Laboratorio Nº 13

EVALUACIÓN DE SUBSTRATOS NATURALES PARA FERMENTACIÓN

1. INTRODUCCIÓN:

Los substratos sólidos naturales proveen fuentes mezcladas de carbono y

energía y una fuente diversa y compleja de nutrientes los cuales pueden o no

pueden ser completos con respecto a los requerimientos nutricionales del

organismo o de los organismos que se cultivan.

Los substratos sólidos proveen ambientes selectivos para un gran número

de hongos filamentosos y unas pocas bacterias; así mismo actinomicetos, los

cuales desarrollan en forma micelial.

La mezcla de compuestos carbonados de alto y bajo peso molecular

conduce a patrones complejos de inducción, represión e inhibición en la

regulación del metabolismo microbiano.

La selección de un substrato sólido para un proceso de fermentación puede

involucrar realizar un proceso de selección de materiales agrícolas para el

crecimiento y la formación del producto. Entre los substratos que se han

sugerido están: los granos de arroz , de trigo, de soya, de cebada, de maíz,

etc. Estos substratos se recomienda que deben tener un limitado rango de

tamaño para evitar la aglomeración de partículas; así mismo deben ser

mantenidos en humedades relativamente bajas para evitar contaminación, y

que ocupen un volumen total relativamente pequeño comparado con el tamaño

del tanque de fermentación (2).

La fermentación de estado sólido es un proceso de transformación de

material biológico sólido en otros productos biológicos. Requiere que el

substrato tenga un contenido de agua total de 10 - 85%, esté en estado

particulado con un tamaño pequeño y en forma alargada, como más

recomendable; y del uso de un biorreactor, llamado fermentador de estado

sólido sobre el cual existen varios tipos, uno de ellos el tipo pila de discos. Los

biorreactores pueden ser diseñados y modificados de acuerdo a la

conveniencia (3).

Uno de los Hongos que se cultiva por fermentación de estado sóido es

Trichoderma. Este hongo macroscópicamente forma una colonia micelial,

blanco al inicio y verde posteriormente, etapa coincidente con la fase de

esporulación (4), una de sus partes estructurales, reproductivas, los conidios

(estructuras microscópicas), constituyen los elementos importantes para la

acción del biocontrol (5).

Trichoderma se ha encontrado que desarrolla en diferentes substratos

naturales tales como resíduos de caña de azúcar, zanahoria, etc. (1).

2. OBJETIVOS:

- Demostrar que los substratos naturales como papa, arroz, trigo, son

medios de cultivo utilizables para procesos de fermentación.

- Determinar en cuál de los substratos naturales hay mejor crecimiento,

desarrollo y producción de conidios de Trichoderma por fermentación de

estado sólido.

3. MATERIALES:

- Substratos naturales: arroz entero sin cáscara, trigo entro pelado

chancado y papa con cáscara rayada.

- Cultivo de Trichoderma aureoviride TAT-1 esporulado en fase

logarítmica.

- Agua destilada

- Varillas de vidrio

- Beakers

- Pipeta Pasteur.

- Pipetas serológicas

- Frascos de boca ancha.

- Placas Petri de 9 cm de diámetro

- Perlas de vidrio
 - Viales

- Cámara de Neubauer

- Rayador rectangular

- Colector de muestra tipo sacabocado de 1 cm2.

- Cocina eléctrica.

- Balanza de gramos.

- Microscopio compuesto de campo claro

- Estufa incubadora.

- Autoclave.

4. MARCO METODOLÓGICO:

4.1. Pesar 10 g de arroz y 10 g de trigo pelado chancado y a cada uno

mezclarlo, por separado, con 90 ml de agua destilada.

4.2 . Cocinar ambas mezclas con calor o fuego lento y con un

homogenizado permanente.

4.3 . Rayar papa entera sin pelar hasta obtener unos 100 g con partículas

de 0,5 cm de longitud con un grosor de 2-3 mm en promedio.

4.4. Colocar una capa fina uniforme de los substratos preparados, por

separado, 10 g, dentro de una placa Petri cada una.

4.5. Esterilizar las placas con el substrato en el autoclave.

 4.6. Sembrar por aspersión con la ayuda de un soplete manual sobre el

substrato de cada placa un inóculo de 1 ml de 10 7 conidios/ml del

hongo Trichoderma aureoviride TAT-1 esporulado en fase logarítmica

previamente preparado.

