establecer un diagnóstico clínico de
la enfermedad por lo que éste solose puede establecer de un modo definitivo por técnicas
de laboratorio. Por medio de ellas es posible detectar al propio virus o algunos de sus
componentes, como proteínas y ácidos nucleicos (métodos directos, ya sea mediante
cultivo vírico, detección de antígeno viral o la amplificación de una parte del material
genético del virus, por ejemplo, por PCR (reacción en cadena de la polimerasa), bDNA
(ADN ramificado), etc.).
Sin embargo, la práctica habitual es detectar los anticuerpos específicos que el organismo
produce como respuesta a la presencia del virus (métodos indirectos) y la mayoría de las
técnicas empleadas se basan en el enzimoinmunoanálisis (método ELISA o EIA.) para las
pruebas masivas de tamizaje o en los inmunoblots para las pruebas de confirmación.
Por lo tanto en la mayoría de los casos la seropositividad frente al VIH se detecta a partir
de una extracción sanguínea del sujeto con la que se realiza la determinación de
anticuerpos anti-VIH poralguna técnica serológica.
II.- MATERIALES DE LABORATORIO
A. Placas de ELISA con pocillos controles (positivos y negativos) y los casos en estudio.
B. Escaneo de tiras de Western blot controles (positivos y negativos) y los casos en estudio

III.- PROCEDIMIENTO
A. ELISA = Prueba de inmunoabsorbencia ligada a enzima
− Esta técnica nos permite poner de manifiesto la inmunoglobulina G
− Los antígenos se derivan de virus lisados o producidos por recombinación genética o
sintética
− Los antígenos están fijados a la fase sólida (superficie de plástico, microplacas o perlas)
− Es una reacción inmunoenzimática en la que la unión antígeno-anticuerpo, se pone de
manifiesto a través de la acción de una enzima ligada a un anticuerpo antiinmunoglobulina,
y con el substrato especifico, da una coloración cuya intensidad está en relación a la cantidad
de anticuerpos presentes
− La intensidad del color se mide a una longitud de onda determinada, con el
espectrofotómetro y se convierte en unidades de densidad óptica (DO)
− Se trabaja en cada ensayo con controles positivos y negativos que vienen en los kits
− Su resultado se informa como reactivo o no reactivo.

B. WESTERN BLOT
− La prueba se basa en la separación de las proteínas (antígenos) obtenidas del VIH-1
procedentes del lisado del cultivo del virus y purificadas por centrifugación.
− La proteína viral así obtenida se coloca en un gel de poliacrilamida en forma de láminas
delgadas y luego se efectúa una electroforesis con la que las proteínas de menor peso
molecular (p17, p24) emigran más lejos en el gel mientras que las de mayor peso molecular
se mantienen cerca de su lugar de depósito.
− Después se transfieren a una tira de nitrocelulosa y se cortan en tiras de unos 5 mm de
ancho. Estas son las tiras que se exponen al suero humano diluido, después de una incubación
se lavan y se vuelven a incubar con una IgG antihumana marcada con una enzima que con la
exposición a un revelador enzimático producirá una banda coloreada en las zonas
correspondientes a los anticuerpos específicos que contenga la muestra
− Esta prueba detecta anticuerpos contra cada uno de estos antígenos
− La presencia o ausencia de estas bandas son la base para la interpretación de los
resultados del examen. Es una prueba de diagnóstico concluyente
− Su resultado se informa como negativo o positivo a la infección

INTERPRETACION DEL WESTERN BLOT: Ejemplos:

Criterios mínimos de positividad del Western blot
FDA Existencia por lo menos de tres bandas: p24, p31 y gp41 u otra glucoproteína

CDC Al menos dos bandas: p24, gp41 y gp160/120

CRSS Al menos una banda del core (gag/pol) y otra de envoltura (env)

OMS Al menos dos bandas de envoltura

 -PRUEBA DE WESTERN BLOT: ESQUEMA DEL PRINCIPIO DE LA PRUEBA DE WESTERN BLOT

Sustrato

Enzima

Anticuerpo anti IgG

Anticuerpo IgG anti VIH

Antígenos VIH separados

gp120 gp41 p24

REPRESENTACION DE LOS RESULTADOS DE WESTERN BLOT

A Resultado Positivo: Reactivo a todos los antígenos del VIH
B Controles: Negativo y Positivo
C Muestras: Negativa – Positiva – Indeterminada

