UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Extracción de ADN en tejido vegetal

FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGICAS

INTEGRANTES : Falla Benavides Jenny

Gonzales Rodríguez Anderson

Ruidias Vélez Rossana Abigail

Saldaña Garibay Gianina

BIOLOGÍA MOLECULAR
 Extracción de ADN en tejido vegetal
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Extracción de ADN en tejido vegetal

En biología molecular, el proceso de extracción de ADN es una de las
herramientas más útiles dentro de la ciencia. La obtención de ADN, es el punto de
partida para la mayoría de análisis genéticos. El hecho de contar con una técnica
efectiva para el proceso de extracción de ADN es un paso crítico en todos los
estudios de biología y genética molecular.
Los métodos empleados para este proceso se basan en una combinación de
factores físicos, químicos o mecánicos, los cuales incluyen tres pasos: extracción;
se realiza la lisis celular por medios físicos, químicos y enzimáticos; purificación
y precipitación.
La selección correcta de un método de extracción del ADN depende de múltiples
factores: cantidad de producto y pureza requerida, tamaño del fragmento a
amplificar, tiempo y costo.
Los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir
de diversas fuentes, por ejemplo, mediante la cadena de la polimerasa (PCR). La
calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más
importantes en ese tipo de análisis. Para extraer los ácidos nucleicos del material
biológico es preciso provocar una lisis celular, puede ser una rotura mecánica
(lisis hipotónica), tratamiento químico (detergentes) o digestión enzimática
(Proteínas K) tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de
células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación. Posteriormente se
realiza la purificación, mediante las técnicas de extracción precipitación,
mediante la combinación de fenol y cloroformo; la técnica de cromatografía,
asociada a la permeación sobre gel; la centrifugación, y separación por afinidad.
Cabe recalcar que, para la lisis celular, la muestra debe estar homogenizada trata
con el tampón de extracción, que contiene EDTA (que inhibe y puede unirse al
magnesio), TrisHCl como un tampón biológico que pueda mantener el ph de la
solución estable evitando cualquier variación de estas durante el trabajo y CTAB
que solubiliza las membranas celulares y emulsionan los lípidos de las
membranas celulares y las rompen.
La calidad y cantidad de ADN destacan como parámetros limitantes en la
realización de pruebas moleculares. Los problemas encontrados en la extracción y
purificación de ADN en algunos vegetales con lleva la presencia de diferentes
contaminantes. Por ello, para optimizar el proceso de la extracción de ADN, se
debe evitar el uso de objetos innecesarios en la mesa de trabajo y al momento de
manejar la muestra, evitar que los ambientes estén contaminados, los materiales y
reactivos en condiciones óptimas (temperatura, pH, etc), las muestras biológicas
en perfecto estado

COMENTARIOS REFERIDOS A LA PRÁCTICA Y EL VIDEO VISTO

EN CLASE:

Uno de los métodos que se utilizan para extraer ADN de plantas y

alimentos derivados de vegetales utiliza CTAB que es la sustancia
adecuada para procesar tejidos con una alta concentración de polisacáridos
y polifenoles. Este protocolo fue desarrollado por Murray y Thompson en

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1980 y publicado hasta 1987 por Wagner y sus colaboradores (Wagner et

al. 1987). Se ha utilizado de manera efectiva en diversas especies de
plantas (Doyle y Doyle 1987, Tel-Zuri et al. 1999, Aras et al. 2003)
bacterias (Honore´-Bouakline et al. 2003), hongos, líquenes (Crespo et al.
1999) e insectos (Fraga et al. 2004). En la actualidad algunos laboratorios,
que procesan un alto número de muestras, se sigue utilizando ya que
permite obtener ADN de alta calidad eliminando los inhibidores que
afectan la PCR; además de ser un método económico y fácil de
estandarizar.

Los nucleótidos del RNA se encuentran formados por el azúcar ribosa,

unida mediante enlace glucosídico a una de cuatro bases nitrogenadas
(adenina, guanina, uracilo o citocina), formando moléculas de una sola
cadena.