4.7. Incubar las placas a 22ºC por 7 días con luz blanca.

4.8. Observar macroscópicamente en cual substrato hay mejor crecimiento

y desarrollo del hongo.

4.9. Determinar en cual substrato hay mejor producción de conidios, para

lo cual realizar los pasos siguientes.

4.10.Tomar de cada placa dos muestras de 1 cm 2 de área cada uno y

suspenderlas dentro de 5 ml de agua destilada. Agitar fuertemente.

4.11.Contar el número de conidias expresándolo en número de conidios por

gramo de substrato. Para saber la cantidad de substrato que hay en un

1 cm2 realizar la operación de una regla de tres simple, determinando

primero cuál es el área de superficie de la placa petri donde se produjo

la fermentación y después relacionando ésta área total con la cantidad

total en gramos de substrato agregado a dicha placa.

4.12.Establecer en cuál de los substratos se produjo el mayor número de

conidios por gramo de substrato.

5. RESULTADOS

- Se pesó 10 g de arroz y 10 g de trigo pelado chancado y a cada

uno se mezcló por separado, con 90 ml de agua destilada.

- Se cocinó ambas mezclas con calor o fuego lento y con un

homogenizado permanente.

- Se rayó papa entera sin pelar hasta obtener unos 100 g con

partículas de 0,5 cm de longitud con un grosor de 2-3 mm en

promedio.

- Se colocó una capa fina uniforme de los substratos preparados,

por separado, 10 g, dentro de una placa Petri cada una.

- Se esterilizó las placas con el substrato en el autoclave.

- Seguidamente se sembró por aspersión con la ayuda de un

soplete manual sobre el substrato de cada placa un inóculo de 1

ml de 107 conidios/ml del hongo Trichoderma aureoviride TAT-1

esporulado en fase logarítmica previamente preparado.

- Luego se incubó las placas a 22ºC por 7 días con luz blanca.

- Se observó macroscópicamente en cual substrato hay mejor

crecimiento y desarrollo del hongo.

- Se determinó en cual substrato hay mejor producción de conidios,

para lo cual se realizó los pasos siguientes.

- Se tomó de cada placa dos muestras de 1 cm 2 de área cada uno

y se suspendió dentro de 5 ml de agua destilada. Se agitó

fuertemente.

- Se contó el número de conidios expresándolo en número de

conidios por gramo de substrato. Para saber la cantidad de

substrato que hay en un 1 cm 2 se realizó la operación de una

regla de tres simple, determinando primero cuál es el área de

superficie de la placa petri donde se produjo la fermentación y

después relacionando ésta área total con la cantidad total en

gramos de substrato agregado a dicha placa.

- Se estableció que en los tres substratos sirven para poder

producir conidios, y de la misma manera se estableció el

substrato que produce mayor cantidad de conidios.

 - El substrato que produjo mayor número de conidios fue el arroz,

el que le siguió fue el trigo y finalmente la papa. Y de esta manera

se pudo determinar que el arroz es el mejor productor de

conidios.

6. CONCLUSIONES

- Se demostró que los substratos naturales como papa, arroz, trigo,

son medios de cultivo utilizables para procesos de fermentación.

En la práctica se determinó que estos tres substratos sirven para

la producción de conidios.

- Se determinó en cuál de los substratos naturales hay mejor

crecimiento, desarrollo y producción de conidios de Trichoderma

por fermentación de estado sólido, el cual fue el arroz,

seguidamente el trigo y luego la papa.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. CASTILLO C, D. 2001. Optimización de algunos parámetros para la

producción de conidios de Trichoderma sp. en fermentación de estado

sólido. Tesis de maestría. U.N.T. Trujillo. Perú.

2. DEMAIN, ARNOLD. L. And N.A. SOLOMON. 1986. Manual of industrial

microbiology and biotechnology. Edit. American society for

microbiology. Washington, D.C.

3. DOELLE, H.W.; D. MITCHELL Y C. ROLZ. 1992 Solid substrate

cultivation. Edit. Elsevier Sciecie publishers. Ltd. England.

4. MALLOCH, D. 1997. Trichoderma. Research Labs. Toronto. Canadá.

5. SMITH, V. L; W. WILCOX Y G. HARMAN. 1991. Control biológico de

Phitophthora por Trichoderma. Patent womplex. New York.