A B C
IV.- CUESTIONARIO
1. ¿Qué detectan las pruebas serológicas indirectas?
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
2. ¿Qué tipos de pruebas se utilizan como pruebas de screenning o tamizaje en el diagnóstico del
VIH?
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………

3. ¿Qué tipos de pruebas se utilizan como pruebas de confirmación en el diagnóstico del VIH?
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………

4. ¿Qué tipo de anticuerpo detecta la prueba de ELISA para VIH?

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………

5. ¿En qué medio se efectúa la electroforesis del antígeno de VIH?

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
 ELISA
GENERALIDADES
El sistema de inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) es un método analítico que
depende de la reacción Antígeno – Anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el
ptro en solución. Es una prueba cuantitativa y cualitativa.
TIPOS DE PRUEBAS DE ELISA
- Directa: para la detección de Antígenos
- Indirecta: para la detección de Anticuerpos
La prueba es método para diagnóstico serológico de enfermedades virales. Uno de los métodos aplicados
es el de captura de IgM, empleado para demostrar infecciones recientes. Se emplean inmunoglobulinas anti
IgM humana fijadas en las cavidades de los pozos de la placa, lo cual formará el complejo Ag-Ac por la unión
de la inmunoglobulina marcada con enzima peroxidasa. La cuantificación de la actividad enzimática se
realiza por la adición del sustrato produciendo coloración.

ELISA DE CAPTURA DE IGM (MAC-ELISA)

RESULTADO DE LA PRUEBA DE ELISA

LECTURA
A. LECTURA VISUAL:

a. El Control Positivo presenta color

b. El control negativo NO presenta color
c. Los C.C y C.S NO presentan color
d. Los pozos de CNAg NO presenta color.

B. LECTURA ESPECTOFOTOMÉTRICA:

El cálculo del valor de corte se hace utilizando los valores de las densidades ópticas de los controles
positivos y negativos

EJEMPLO: INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS EN LA DETERMINACION DE IgM ESPECIFICA

CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE
La presencia de IgM específica contra el virus del Dengue en una de muestra de suero significa que
esta persona se ha infectado recientemente con este virus. Los resultados negativos deben
interpretarse cuidadosamente. Una muestra tomada antes del 7mo día de iniciados los síntomas
puede resultar negativa. En este caso debe tomarse una segunda muestra o auxiliarse de otro
método diagnóstico. En las infecciones secundarias o terciarias la IgM puede estar en un porciento
bajo, en ese caso se debe usar otros métodos serológicos como la detección de IgG antivirus del
dengue.
 ELISA IG G

INTRODUCCIÓN
- Las muestras de los primeros 6 días de inicio de la enfermedad tienen un porcentaje variable
de falsos negativos debido al tiempo insuficiente para la detección de anticuerpo detectable
- Lo recomendable es el estudio de muestras pareadas osea una muestra de la fase aguda y
otra muestra del período convaleciente (con una diferencia de 7 a 10 días entre una y otra
muestra)
- Las muestras pareadas deben titularse para la interpreatción de los resultados. (cuantitativo)
- Un resultado Ig M no reactivo e Ig G reactivo se interpreta como una infección antigua

PRUEBA DE ELISA INDIRECTO IGG

IVAN LEON https://www.e-allscience.com/

MATERIAL
- Observar las placas de ELISA
- Ver Atlas: Esquema de ELISA IgM e IgG
CUESTIONARIO
1. EN QUE SE DIFERENCIA EL ELISA DIRECTO DEL INDIRECTO
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2. ¿ES DE UTILIDAD LA PRUEBA DE ELISA IG M PARA VIH? ¿POR QUÉ?

