EFECTO DE EXTRACTOS ETANOLICOS Y ACEITES ESENCIALES DEL

OREGANO SILVESTRE (Lippia origanoides H.B.K.) Y MATARRATON

(Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) EN EL CONTROL DE LA GARRAPATA
COMÚN DEL BOVINO Rhipicephalus microplus (ACARI: IXODIDAE)

METODOLOGÍA

Elaboración de extracto de orégano silvestre (Lippia origanoides H.B.K.) Y

matarratón (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers)

La obtención de los EE se realizará utilizando la metodología recomendada por

Marcano y Hasegawa (2002). El material vegetal para la obtención del EE consistirá en
4 Kg de hojas frescas, aparentemente sanas y plenamente desarrolladas de orégano
silvestre y matarratón, las cuales se colectaran, en el primer caso de plantas silvestres
localizadas en el Parque Nacional Terepaima, específicamente en terrenos aledaños al
Decanato de Ciencias Veterinaria de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado
(UCLA) y en el segundo, de plantas ubicadas en la Estación Experimental Dr. Manuel
Salvador Yépez “El Torrellero, finca perteneciente a la UCLA. Una vez en el
Laboratorio de Microtecnia e Histopatología Vegetal del Posgrado de Agronomía, las
hojas se colocaran, por separado, en sacos de malla, para favorecer la ventilación y
facilitar el secado y se cuelgan en cobertizo, para evitar la luz. Transcurridas 2 semanas,
serán molidas en molino industrial y el polvo resultante se pesa, obteniéndose un valor
inicial en Kg.
Para macerar el polvo obtenido de las hojas, el mismo se coloca en tobos de plástico con
etanol al 96%, en una proporción de 1Kg de material vegetal molido/10 L de etanol,
ésta mezcla se deja reposar por 2 semanas. El líquido será filtrado utilizando una gasa
de cuatro capas y concentrado en un sistema de secado rotatorio al vacío (roto-vapor
Brinkmam MR, Mod. RE111) a 100°C. El extracto crudo concentrado obtenido, luego
de la evaporación del agua y etanol, será recuperado utilizando el sistema de secado
rotatorio y almacenado a 8 ° C hasta la evaluación de las propiedades acaricidas, se
guarda en un envase protegido de la luz, bajo refrigeración, hasta el momento de la
aplicación de los tratamientos.

Extracción del aceite de orégano

Para la obtención del AE del orégano se usan hojas molidas y secas, se colocan en un
equipo de destilación. Inicialmente se obtiene el aceite + agua, concentrándose el
primero en la parte superior de la mezcla, posteriormente, una vez terminado el proceso
de destilación, se separan ambos líquidos con la ayuda de un embudo de separación. El
aceite resultante se guarda en viales, protegido de la luz directa y bajo refrigeración. En
el caso del matarratón no se obtiene aceite esencial, según ensayos previos con esta
planta.

Determinación y cuantificación de metabolitos secundarios (MS) en extractos

etanólicos de orégano silvestre (Lippia origanoides H.B.K) y matarratón (Gliricidia
sepium (Jacq.) Walpers) por cromatografía en sílica gel.

a. Determinación cualitativa.

Utilizando cromatofolios de silica gel (TLC 60 F254) cortados a 6,5 x 2,5 cm; con la
ayuda de una micropipeta se adicionan 10 µL de los EE de ambas plantas distribuidos
en 2 gotas a 1 cm de uno de los extremos del cromatofolio (Marcano y Hasegawa,
2002).

i. Alcaloides.

Se prepara la mezcla de solvente utilizando n-butanol+ ácido acético + agua a una

proporción de 9:2:1. Se agrega el solvente en la cámara para cromatografía, dejando
correr el solvente hasta que ascienda 0.5 cm antes del extremo final del cromatofolio. Se
revela la presencia del MS bajo lámpara de luz UV, la presencia de coloración
fluorescente-naranja es indicio positivo para este grupo de metabolitos.

ii. Flavonoides.

Dentro de la cámara para cromatografía se adiciona el solvente, el cual contiene una

mezcla de benceno + ácido acético + agua en una proporción 12:7:2. Se colocan los
cromatofolios dejándolo correr hasta 0.5 cm antes del extremo. Revelado bajo lámpara
UV, el indicativo de la presencia estos MS sería la aparición de una coloración blanca-
verdosa.

iii. Fenoles.
Para la determinación de fenoles se prepara el solvente, mezclando agua + ácido
acético a una proporción de 9:1. Colocando los cromatofolios en la cámara de
cromatografía, se dejan igualmente correr hasta 0.5 cm antes del final de la placa. Se
realiza el revelado con una solución de cloruro férrico al 1%, la aparición de una
coloración parda oscura es el indicativo de la presencia de estos MS en el cromatofolio.
Todo el procedimiento se hace dentro de la campana de flujo laminar.

iv. Saponinas.

