APLICACIONES

CROMATOGRAFICAS

Msc. RENE JESUS BALDIVIESO SAENZ

Nomenclatura y términos en cromatografía
 EJEMPLO

◼ Las sustancias A y B tienen tiempos de retención de 16.40 y de 17.63 minutos,

respectivamente, en una columna de 30.0 cm.
◼ Una especie que no es retenida pasa por la columna en 1.30 minutos. Las anchuras de pico
(en la base) para A y B son 1.11 y 1.21 minutos, respectivamente.
◼ Calcule a) la resolución de la columna;
◼ b) el número de platos promedio de la columna;
◼ c) la altura de plato;
◼ d) la longitud de la columna necesaria para conseguir una resolución de 1.5;
◼ e) el tiempo necesario para que la sustancia B eluya en la columna que da un valor de Rs de
1.5 y
◼ f) la altura de plato necesaria para obtener una resolución de 1.5 mediante la columna
original de 30.0 cm y en el tiempo que se da en un principio.
El problema general de la elución
La figura muestra unos cromatogramas para una mezcla de seis componentes que difieren
ampliamente en sus constantes de distribución y, por tanto, en sus factores de retención.
En el cromatograma a), las condiciones se han ajustado de tal forma que los factores de
retención de los componentes 1 y 2 (k1 y k2) están en el intervalo óptimo de 1 a 5. Sin embargo,
los factores de los otros componentes están muy alejados del intervalo óptimo.
Por consiguiente, las bandas que corresponden a los componentes 5 y 6 aparecen tras un
tiempo desmesurado; además, están tan ensanchadas que puede ser difícil identificarlas sin
equivocarse. En el cromatograma b), al cambiar las condiciones para mejorar la separación de
los componentes 5 y 6, los picos de los cuatro primeros componentes se agrupan de tal modo
que su distinción es insatisfactoria. Sin embargo, el tiempo de elución resulta ideal.
Análisis cualitativo
Un cromatograma proporciona sólo un elemento de información cualitativa acerca de cada una de las especies de
la muestra, a saber, su tiempo de retención o su posición en la fase estacionaria después de cierto periodo de
elución. Por supuesto que a partir de cromatogramas obtenidos con diferentes fases móviles y estacionarias y a
diversas temperaturas de elución se puede obtener más información. A pesar de todo, la cantidad de información
que se obtiene mediante la cromatografía es pequeña comparada con la que proporciona un solo espectro IR, de
resonancia magnética nuclear o de masas.
 ANÁLISIS CUALITATIVO
5. Aplicaciones de la cromatografía

Disolución estándar
Señal analítica

F1

La muestra no contiene
CH4 Octano Nonano Decano
metano ni octano.
Tiempo
Si los contiene será a
Muestra concentraciones inferiores
a los correspondientes
Señal analítica

límites de detección
CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?

Tiempo

Identificación positiva: - Comparación de datos de retención

- Uso de detectores en línea
8
 Análisis cuantitativos
• Altura del pico: su principal ventaja es la simplicidad y rapidez de los
cálculos al efectuar la cuantificación. Las desventajas son la mayor
variabilidad de la altura con respecto al área del pico, y la perdida de
información cuando el pico se sale de la escala. La sobrecarga de la
columna altera todos los tipos de integración, pero en este caso es mas
significativo el deterioro de la cuantividad.

• Área de pico: su empleo se basa en el hecho de que la concentración de un

componente en la muestra es directamente proporcional a su área. La
determinación por área de pico es independiente de los efectos de
ensanchamiento. Por lo tanto es el parámetro analítico mas adecuado para
realizar el análisis cuantitativo. Los programas de computo actuales permiten
obtener resultados bastante exactos de forma independiente de la simetría
del pico
Conceptos - Curso RO / Feb. 2003
Análisis basados en la altura del pico
La altura de un pico cromatográfico se obtiene al unir las líneas base a cada lado del pico con una línea recta
y midiendo la distancia vertical desde esta línea hasta el pico. A menudo, esta medición se puede hacer con
una precisión razonablemente buena. Sin embargo, es importante considerar que las alturas de pico están
relacionadas de manera inversa con sus anchuras.

Análisis basados en las áreas de los picos

Las áreas de los picos son independientes de los efectos de ensanchamiento debido a las variables que
se mencionaron en el párrafo anterior. Desde este punto de vista, por tanto, las áreas son un parámetro
analítico más adecuado que la altura del pico. Por otra parte, las alturas de los picos se miden con más
facilidad y, en el caso de picos estrechos, se determinan con mayor exactitud. No obstante, las alturas de
los picos se ven afectadas por los cambios en el tiempo de retención o la eficiencia de la columna en
tanto que las áreas de los picos no. Por tanto, las áreas de los picos son el método de cuantificación
preferido. Los instrumentos cromatográficos más modernos están equipados con computadoras o con
integradores electrónicos digitales, los cuales permiten un cálculo preciso del área del pico.
 Cuantificación cromatografica.
• Disponer de patrones adecuados
• Cromatograma reproducibles.

