SIGLAS

*green cardamom essential oil (CEO)

*gas chromatography equipped with mass spectrometer (GC– MS)

cromatografía de gases equipada con espectrómetro de masas
*Tryptic Soy Broth Caldo de soja tríptico (TSB)

*the minimum inhibitory concentration (MIC)

*extracto libre de nitrógeno (ENF)

DUDAS
Chromobacterium violaceum es una bacteria gramnegativa anaeróbica facultativa (crece
tanto en presencia como en ausencia de oxígeno), que habita en el suelo y el agua de las
áreas tropicales y subtropicales

Produces beta-lactam antibiotic

*all the reagents and standards used for analytical purposes were HPLC grade.

* índice de Kovats

El índice de Kovats es un índice de retención que describe el comportamiento de retención de un

compuesto de interés comparativamente al de una mezcla de hidrocarburos saturados, alcanos,
de diferentes números de carbono. El índice de Kovats expresa el número de átomos de carbono
multiplicado por 100, de un alcano hipotético de cadena normal que tendría un tiempo de
retención ajustado idéntico al del pico de interés cuando es analizado sobre condiciones idénticas.

INTRODUCCIÓN
TRATAMIENTOS
(tratamientos para la muestra de CEO)

Obtención de materias primas

El cardamomo verde se compró en un mercado local. Los frutos de cardamomo se limpiaron y

luego se molieron hasta obtener un polvo fino. El polvo resultante se empaquetó en un frasco de
vidrio hermético y se almacenó en condiciones ambientales para su posterior análisis. En el
estudio actual, todos los reactivos y estándares utilizados con fines analíticos eran de grado HPLC.
Análisis proximal de polvo de cardamomo

Análisis proximal de polvo de cardamomo

La composición química del polvo de cardamomo se llevó a cabo utilizando métodos estándar de
(AOAC2006). El análisis incluye:

 la estimación de la humedad
 la proteína bruta
  la grasa bruta
 la fibra bruta
 la ceniza sobre la base del peso seco

Caracterización y cuantificación de constituyentes de aceites esenciales mediante GC-MS

Las muestras de aceite esencial de cardamomo se diluyeron en terc-butil-metil-éter (10µL/mL) y se

analizaron mediante cromatografía de gases equipada con espectrómetro de masas (GC-MS),
Shimadzu GC 2010 Plus y GCMS-TQ8040.

Un microlitro (1µL) de solución se inyectó con un muestreador automático (AOC 6000), la

temperatura de entrada fue de 220 °C, en un Shimadzu SH-Rxi-5Sil MS (30 m de largo, 0.25 mm DI,
0.250µm Película) columna.

El programa de temperatura se fijó en:

35 °C 4 min

20 °C/min

250 °C 10 min

mientras que el flujo constante de helio se fijó en 1 ml/min.

Las identificaciones individuales se realizaron comparando sus espectros con los de las bibliotecas
de espectros de masas y la identidad de cada componente se confirmó mediante la comparación
de su índice de Kovat con los de la literatura (Adams2005). Cada componente se enumeró en
orden de elución de la columna SH-Rxi-5Sil MS (equivalente DB5). Los porcentajes relativos se
calcularon usando el detector MS por integración de picos sin calcular el factor de respuesta del
detector.

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano

Las cepas bacterianas sensoras utilizadas fueron:

 Listeria monocytogenesscott a
 estafilococo aureusATCC 29213
 Streptococcus mutansATCC 33402
 Escherichia coli O157:H7
 Bacillus cereus
 Salmonella entéricasubesp
 TyphimuriumJSG 1748
 Pseudomonas aeruginosaATCC 14213
 Candida albicansATCC 11006

Las cepas se cultivaron en Tryptic Soy Broth (BD Difco, EE. UU.) y se cultivaron durante 18–24 h a
37 °C con agitación

 Cromobacterium violaceumATCC 12472 se utilizó para determinar la inhibición de

detección de quórum del aceite esencial de cardamomo.
La cepa se inoculó en Miller Luria-Bertani Broth (Acros Organics, Bélgica) y se cultivó durante 24 h
a 27 °C.