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BIBLIOGRAFÍA
- Guia de Prácticas de Microbiologia Médica 2014.
- INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. Manual de procedimientos para el diagnostico de las
Arbovirosis. 1996.
- MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE TECNICAS PARA EL DIAGNOSTICO DEL DENGUE.
Organización Panamericana de la Salud. 2002.
- Manual para el diagnóstico de laboratorio de la infección por los virus del sarampión y de la
rubéola. Organización Mundial de la Salud. Segunda edición. 2006.
 A- ELISA para Ig G (Ampliación de un pocillo)

   Sustrato

   Anti- Ig G

ligado a enzima

Anticuerpo Ig G (suero del paciente)

Antígeno viral

B- ELISA (enzyme linked inmunoabsorbent assay)

− Placa de ELISA
 VIRUS DENGUE-VIRUS FIEBRE AMARILLA

I. GENERALIDADES
La fiebre amarilla y el dengue son dos enfermedades virales metaxénicas de importancia en salud
pública, que pueden conllevar a la muerte. Estos virus son miembros de la familia Flaviviridae.
Trasmitidas por el mosquito Aedes aegypti.

VIRUS DEL DENGUE

El dengue es una enfermedad infecciosa causada por un virus, que es transmitido a los
humanos por la picadura del mosquito Aedes aegypti, vector más importante en el
hemisferio occidental. Este, es un efectivo vector de diversas arbovirosis, pero en la
actualidad su mayor importancia epidemiológica está ligada a su papel como transmisor
del dengue y la fiebre amarilla urbana.
Existen cuatro serotipos del virus del dengue: (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4). La primera
vez que una persona es contagiada por cualquiera de estos cuatro seeroripos adquiere el
dengue clásico y nunca volverá a padecer dengue por el mismo virus, pero sigue expuesta
a los demás serotipos. Si la persona vuelve a ser picada por un mosquito portador de uno
de los tres restantes virus, puede sufrir el dengue hemorrágico.
El Virus Dengue induce vasculopatía y coagulopatía, alterando los mecanismos de la
coagulación y la fibrinolisis. Además es hepatotrópico causando daño hepático. A. Las
manifestaciones hemorrágicas, pueden variar de leves a severas, presentándose como,
sangrados gingivales, sangrado digestivo, etc.
Los síntomas se presentan entre los 5 y 8 primeros días posteriores a la picadura y pueden
durar de 3 a 7 días, siendo los principales: Fiebre alta repentina, dolor intenso de cabeza,
espalda, coyunturasy ojos, náusea y vómitos; en algunos casos pueden presentar erupciones
de la piel en tronco, brazos y piernas asi como sangrado de la nariz o de encías.
Las técnicas empleadas para el diagnóstico de dengue es similar a otros virus, entre las
usadas tenemos al ELISA de captura Ig M e Ig G, Inmunofluorescencia, pruebas de
hemaglutinación, ya que algunos virus poseen proteínas en sus superficies capaces de
aglutinar eritrocitos de ciertas especies y pruebas moleculares, RT-PCR.
 VIRUS DE LA FIEBRE AMARILLA

La enfermedad es producida por un virus ARN, transmitida por mosquitos del género Aedes en el
caso de la Fiebre amarilla urbana (FAU) y por los géneros Haemagogus y Sabethes la Fiebre amarilla
selvática (FAS). Se señalan como principales reservorios, de la FAS, diferentes géneros de monos de
la región selvática de América del Sur (Alouatta sp, Aotus sp entre otros). La forma grave se
caracteriza por daño hepático, renal y miocárdico, así como hemorragias y tiene alta mortalidad.
Luego de que un individuo es picado por un mosquito infectado el periodo de incubación es de 3
a 6 días aproximadamente, la mayoría de las personas desarrollan la forma leve. Los principales
síntomas son: Fiebre, ictericia, malestar, cefalea, fotofobia, dolor lumbosacro y de extremidades
inferiores, mialgias, anorexia, náuseas, vómitos y mareos. También se ha reportado sangramiento
nasal y gastrointestinal (vómito negro).
La fiebre amarilla grave se caracteriza por insuficiencia hepática, falla renal, coagulopatía y shock.
Los pacientes que fallecen por fiebre amarilla presentan edema cerebral probablemente resultado
de la disfunción microvascular.
El diagnóstico se hace mediante la identificación de anticuerpos específicos para fiebre amarilla,
IgM e IgG. Se han desarrollado diferentes técnicas de ELISA de captura. La IgM aparece después de
la primera semana de iniciado los síntomas y su presencia constituye diagnóstico definitivo de
enfermedad. Estos anticuerpos pueden presentan reacción cruzada con otros flavivirus como
dengue y encefalitis. Otros métodos de diagnóstico serológicos incluyen fijación de complemento,
inhibición de la hemoaglutinación entre otras y pruebas moleculares altamente específicas como
RT-PCR.
 VIRUS DEL ZIKA

