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I. PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA
El proceso mediante el cual el eluyente hace que un compuesto salga de la columna se denomina elución.
Al constituyente mayoritario de una solución se le denomina solvente y al constituyente minoritario soluto.
No es necesario que las substancias a separar sean coloridas, pero sí debe disponerse de algún método
apropiado para su detección. En cualquier caso, los resultados se grafican para dar un cromatograma.
Cada “pico” representa un componente distinto de la muestra, y el área del pico es una medida de la
concentración relativa de ese componente. La figura 2 muestra un cuadro sinóptico con los principales
tipos de cromatografía y su clasificación.
El principio para que se separe una muestra en sus componentes puede ser debido a 5 principales
fenómenos físicos:
1. Adsorción. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, con un área superficial muy
grande (por ejemplo, carbón activado o sílica gel). El soluto se adsorbe en la superficie de la fase
estacionaria. La causa de que se mantenga adsorbido el soluto se debe a la separación de este a lo
largo de la superficie de la fase estacionaria.
Figura 4. Partícula con gran área superficial. A. Libre B. Con 30% de partículas adsorbidas.
C. con 70% de partículas adsorbidas. D. Con adsorción del 100%
Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía 6
2. Reparto. La fase estacionaria es una película delgada fija sobre un soporte sólido previamente
preparado. El soluto se separa por el equilibrio que se establece por la solubilidad que tenga el soluto
frente a este líquido estacionario y a la fase móvil gaseosa o líquida. Para ilustrar esto, supongamos
que tenemos una serie de vasos de precipitado llenos con agua hasta la mitad. Se añade al primero
de los vasos una mezcla de las moléculas A y B. A posee una Kr (hexano:agua) de 0.9, en tanto que
la Kr de B es 0.1. A continuación se añade un volumen de hexano al primer vaso, se agita, se permite
la separación de las fases y se recupera dicho hexano. El hexano recuperado en este primer vaso se
añade al segundo y se añade más hexano limpio al primer vaso. Ambos se agitan, se dejan separar
las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vaso se pasa al tercero el del primero al
segundo y se añade hexano nuevo al primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los
vasos se llenen con hexano. Si el experimento consistiese de 8 vasos, al final la cantidad de A y de B
presente en cada vaso (sumando lo contenido en el hexano y el agua) presentará una distribución
como la que se muestra en la figura 5.
Si juntamos los vasos 1 al 3 por un lado y los vasos 6 al 8 por otro y evaporamos el solvente,
habremos separado la sustancia A de la B con una mínima pérdida (lo que se quedó en los vasos 4 y
5).
Ejemplo del principio de reparto entre dos fases inmiscibles. Cuando una mezcla de moléculas
disueltas en un solvente determinado se pone en contacto con otro solvente que sea inmiscible con el
primero, las moléculas disueltas se difundirán hacia la nueva fase hasta alcanzar una concentración
en cada fase (solvente) que depende de la solubilidad relativa de dicha molécula en las fases.
HEXANO
AGUA
El resultado es que ahora la fase hexánica contiene a las moléculas representadas por esferas rojas y
estas se han separado de las otras, que permanecen en el agua.
Así mismo, se puede calcular un coeficiente de reparto para las moléculas "verdes". Es evidente que
la Kr("rojas") será elevada, mientras que la K r("verdes") será muy pequeña.
Una sustancia determinada presentará una K r diferente para cada par de solventes que se ensaye.
Debe advertirse también que esta definición es válida siempre que los volúmenes de solvente
empleados sean grandes, a fin de evitar que las soluciones se saturen.
Dado que la difusión de las moléculas de una fase a la otra es lenta, el proceso debe acelerarse
agitando la mezcla de solventes hasta formar una suspensión fina de gotitas de hexano en el agua o
viceversa. Para recuperar la fase hexánica se permite que la dos fases se separen por sedimentación
(dado que son inmiscibles y de distinta densidad). Aunque esta separación de fases también puede
acelerarse mediante centrifugación.
La separación puede hacerse más completa si después de recuperar el hexano, se añade una nueva
cantidad de hexano limpio al agua. Esta vez, las pocas moléculas "rojas" presentes en el agua
pasarán al hexano y la cantidad de ellas que permanezcan en el agua será aún menor.
La eficiencia de la separación depende del número de lavados con solvente y de la diferencia en las
constantes de reparto de ambas substancias.