(tratamientos)

Ensayo de difusión en disco

La prueba de difusión en disco se realizó de acuerdo con las Normas de desempeño para pruebas
de susceptibilidad antimicrobiana en disco (CLSI) con ligeras modificaciones (CLSI2012).
1. Las cepas bacterianas cultivadas durante la noche se diluyeron 1:100 con los medios
frescos correspondientes para producir aproximadamente 10 6 UFC/mL.
Esto fue verificado por el método de conteo de placas (plate counting method)
2. Se saturó un aplicador con punta de algodón estéril (Pur-Wraps, EE. UU.) con suspensión
bacteriana y se secó por la pared de los tubos, luego se pasó el agar en tres direcciones
diferentes.
3. Se saturó un disco en blanco con compuestos antimicrobianos y se colocó sobre la
superficie del agar.
4. Finalmente, las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C en condiciones aerobias.
5. Los radios de las zonas de inhibición se midieron en milímetros (mm) con un calibrador
digital (Fischer Scientific, Pittsburg, PA, EE. UU.) desde el borde del disco hasta el borde de
la zona de inhibición.

Determinación de las concentraciones inhibitorias mínimas utilizando un ensayo de

microdilución en caldo

El ensayo de microdilución en caldo se realizó de acuerdo con las pautas (CLSI2007) con
modificaciones menores.

1. Las reservas congeladas de bacterias se inocularon en caldo de soja tríptico (TSB) (Remel,
EE. UU.) y se incubaron a 37 °C durante 24 h para obtener *10 9UFC/mL.
2. El número de UFC se confirmó mediante el método de placa puntual (spot plate method) y
el recuento de células.
3. El cultivo bacteriano se diluyó (1:1000, v:v) en medio de caldo fresco para lograr
*106UFC/mL.
4. El día del experimento, el aceite esencial de cardamomo (SigmaAldrich, Alemania) se
disolvió primero en etanol (95 %) para obtener una concentración de 100 mg/mL y luego
se diluyó más en TSB.
5. Se realizaron diluciones seriadas de compuestos antimicrobianos que oscilaron entre 20 y
0.151 mg/mL en microplacas de 96 pocillos para determinar el valor de la concentración
mínima inhibitoria (MIC).
6. Se agregaron 100µL de muestras de suspensión bacteriana diluida se pipetearon a 100µL
de cada dilución de antibacteriano que tenga cierta concentración de aceite esencial de
cardamomo.
 7. Se añadieron setenta microlitros de aceite mineral a cada pocillo de la placa de 96 pocillos
para evitar la evaporación de la mezcla durante la incubación.
8. Las mezclas se incubaron durante 24 h aeróbicamente dentro de un lector de microplacas
(SmartSpecTM 3000).
9. Después del tiempo de incubación, los valores de MIC de los antimicrobianos se evaluaron
tomando la lectura de la curva de crecimiento cinético a la densidad óptica (OD595).
10. Se usó Tryptic Soy Agar (Remel, EE. UU.) para la enumeración y el cultivo de bacterias.
11. La curva de crecimiento cinético se calculó estadísticamente tomando lecturas a las 24 h.

muestras de suspensión bacteriana diluida

Ensayo inhibidor de detección de quórum

Este ensayo se realizó de acuerdo con Zhu et al. (2011) con modificaciones menores.

1. C. violaceum se inoculó en Miller LuriaBertani Broth (LB) y se incubó durante la noche a 27

°C durante 24 h.
2. El cultivo de toda la noche se diluyó 1:1000 con LB para obtener una concentración de
106UFC/mL.
3. El aceite esencial de cardamomo verde se disolvió en etanol (95%) y se diluyó en LB para
obtener una concentración de 10 mg/mL.
4. La solución madre se diluyó en serie con LB utilizando una microplaca de 48 pocillos.
5. 500µL de dilución bacteriana (106CFU/ml) se añadieron por separado a cada pocillo de la
microplaca que contenía 500µL de cierta concentración de aceite esencial
6. la placa se incubó de 24 a 28 h a 27 -C.
7. Después de la incubación, se centrifugó 1 mL de cada pocillo a 8000xg durante 5 min y se
descartó el sobrenadante.
8. el sedimento se resuspendió en 1 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se agitó durante 2
min.
9. La muestra se centrifugó nuevamente a 8000xg durante 5 min.
10. 200µ de alícuotas se añadieron a los sobrenadantes a una placa de 96 pocillos y se midió
la absorbancia a la DO595nm utilizando el lector de placas.
11. Para confirmar que el cardamomo inhibe el QS sin influir en la actividad de crecimiento
bacteriano, el sedimento que contenía células bacterianas se resuspendió en 1 ml de agua
estéril, se agitó vigorosamente y se midió la densidad óptica en OD595nm utilizando un
lector de placas. Los experimentos se repitieron dos veces por duplicado.
VARIABLES RESPUESTA