I. GENERALIDADES
El virus de Zika es un virus emergente transmitido por mosquitos que se identificó por vez primera
en Uganda, en 1947 en macacos de la India a través de una red de monitoreo de la fiebre amarilla
selvática. Posteriormente, en 1952, se identificó en el ser humano en Uganda y la República Unida
de Tanzanía. Se han registrado brotes de enfermedad por este virus en África, las Américas, Asia y
el Pacífico.
• Género: Flavivirus
• Vector: mosquitos Aedes (que habitualmente pican por la mañana y al
atardecer/anochecer)
• Reservorio: desconocido
Signos y síntomas: El periodo de incubación (tiempo transcurrido entre la exposición y la aparición
de los síntomas. Periodo prepatente) de la enfermedad por el virus de Zika no está claro, pero
probablemente sea de pocos días. Los síntomas son similares a los de otras infecciones por

arbovirus, entre ellas el dengue, y consisten en fiebre, erupciones maculopapulares, conjuntivitis,

mialgias, artralgias, malestar y cefaleas; suelen durar entre 2 y 7 días.

Posibles complicaciones del virus de Zika: Durante brotes de la enfermedad por el virus de Zika en
2013 en la Polinesia Francesa y 2015 en el Brasil, las autoridades sanitarias nacionales notificaron

potenciales complicaciones neurológicas y autoinmunes de la enfermedad del virus Zika.

Recientemente en Brasil, las autoridades sanitarias locales observaron también un aumento del

síndrome de Guillain-Barré coincidiendo con un brote de la enfermedad por el virus de Zika, así
como un aumento en los bebés que nacen con microcefalia en el noreste del país.

Transmisión: El virus de Zika se transmite a las personas a través de la picadura de mosquitos

infectados del género Aedes, y sobre todo de Aedes aegypti en las regiones tropicales. Este
mosquito es el mismo que transmite el dengue, la fiebre chikungunya y la fiebre amarilla.

Diagnóstico: La infección por el virus de Zika puede sospecharse a partir de los síntomas y los
antecedentes recientes (por ejemplo, residencia o viaje a una zona donde se sepa que el virus está
presente). Sin embargo, su confirmación requiere pruebas de laboratorio para detectar la presencia
de RNA del virus en la sangre u otros líquidos corporales, como la orina o la saliva.
Prevención: Los mosquitos y sus lugares de cría suponen un importante factor de riesgo de
infección por el virus de Zika. La prevención y el control dependen de la reducción del número de
mosquitos Aedes que son los vectores.
Tratamiento: La enfermedad por el virus de Zika suele ser relativamente leve y no necesita
tratamiento específico. Los pacientes deben estar en reposo, beber líquidos suficientes y tomar
analgésicos comunes para el dolor. Si los síntomas empeoran deben consultar al médico. En la
actualidad no hay vacunas.
 EL VIRUS DEL ÉBOLA
El virus del Ébola es un virus de la familia Filoviridae y género Filovirus, situación taxonómica que
comparte con el virus de Marburgo Es el patógeno causante de la enfermedad del Ébola, una
enfermedad infecciosa muy grave, que afecta tanto a seres humanos como otras especies de
mamíferos.