Se diluyen 5 ml del EE en 5 ml de agua destilada, manteniendo una relación 1:1, se

agita vigorosamente durante 1 min. Posteriormente, ocurre la formación de espuma y si
ésta es persistente durante 15 minutos, se considera positiva la prueba para este grupo
de MS.

v. Aceites esenciales.

Se determina por los aromas característicos que le proporcionan este grupo de MS al

extracto etanólico.

b. Determinación cuantitativa.

Para la cuantificación se utiliza la metodología planteada por Vásquez et al. (2008) se

utilizan los mismos cromatofolios usados en las corridas cromatográficas, a las cuales se
les determinó los grupos de MS presentes en los EE de orégano silvestre y matarratón
almacenados a 8 y 26°C. Siendo positiva la presencia del MS en el cromatofolio, se
procede a marcar el área ocupada por el metabolito. Con un sacabocado afilado se
extraen tres secciones, las cuales se raspan y luego se pesan en una balanza analítica
Ohaus Adventure N° AR2140, se utiliza para calcular el peso (g) de cada MS. Este
primer material pesado es la silica gel, correspondiente a lo que se llama área
conocida (AC); esta contiene MS + sílica + solvente. Lo restante de la marca
igualmente se raspa y se anota como área desconocida (AD), contiene de igual modo
MS+silica+solvente. Posteriormente se procede a sacar tres discos con el sacabocado
en el cromatofolio correspondiente al control, los cuales se raspan y pesan
denominándose como el área control (ACt), la cual contenía sílica + solvente. Para
conocer la concentración de metabolitos secundario en mg · mL-1 se emplea la siguiente
fórmula.

  

+  − 1000 1000

  /
=
10µL

Donde los 10 µL representan la cantidad de extracto que se agrega a cada cromatofolio.

Evaluación de extractos etanólicos y aceite esencial de orégano silvestre (Lippia

origanoides H.B.K) y matarratón (Gliricidia sepium (Jacq.) Walpers) sobre la
garrapata Rhipicephalus microplus.

Para la evaluación de los EE y AE de orégano silvestre y matarratón se usarán

teleoginas (hembras adultas ingurgitadas) de R. microplus de 6 a 9 mm de largo,
obtenidas directamente de la piel de la región inguinal de bovinos de una finca. Se
transportan en envases de plástico con tapa agujereada; identificados y colocados en
cavas con hielo para su procesamiento en las siguientes 24 h. Las teleoginas colectadas
se identifican y se seleccionan aquellas que estén vivas y sin daños, luego se lavan con
agua corriente en un colador de acero inoxidable, se secan con papel absorbente y se
pesan individualmente en una balanza electrónica. Se distribuyen en placas de Petri
grupos de diez garrapatas/placa con un peso homogéneo por grupo.

Se utilizarán los EE de L. origanoides y G. sepium a las concentraciones: 20%, 15%,

10%, 5%, 2,5% y 1,25%, disueltos en agua destilada. Asimismo, el aceite esencial de L.
origanoides obtenido se emulsiona por agitación en agua destilada y se preparan las
concentraciones al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,06%. Se aplica el test de inmersión
de adultos de Drummond et al. (1973), en el cual se usan dos grupos de 10 garrapatas
por cada concentración más un grupo control, que consistirá en seis grupos de 10
garrapatas no tratadas. Los especímenes se incuban a 26º C ± 85% HR en cabinas de
vidrio por 18 d, colocados en bandejas de vidrio y pegadas con cinta adhesiva de
manera que el producto ovipositado pueda ser colectado, pesado, transferido a tubos de
ensayo e incubado nuevamente por 25d hasta obtener las larvas. Una vez eclosionados
los huevos se diferencian las larvas y los huevos no eclosionados, para obtener el
porcentaje de eclosión por el método visual.
En todos los casos, cada concentración se probará por separado, en ningún momento se
mezclarán ni se repetirán pruebas de inmersión con extractos distintos. A continuación
se describen los grupos experimentales y el control.