Generalizando:
co nc .de X e n e l s olv e nt e 1 [X ]1
K
c onc . de X e n e l s olve nt e 2 [X ]2
Otro ejemplo:
el yodo es 85.5 veces más soluble en tetracloruro de carbono que en agua, de modo que para este
sistema el coeficiente de reparto es:
Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía 8
c onc . de y od o en CCl4
K 85 .5 En teoría, es posible separar una mezcla
co nc .de y odo e n H2O de substancias realizando un número
muy grande de extracciones hasta
garantizar la pureza deseada. Sin
Entonces, una manera sencilla de separar el yodo embargo, la extracción líquido-líquido
de una solución acuosa sería extraerlo con CCl 4. El tiene la desventaja de que es un proceso
sentido común nos dice que entre más extracciones por lotes, no continuo. Además, realizar
un número grande de extracciones es
realicemos, más completa será la remoción del tedioso y se puede perder fácilmente una
componente. Aunque no es difícil deducir la fórmula gran cantidad de muestra entre cada
básica para la extracción por lotes, en esta ocasión la extracción
daremos sin demostración:
V n
Wn W0 2
KV1 V2
donde:
K coeficiente de reparto para el soluto X entre los solventes 1 y 2
n número de extracciones realizadas
W0 gramos de X en el solvente 2 antes de cualquier extracción
(iniciales)
Wn gramos de X en el solvente 2 después de n extracciones (finales)
V1 volumen del solvente utilizado para cada extracción
V2 volumen del solvente donde está el soluto originalmente
Ejercicio:
Supongamos que queremos extraer 2 gramos de soluto X de 50 mL de agua. Como solvente de
extracción se usará cloroformo. Para este sistema se sabe que el coeficiente de reparto es:
[X ]1 [X ]CHCl3
K 3
[X ]2 [ X ]H 2O
¿Qué es mejor: hacer una extracción con 150 mL de cloroformo, o hacer tres extracciones con 50 mL
de cloroformo cada una?
Solución:
Identificamos al solvente 1 como el cloroformo. El solvente 2 es el agua. El coeficiente de reparto K
está escrito en la forma correcta (conc. 1 / conc. 2). Entonces,
50 1
La separación se realiza debido a las
W1 2
3 (150 ) 50
0 .2 g
fuerzas electroestáticas entre cargas
opuestas de la fase estacionaria y los
solutos cargados. La fase móvil es un
Quedaron 0.2 g de X en el agua. Pudimos extraer 2-0.2 líquido.
= 1.8 g, es decir, el 90 % de X.
V 3
W3 W0 2 ¡Tres extracciones
pequeñas son
KV1 V2
mejores que una
grande!
50 3
W3 2
0 .03125
g
3 (50 ) 50
3. Intercambio Iónico. Para que se efectúe la separación, la fase estacionaria se modifica uniendo a
su superficie especies electro activas (aniones o cationes) de forma covalente.
Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria
presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el
amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos
grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de
La columna puede ser de
matriz negativa
(intercambio catiónico) o
positiva (intercambio
aniónico).
Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía 10
potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad,
o de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la
concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la
columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína
por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.
Adición de
glucosa (G)
Las proteinas
enlazadas a la
glucosa son
expulsadas sobre
la glucosa
adicionada
CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA
Cuando solo se tiene miligramos de una mezcla, conviene separar sus componentes por cromatografía
preparativa, pudiéndose obtener un miligramo o más de sustancias puras, por repetidas cromatografías,
usando columnas preparativas o papel de filtro grueso (tipo 3MM). En columna, se tiene el sistema de
columna abierta, o de flash, en el cual simplemente se alimenta el analito y los solventes desde la parte
superior, y se colectan las fracciones en la parte final de la columna.
Un sistema sencillo, diferente del de columna abierta, consiste de una columna y una bomba para proveer
la presión necesaria para obtener la separación, optimizando el tiempo.
Actualmente existen en el mercado sistemas con aceleración centrífuga para la realización separaciones
preparativa radiales en capa delgada. Lo que permite separaciones relativamente rápidas (aprox. 20
minutos), sin necesidad de raspar bandas separadas como en la Cromatografía de Capa Fina tradicional.
(ver http://www.ichromatography.com/cyclograph-centrifugal-chromatography-device.html).
Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía 15
En estos sistemas el compuesto a separar se aplica en solución en el dispositivo circular, que se encuentra
rotando a una velocidad predeterminada; la mezcla de disolvente elegido se bombea a través de una capa
que funciona como fase estacionaria, de manera que como resultado de las diferentes afinidades para esta
capa y la mezcla de disolvente se realiza la separación de los componentes individuales; cuando éstos
alcanzan el borde exterior del rotor, la fracción separada se colecta en un contenedor especial.