Análisis proximal de polvo de cardamomo

Los resultados demostraron que las muestras poseían un porcentaje de:

humedad 8.22±0,34
proteína bruta 12,17±0,48
grasa cruda 1.62±0,11
fibra cruda 11,38±1,95
ceniza 7,74±0,94 y
ENF 58,89±3,22 (extracto libre de nitrógeno)

Caracterización y cuantificación de constituyentes de aceites esenciales mediante GC-MS

Se identificaron veintiséis compuestos bioactivos a través del análisis GC-MS enumerados
en la Tabla1, que representa el 99,01% del aceite esencial de cardamomo. Se encontró
que los principales componentes bioactivos eran a-acetato de terpinilo (38,4 %), 1,8-cineol
(28,71 %), acetato de linalool (8,42 %), sabineno (5,21 %) y linalool (3,97 %).
Tabla 1Composición química del aceite esencial de cardamomo verde (E. cardamomo)

Ensayo de difusión en disco

Los resultados explicaron un grado variable de actividad antimicrobiana del aceite esencial contra
diferentes cepas de sensores bacterianos.

C. albicans (hongo) y Streptococcus mutans fueron microorganismos más sensibles (al compuesto
antimicrobiano) tienen zonas máximas de inhibición 11.6±0,56 mm y 11,4±0,55 mm (halo grande)

Seguido de S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus y S. typhimurium con 9.8±0.20, 9.8±0.17,

8.1±0.15 y 5.7±0.20 mm, respectivamente.
P. aeruginosafue la cepa más resistente, el aceite esencial de cardamomo no mostró ningún efecto
inhibidor y no pudo suprimir su crecimiento.

Concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) del aceite esencial de cardamomo verde (GCEO)
Fig. 1 La inhibición mínima concentración de GCEO contra Salmonella entérica subsp.
Typhimurium JSG 1748

Fig. 2 The minimal inhibitory concentration of GCEO against Streptococcus mutans ATCC 33402
Fig. 3La concentración inhibitoria mínima de GCEO contra estafilococo aureus ATCC 29213

Inhibición de la detección de quórum (QS) por el aceite esencial de cardamomo verde (GCEO)
Las concentraciones probadas 0.625 y 0.313 mg/mL inhibieron la producción de violaceína con
muy poco efecto sobre el crecimiento de C. violaceum (Higo.5).

C. violaceum,se utilizó como indicador biológico para determinar la inhibición de detección de

quórum de bacterias Gram negativas.
Los resultados se representaron como inhibición de QS (positivo) cuandoC. violaceum no es capaz
de producir pigmento violeta (violaceína) y si se produce violaceína, decimos que no hay inhibición
de QS (negativa).
Debido a la naturaleza diversa del aceite esencial de cardamomo, ciertos componentes bioactivos
que se encontraron tanto como constituyentes principales como secundarios causaron la
inhibición de QS.
Los resultados mostraron una inhibición de la detección de quórum con concentraciones que eran
más bajas que los valores revelados de MIC.

Las concentraciones probadas 0.625 y 0.313 mg/mL inhibieron la producción de violaceína con
muy poco efecto sobre el crecimiento de C. violaceum (Higo.5). Sin embargo, 1,25 mg/mL mostró
una inhibición de QS de más del 90% pero con una inhibición del crecimiento bacteriano en
comparación con el control positivo (células bacterianas sin GCEO). La inhibición de QS es
importante para reducir la producción de factores de virulencia liberados por microorganismos
patógenos. Se evidenció que ciertos compuestos derivados de plantas de muchos aceites
esenciales de plantas pueden interrumpir la expresión del quórum a través de la inhibición de la
síntesis de peptidoglicanos, cambiando las estructuras de la membrana microbiana o regulando el
QS, lo que podría influir en la formación de biopelículas (Niu y Gilbert2004). Se han descrito
bastantes mecanismos para inhibir QS, incluida la inhibición de la detección de señales,
bloqueando la producción de moléculas de señalización utilizando inhibidores de detección de
quórum (QSI). El primer QSI descrito fue