Tabla 1. Concentraciones y grupos de garrapatas usados para la prueba de inmersión de

adultos con Extractos etanólicos de Lippia origanoides y Gliricidia sepium

CONCENTRACIONES EE Lippia origanoides EE Gliricidia sepium

20% n=10 n=10 n=10 n=10
10% n=10 n=10 n=10 n=10
15% n=10 n=10 n=10 n=10
5% n=10 n=10 n=10 n=10
2,5% n=10 n=10 n=10 n=10
1,25% n=10 n=10 n=10 n=10
n= número de garrapatas por grupo o repetición

Tabla 2. Concentraciones y grupos de garrapatas usados para la prueba de inmersión de

adultos con Aceite esencial de Lippia origanoides

CONCENTRACION Aceite esencial Lippia Control/ agua

origanoides destilada
2% n=10 n=10 n=10
1% n=10 n=10 n=10
0,5% n=10 n=10 n=10
0,25% n=10 n=10 n=10
0,125% n=10 n=10 n=10
0,06% n=10 n=10 n=10

Determinación de parámetros reproductivos en R. microplus

Con los datos del peso de las garrapatas, el peso de la masa total de huevos producidos
por garrapata y el porcentaje de eclosión, se calcula la eficiencia reproductiva (ER),
valor que expresa la capacidad de una teleogina para transformar su peso corporal en
larvas viables, de acuerdo a la fórmula siguiente (Drummond et al., 1973):
 Peso de los huevos

ER = ________________________ x % Eclosión

Peso de las garrapatas

La eficacia o porcentaje de control se calcula en los grupos sometidos al test de

inmersión de adultos, según la fórmula de Abbott la cual expresa el porcentaje de
control parasitario (Abbott, 1925):

ER control- ER tratado

Eficacia = _____________________ x 100

ER control

Determinación de porcentaje de mortalidad de larvas de R. microplus.

Se utilizarán 30 garrapatas R. microplus adultas ingurgitadas para obtener la masa de

huevos tras su incubación por 18 días a 26º C ± 85% HR en cabinas de vidrio. Será
recolectada en tubos de ensayo y llevadas a incubación nuevamente bajo las mismas
condiciones de temperatura y humedad por 21 días. Luego de la eclosión de los huevos
se dejan madurar las larvas por 14 días. Utilizando cápsulas de Petri con papel filtro
adosado en el fondo, se realizarán 2 grupos experimentales, con seis concentraciones
distintas, un grupo con extracto etanólico (EE) de L. origanoides y otro con EE de G.
sepium en dos repeticiones de cada concentración, haciendo un total de diez (10)
preparaciones por cada extracto, más cuatro cápsulas que contienen papel filtro para
preparar el grupo control o sin tratamiento, el cual solo se le agregará agua destilada.

Se prepararán 20 ml de cada uno de los extractos a una concentración del 20%, diluida
en agua destilada. Se tomarán 10 ml de esta concentración, diluyéndola en forma
sucesiva en partes iguales de agua destilada para obtener las siguientes concentraciones:
10%, 5%, 2,5%; 1,25%, 0,625%, 0,312% de cada extracto por separado. Asimismo, se
prepararán 6 concentraciones del aceite esencial de L. origanoides y G. sepium
emulsionado en agua destilada al 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,12% y 0,06%. Con una
pipeta automática se impregnarán los papeles filtro, dentro de las cápsulas identificadas,
con 1 ml de la concentración correspondiente de cada tratamiento.
Posteriormente se colocarán sobre el papel filtro de 100 - 120 larvas por cápsula y se
sella con cinta adhesiva de manera hermética cada una, para evitar que escapen las
larvas. El grupo control consiste en 4 cápsulas con agua destilada sin tratamiento en el
papel filtro. Se introducen de nuevo en la cabina de incubación por 24 horas para
determinar el número de larvas vivas y muertas obtenido después de los tratamientos de
los EE y AE para obtener el porcentaje de mortalidad de las larvas en cada grupo al
final de las 24 horas. Se considerarán larvas muertas aquellas que no caminan ni
mueven sus patas. Se contará el número de larvas muertas por cápsula y el total de
larvas por cápsula utilizando una lupa estereoscópica y pinzas entomológicas.

Tabla 3. Concentraciones y grupos usados para la prueba de inmersión de larvas de

Rhipicephalus microplus con Extractos etanólicos de Lippia origanoides y Gliricidia sepium

CONCENTRACION/EE EE Lippia origanoides EE Gliricidia sepium

20% n=100 n=100 n=100 n=100
10% n=100 n=100 n=100 n=100
5% n=100 n=100 n=100 n=100
2,5% n=100 n=100 n=100 n=100
1,25% n=100 n=100 n=100 n=100
0,625% n=100 n=100 n=100 n=100

Control: El grupo control consistirá en cuatro grupos de 100 larvas cada uno con agua
destilada.

Tabla 4. Concentraciones y grupos usados para la prueba de inmersión de larvas de

Rhipicephalus microplus con Aceite esencial de Lippia origanoides.

CONCENTRACION/AE AE Lippia origanoides Control/ agua destilada

20% n=100 n=100 n=100
10% n=100 n=100 n=100
5% n=100 n=100 n=100
2,5% n=100 n=100 n=100
1,25% n=100 n=100
0,625% n=100 n=100