La función del DNA es la de almacenar y transferir la información

genética que conforma a un organismo y a su descendencia. El genoma de
un individuo comprende la totalidad de la información genética contenida
en el DNA. El DNA junto con los tres tipos de RNA (rRNA, tRNA y
mRNA) participa en la biosíntesis ordenada de los componentes de la
célula, codificando la expresión espacio temporal de las proteínas y
respondiendo a los estímulos del medio ambiente.

El genoma se encuentra organizado en forma diferente en las células

procarióticas y eucarióticas; en estas últimas presenta un mayor grado de
complejidad. El genoma de las células procarióticas está integrado dentro
de una sola molécula de DNA circular, dispuesta de modo compacto en
una zona nuclear denominada nucleoide.

El genoma de las células eucarióticas se encuentra organizado

en cromosomas, que son estructuras de DNA relacionadas con proteínas
básicas, a las que se les denomina histonas, y proteínas no histonas; las
histonas tienen carga positiva a pH fisiológico y neutralizan las cargas
negativas del fosfato de los nucleótidos, lo que confiere estabilidad y
permite que el DNA que mide casi 2 metros de longitud se empaquete en un
núcleo de 10 µm de diámetro. El genoma humano está constituido por 46
cromosomas y contiene 5 × 106 kpb en su totalidad.

De acuerdo con el tipo de célula en estudio, para aislar los ácidos nucleicos
es necesario romper la membrana y la pared celular mediante métodos
físicos, químicos o enzimáticos, para liberar las moléculas de DNA al

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medio extracelular. A partir de esto, la purificación de los ácidos nucleicos

se realiza mediante la extracción de las proteínas y los lípidos con solventes
orgánicos, y su recuperación, en un paso posterior, al precipitarlos con
alcohol (isopropanol o etanol).

Uno de los más importantes aportes a la biología ha sido el reconocimiento

del ADN como "la molécula de la vida”, y como biólogos es fundamental
conocer el ADN ya que este posee la información hereditaria y también la
información para el correcto funcionamiento de cualquier ser vivo. Es por
ello que es importante conocer diversos métodos de su extracción para su
respectivo estudio.

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El procedimiento que se realizó fue interesante y muy bien explicado,

empezaron con la solución de lisis. Ahí llegaron a explicar cada una de las
funciones de los elementos que se usaron, por ejemplo, el uso de detergentes
( LDTA), que es un quelante (aquelador de metales, como cobre y magnesio)
brindándole una carga negativa; TrisHCL (que anulan las ADNasas; NaCl y
el beta-mercaptoetanol. También enseñó a hacer los cálculos respectivos de
cada uno, los cuales estuvieron entendibles.

Para lo siguiente explicó el maceramiento de la muestra, explicando también

la lisis, pasando después a la precipitación de proteínas, explicando también
el uso adecuado de cada uno de los reactivos (fenol, cloroformo, alcohol
isodamilico), pasando después a la centrifugación.

A continuación, vimos la precipitación del ácido nucleico, explicando la

función del reactivo a usar ( Alcohol isopropílico, que se usa para extraer
ADN del resto del soluto). Finalmente, la resuspensión de ADN, donde
explicó la función del reactivo Tris-EDTA (cuya función es mantener al
ADN a un pH adecuado). Estuvo entendible, y creo que mejoraría con un
video sobre el procedimiento.
Antes de empezar

1. Preparar con anticipación todas las soluciones que se utilizarán y

mantenerlas a la temperatura solicitada.
2. Esterilizar morteros y pistilos, tubos para microcentrífuga y puntas
para micropipetas.
3. Rotular los tubos y tener a la mano marcadores de punto fino
indelebles.
4. En lo posible, utilice agua libre de DNasas y RNasas para preparar
las soluciones.
5. Encender el o los termobaños para que se encuentren a la
temperatura requrida.

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Antes de empezar

6. Preparar con anticipación todas las soluciones que se