• mi = Ki* Ai
• mi = masa del compuesto inyectado en la columna.
• Ki = factor de respuesta absoluta del compuesto i.
• Ai = área del pico de elución del compuesto correspondiente al compuesto i

Métodos de cuantificación
• Estándar o patrón externo
1. Estándar o patrón
externo.
2. Curva analítica o
calibración.
3. Adición de estándares
4. Estándar interno
Calibración y patrones

El método requiere la preparación de una serie de soluciones patrón externo de composición parecida
a la de la muestra. A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se grafican las
alturas o áreas del pico en función de la concentración.
La gráfica de los datos debería originar una línea recta que pase por el origen del sistema coordenado;
las determinaciones se basan en esta curva de calibración.
Para una mayor exactitud es necesaria una recalibración frecuente. Al utilizar este método, la fuente
de error más importante en los análisis es por lo regular la incertidumbre en el volumen de la
muestra. A menudo, las muestras son pequeñas (1 μL) y la incertidumbre asociada con la inyección de
un volumen reproducible de este tamaño con una microjeringa puede alcanzar cierto porcentaje
relativo, tal vez de varias unidades. La situación es más difícil en la cromatografía de gases porque la
muestra se ha de inyectar en una vía de acceso para la muestra, la cual está caliente; en este caso, la
evaporación en el extremo de la aguja puede conducir a una gran variación del volumen inyectado.
Los errores relativos en el volumen de muestra se pueden reducir a un 1 o 2% usando tomadores de
muestra automáticos o una válvula rotatoria para la muestra.
5. Aplicaciones de la cromatografía
ANÁLISIS CUANTITATIVO

Área
Altura, h

Señal analítica
Fig.1

tm tr Tiempo

MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO

1. Calibración con patrones
Preparación de disoluciones patrón 0,4

Área de pico, s
0,3

0,2

Obtención de sus cromatogramas 0,1

0,0
0 5 10 15 20 25 30
-1
15
Concentración, ng ml
• Curva analítica o calibración.
•
y = 0.4846x + 0.0689
CURVA 1 R² = 0.9765
Series1 Linear (Series1) Linear (Series1)
0.9

0.8
0.8199
0.7

0.6

0.5
Area

0.4894
0.4

0.3 0.3523

0.2
0.2196
0.1

0
0.0383
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Concentracion
El método del patrón interno
La mayor precisión en cromatografía cuantitativa se consigue con el uso de
patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres asociadas a la
inyección de la muestra. En este procedimiento se introduce en cada patrón y
en la muestra una cantidad cuidadosamente medida de una sustancia patrón
interno, y la relación del analito con las áreas (o alturas) del pico del patrón
interno sirve como variable analítica. Para que este método sea satisfactorio, es
necesario que el pico del patrón interno esté bien separado de los picos de los
demás componentes de la muestra (Rs 1.25); por otra parte, el pico del patrón
interno debería aparecer cerca del pico del analito. Con un patrón interno
adecuado, se pueden conseguir precisiones relativas mejores que uno por
ciento.
.
 0,35

Area de pico/Area del estándar interno

5. Aplicaciones de la cromatografía 0,30

0,25

B. Método del estándar interno 0,20

0,15

0,10
Se añade a disoluciones
0,05
patrón y a muestras
0,00
0 10 20 30 40 50 60

Concentración, ng ml-1
Analito 1
Señal analítica

Estándar
interno Analito 2

Tiempo
Fig.1

18
Adición de estándares
Estándar o patrón interno: factores de respuesta relativos
El método de normalización de áreas

Otro procedimiento que evita las incertidumbres asociadas con la inyección

de la muestra es el método de la normalización de las áreas. Es necesario
que se produzca la elución completa de todos los componentes de la
muestra. En el método de normalización se determinan las áreas de todos los
picos eluidos; tras corregir dichas áreas respecto a las diferencias en la
respuesta del detector a los distintos tipos de compuestos, se calcula la
concentración del analito a partir de la relación de su área con el área total de
todos los picos.
El siguiente ejemplo ilustra el procedimiento.
El método de normalización de áreas se aplicó para la determinación de los alcoholes butílico normal,
secundario, isobutílico y tercbutílico. Con la finalidad de obtener el factor de respuesta relativa de los
alcoholes se preparó una solución patrón de los alcoholes y se observó el cromatograma de gases. Los
resultados fueron los siguientes:

Los factores de respuesta relativa se obtuvieron al dividir

los datos de la columna 5 entre 8.141 que es el primer
dato de la misma columna. Para una muestra que
contiene sólo los cuatro alcoholes se obtuvieron los
siguientes datos de área en la segunda columna de la
tabla siguiente. Calcule el porcentaje en peso de cada
alcohol presente en la muestra.
Conceptos - Curso RO / Feb. 2003
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