Este nombre proviene del río Ébola (en la República Democrática del Congo, antiguo Zaire), donde
fue identificado por primera vez en 1976 durante una epidemia con alta mortalidad.
Morfología
Tanto el virus del Ébola como el virus de Marburgo son virus pleomórficos (de morfología variable),
cuyos viriones suelen presentar formas filamentosas (de ahí su catalogación como "filovirus"; ver
imagen) que pueden alcanzar grandes longitudes (hasta 14 000 nm); sin embargo, presentan un
diámetro bastante uniforme (aproximadamente 80 nm).
El genoma del virus consiste en una molécula única de ARN
monocatenario lineal de polaridad negativa (19,1 kb) que tiene la
información codificada para siete proteínas estructurales que forman el
virión.
El virión está constituido por un nucleoide proteico con forma tubular
(20-30 nm de diámetro) rodeado por una cápsida helicoidal (40-50 nm),
recubierta a su vez por una membrana regularmente espiculada, su
envoltura viral, estructuralmente integrada por una única glicoproteína
viral.
El nucleoide está constituido por dos tipos de proteínas: la proteína NP,
cuya función es estructural, y la proteína L, una ARN polimerasa..
La cápsida se conforma por varias proteínas: proteína P, VP30 (proteína que le permite desdoblarse
dentro de una célula hospedadora), VP35, VP24 y VP40. Las proteínas VP24 junto con la VP40
forman una matriz que mantiene unidos el nucleoide con la cápsida (nucleocápsida viral).
Microscopía electrónica de un virión de Ebolavirus..
 CHIKUNGUNYA

El chikungunya (en idioma makonde)chikungunya, conocido además como «artritis

epidémica chikungunya» o «fiebre de chikungunya» es un virus del tipo Alfavirus que se
transmite a laspersonas mediante la picadura de los mosquitos portadores Aedes tanto
el Aedes aegypti como el Aedes albopictus. El virus se transmite de
manera similar a la fiebre del dengue y causa una enfermedad con
una fase febril aguda que dura de 2 a 5 días, seguido de un período
de dolores en las articulaciones de las extremidades; este dolor
puede persistir semanas, meses o incluso durante años en un
porcentaje que puede rondar el 12 % de los casos. La mejor forma
de prevención es el control general del mosquito, además, evitar las
picaduras de mosquitos infectados. Hasta la fecha no hay un
tratamiento específico, pero existen medicamentos que
se pueden usar para reducir los síntomas.7 El reposo y la ingesta de líquidos también pueden
ser útiles.

El chikungunya puede dar solo una vez. Después se desarrollan anticuerpos que se
encargarán de proteger a las personas enfermas y, de acuerdo con evidencias disponibles
hasta el momento, la inmunidad sería de por vida.

Erupción de un pie causada por el virus Chikunguya

 PRCATICA N°17

OTRAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

OBJETIVO
Los estudiantes conocerán los principios básicos del procedimiento y la utilidad de la técnica
Reacción en Cadena de la Polimerasa en el diagnóstico de infecciones causadas por virus.
Diferenciará los tipos de PCR y sus aplicaciones.

INTRODUCCIÓN
Además de las pruebas rápidas utilizadas y de las pruebas de Inmunofluorescencia utilizadas
como herramientas iniciales de tamizaje y/o diagnóstico de las infecciones virales, existen las
pruebas moleculares que detectan al antígeno viral. Por tener esta característica, son pruebas
muy específicas. La reacción en cadena de la polimerasa es probablemente la más implementada
en laboratorios de nuestro medio con este fin. El PCR puede ser una prueba útil en el diagnóstico
y en el seguimiento de la enfermedad. Además, según el tipo de PCR, la prueba puede ser
cualitativa o cuantitativa.
Estas pruebas son actualmente utilizadas en los protocolos de vigilancia epidemiológica y las
normas técnicas de atención de Dengue, VIH, Virus Respiratorios, Influenza, por el Ministerio de
Salud. (1) (2) (3) (4) (5)
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos. En cada uno de estos
ciclos, la secuencia blanco del ADN es copiada. Esta reacción es facilitada por la enzima ADN
polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. Cuando
utilizamos como sustrato ADN genómico, esto corresponde a una prueba típica de PCR. Cuando
utilizamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero),
entonces a este tipo de PCR se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR). (6)
El PCR no tiene como unico fin el diagnostico de enfermedades. Se realiza además para clonaje
de genes, secuenciamiento genético, estudio de enfermedades hereditarias, cuantificación del
RNA, estudios forenses, entre otros.

MATERIALES
La práctica es demostrativa.

PROCEDIMIENTO
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR: polymerase chain reaction) es una técnica de
amplificación de secuencias de ADN in vitro.
Los materiales prinicpales son:
a- ADN objetivo (el que se quiere amplificar)
b- ADN Polimerasa (Taq polimerasa)
c- Primers u oligonucleótidos
Etapas del PCR:
A. DESNATURALIZACION: En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se
separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas
temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura
disminuya. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como
templado para el siguiente paso.

B.

C. HIBRIDACIÓN: En el segundo paso los primers se alinean a las zonas 3´ del templado
previamente separado y se hibridan con la secuencia complementaria que se desea
amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C). Se forma el
complejo templado-primers.

A. ELONGACIÓN O EXTENSIÓN: En la tercera etapa se produce la síntesis de una cadena

sencilla en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los
deoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Al final del
ciclo se han formado los amplicones.

Al cabo del primer ciclo el ADN en estudio se ha duplicado y el doble de su cantidad original se
encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado del
procesamiento de esta “reacción” en numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación
geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Este proceso se lleva a cabo en un
equipo llamado termociclador. Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas
programadas de forma exacta.
RESULTADOS

Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son
visualizados y analizados através de una electroforesis en geles de agarosa. La visualización de
los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento del PCR a tiempo real?

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2. ¿Cuál es la diferencia entre PCR cualitativo y PCR cuantitativa?

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3. ¿Cuáles tipos de PCR se utilizan para el diagnóstico y monitoreo de los pacientes con VIH?

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4. Elabore un algoritmo diagnóstico de las pruebas de laboratorio que se realizan para el Dengue
y Virus Respiratorios, ubique en ellos cuándo se realiza la prueba PCR.
HEMOAGLUTINACIÓN POR VIRUS

. DEFINICIÓN

Este fenómeno fue descrito por primera vez por Hirst en 1941, quien observo en un
embrión de pollo la aglutinación de glóbulos rojos en un vaso sanguíneo roto, mientras
realizaba pases de virus de influenza en el líquido alantoideo.
Hirst reconoció la importancia de este hallazgo y describió la hemoaglutinación como un
método para ensayo de virus.
Se denomina aglutinación a la interacción in vitro de un antígeno particulado (por lo
general células) con su anticuerpo específico.
Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos
de mamíferos y aves, debido a las proteínas que poseen en su capa externa Esta
hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para facilitar la identificación de un
virus desconocido.

. VIRUS HEMOAGLUTINANTES
Son microorganismos hemoaglutinantes los ortomixovirus y paramixovirus, alfavirus,
flavivirus y bunyavirus, así como algunos adenovirus, reovirus, parvovirus, y coronavirus.
Familia Género o especie Eritrocitos
Adenoviridae La mayoría de las Mono y/o rata, 37°C
Poxviridae especies Pollo, 37°C
Parvoviridae Ortopoxvirus Cobayo, hámster, cerdo, humano, mono,
La mayoría de las 4°C.
Togaviridae especies Ganso, paloma, pollito; pH y temperaturas
Flaviviridae críticos.
Orthomyxoviridae Alfavirus Pollito, humano, cobayo, 4°C.
Paramyxoviridae Flavivirus Pollito, humano, cobayo, 4°C.
Influenza A
Coronaviridae Parainfluenza Rata, ratón, pollito.
Bunyaviridae Enfermedad de Ganso; pH crítico.
Rhabdoviridae Newcastle Ganso, 4°C.
Reoviridae Varias especies Humano
Varias especies
Rabia
Reovirus
Rotavirus
Otros virus que sabemos que causan hemaglutinación son papovavirus, adenovirus,
poxvirus, togavirus , reovirus, coronavirus, enterovirus, y rhabdovirus. La hemaglutinina
en estos virus es una parte integral del virión, pero en poxvirus es separable del virión
intacto.
. MECANISMO DE HEMOAGLUTINACIÓN Y HEMOADSORCIÓN.
La actividad enzimàtica de las proteínas virales (hemaglutininas) produce
hemaglutinaciòn en la cual los eritrocitos se unen por medio de puentes. Se ha
demostrado que el glóbulo rojo contiene cerca de 300 sitios en los cuales se puede
adsorber un virus.
Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que los capacitan para aglutinar
glóbulos rojos de varias especies. En influenza y algunos paramixovirus, la
hemaglutinación de la superficie, que es una glucoproteína, se fija al glóbulo rojo que
posee receptores complementarios.
Elusión es la liberación del virus. El virus produce elusión sobre el glóbulo rojo a 37° C
debido a la destrucción del ácido neuramínico en sus receptores por la neurominidasa
del virión, El virus eluido puede aglutinar un glóbulo rojo fresco, pero éste, una vez eluido
ya no puede ser aglutinado por la misma especie de virus, debido a la pérdida de sus
receptores. Sin embargo el glóbulo rojo eludido puede ser aglutinado por el virus de la
influenza y algunos paramixovirus. Sobre esta base, estos virus han sido dispuestos o
incluidos en una serie llamada el “gradiente de receptor”. Las enzimas destructoras de
receptor producidas por Vibrio cholerae y otras bacterias impiden la aglutinación de
glóbulos rojos susceptibles por mixovirus.
REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN PARA VIRUS

Al neutralizar al virus invasor, los anticuerpos son capaces de impedir que se

produzca una infección. Aunque probablemente las vacunas son capaces de
inducir otro tipo de respuestas inmunes -además de los anticuerpos- que
también pueden desempeñar un papel en la protección, en la mayoría de los
casos se necesitan los anticuerpos para que la vacuna sea eficaz.
Se está trabajando en el desarrollo de vacunas contra el VIH que induzcan
la generación de anticuerpos neutralizantes capaces de inactivar una gran
proporción de las variantes del virus en circulación. Ninguna de las
candidatas a vacuna contra el sida probadas hasta ahora ha tenido éxito en
la inducción de respuestas de los denominados anticuerpos ampliamente
neutralizantes contra el VIH. No obstante, los recientes resultados de un
ensayo de eficacia que contó con 16.000 personas en Tailandia (conocido
como RV144), evidenció que dos candidatas a vacuna administradas de
forma secuencial en lo que se denomina un régimen de inducción-refuerzo,
redujo el riesgo de infección por VIH en un 30%, en comparación con
un placebo inactivo. Se trata de la primera prueba de eficacia de una
candidata a vacuna contra el sida.

El mecanismo

Para que se produzca la ADCC, un anticuerpo actúa como puente entre las
células infectadas por VIH y otras células inmunitarias capaces de
destruirlas. El mecanismo de la ADCC requiere que las puntas de la ‘Y’ del
anticuerpo se unan a una célula con VIH. El otro extremo del anticuerpo
debe unirse a unas proteínas presentes en la superficie de otras células
inmunes, que pueden matar a las células con VIH y evitar que produzcan
más virus.
Aunque es posible que la ADCC contribuya a la protección conseguida por
algunas de las vacunas que se utilizan hoy en día, hasta ahora no se ha
comprobado que éste sea el único mecanismo de protección de ninguna
vacuna. En la investigación del cáncer, ADCC ha evidenciado desempeñar
un papel importante en la actividad de los anticuerpos terapéuticos
administrados para tratar la dolencia.
También hay algunas pruebas que sugieren que la ADCC puede estar
implicada en el control del VIH en personas con el virus. Se ha descubierto
que los niveles de actividad ADCC son mayores en los pacientes conocidos
como ‘controladores de élite’, personas que tienen VIH, pero son capaces
de controlar el virus sin necesidad de la terapia antirretroviral. Se están
estudiando ahora los anticuerpos en los controladores de élite para ver en
qué se diferencian de los presentes en otras personas con VIH que no
pueden controlar el virus. Con el tiempo, estos estudios podrían resultar
en la identificación de marcadores específicos en los anticuerpos que
permitirían dilucidar qué tipos de anticuerpos participan en la ADCC. Esta
información podría utilizarse entonces para desarrollar vacunas capaces de
inducir dichos anticuerpos.