Agua Aire Suelo Pollut https://doi.
org/
(2021) 232: 227
10.1007/s11270-021-05171-7
Biodegradación del caucho natural: estudio de microcosmos
Francesca Bosco · Chiara Mollea
Recibido: 3 de diciembre de 2020 / Aceptado: 10 de mayo de
2021 © El autor (es) 2021
Resumen En el presente trabajo se ha evaluado la
biodegradación del caucho natural (NR), mediante un consorcio
microbiano, seleccionado naturalmente en un suelo de vertedero
de neumáticos. Para ello, se incubaron microcosmos de suelo
preparados durante 236 días, a temperatura ambiente, y con
ciclos naturales de luz / oscuridad. El efecto de la fuente primaria
de C y la adición del suelo fresco, la aireación del suelo y el
mantenimiento de la humedad se ha monitoreado por medio de
análisis microbiológicos y respirométricos, determinaciones de
pérdida de peso seco y micrografías SEM. Durante la incubación,
en microcosmos de biodegradación
(BD), que contiene NR muestras, el CO producido2 fue
significativamente mayor que la de los controles bióticos (BC).
Además, después de 236 días, una pérdida de peso seco NR de
Se registró un 15,6%, en microcosmos de BD, aproximadamente
cuatro veces más que el registrado en el control de BC (3,7%). Los
resultados obtenidos confirmaron que el consorcio microbiano
seleccionado naturalmente pudo utilizar NR como única fuente
de C y biodegradarlo. El efecto positivo de la mezcla del suelo
evidenció que el proceso de biodegradación se llevó a cabo
principalmente por biomasa aeróbica, especialmente hongos
filamentosos, como lo confirman los recuentos microbianos y las
observaciones SEM. Los resultados obtenidos en el estudio de
microcosmos proporcionaron información útil en términos de
F. Bosco (*) · C. Mollea
Departamento de Ciencia y Tecnología Aplicadas, DISAT,
Politecnico Di Torino, C.so Duca degli Abruzzi 24, 10129
Torino, Italia
correo electrónico: francesca.bosco@polito.it
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aireación del suelo y enmienda de nutrientes con miras a una futura
ampliación del proceso de biodegradación.
Palabras clave Caucho natural · Biodegradación ·
Hongos filamentosos · Análisis respirométrico ·
Microcosmos
1. Introducción
El caucho natural (NR) se utiliza para fabricar productos
esenciales para la vida cotidiana; en consecuencia, la
demanda mundial de caucho crece continuamente y gravita
casi por completo hacia la producción de NR porque
actualmente no es factible reproducir NR sintéticamente, en
particular debido a su estructura química ramificada (Sriring
et al.,2018). NR se extrae principalmente delHevea
brasiliensis Calentar con especias. Arg. árbol, típico de los
bosques tropicales amazónicos. El látex, que se recoge del
árbol al tocar el tronco, contiene principalmentecis-Unidades
de 1,4-poliisopreno, 87% en peso seco, mientras que el 13%
restante está representado por proteínas, lípidos,
carbohidratos y minerales (Bottier, 2020). Las cantidades
producidas alcanzan numerosos millones de toneladas por
año: el NR tiene propiedades únicas (es decir, alta resistencia
a la tensión, elasticidad y flexibilidad) que lo convierten en
una materia prima de gran interés (Zhao et al.,2019). Los
productos de caucho pertenecen a diversas áreas de
aplicación, como la fabricación, la medicina, el hogar y el
transporte. Entre todas estas aplicaciones, el caucho se
utiliza mucho en el campo de la medicina.
13
Vol.:(0123456789)
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para la producción de equipos médicos o de protección
personal (EPI) desechables (Mente et al., 2016). En particular,
en el año 2020, el uso de EPP ha crecido exponencialmente
para la protección contra la nueva infección por coro-
navirus (SARS-CoV-2): se han consumido 65 mil millones de
guantes mensualmente en todo el mundo, de los cuales
500 millones solo en Italia (Prata et al., 2020). Estas cantidades de
caucho, relacionadas con el EPI, son solo una parte de las
consumidas anualmente en todo el mundo: en el año
2019, se han utilizado alrededor de 14 millones de toneladas
de NR (Wang et al., 2020). La mayor demanda de EPP,
relacionada con la circulación del virus SARS-CoV-2, se debe
actualmente a un uso ampliado por parte del personal
médico, pero también por la gente común en su vida diaria
(Nowakowski et al.,2020). Esto ha dado lugar a un avance
significativo en el volumen de EPI desechados, incluida una
gran cantidad de guantes de látex de goma no reutilizables.
En particular, para limitar la difusión del virus, la gente
común usa estos EPP durante períodos de tiempo limitados
y los cambia con mucha frecuencia. La cantidad relacionada
de desechos de caucho, de difícil manejo, representará un
riesgo para la salud pública, ya que estos desechos pueden
ser un vector del virus SARS-CoV-2, pero también un riesgo
para los ecosistemas, debido a la incontrolada y descarte
directo en el medio ambiente (Di Maria et al.,
2020; Klemeš y col.,2020).
Se han propuesto o aplicado diferentes estrategias a lo
largo de los años para superar los daños relacionados con la
eliminación de desechos de caucho; pueden tratarse in situ o
exportarse, quemarse o tirarse, almacenarse y desecharse
en vertederos. Desafortunadamente, a menudo estas
operaciones se llevan a cabo ilegalmente y causan
contaminación adicional u otras consecuencias negativas
(Winternitz et al.,2019); por ejemplo, los desechos de caucho
enterrados en suelos agrícolas pueden causar infertilidad del
suelo con altas repercusiones económicas para las
plantaciones. En el año 2020, en lo que respecta a la difusión
del virus SARS-CoV-2, se ha propuesto la mezcla de los
guantes ligeros de látex con otros residuos o se ha
planificado su incineración para recuperar energía
(Nowakowski et al.,2020). Esta última solución no es
respetuosa con el medio ambiente porque a menudo crea
problemas de contaminación del aire; Además, el valor de
recuperación del proceso de caucho de desecho es solo bajo
(Adhikari et al.,2000).
La estructura NR puede debilitarse por procesos
de degradación abiótica: degradación mecánica, foto,
térmica y química (Chen & Qian, 2003; Ibra- him et al.,
2020; Sadaka y col.,2012). Como un asunto
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Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
de hecho, todos estos procesos a menudo se basan en el uso de
disolventes químicos peligrosos, grandes cantidades de energía
y también pueden conducir a la generación de microplásticos
nocivos para la salud.
Una alternativa eficaz, para superar todos los problemas
de eliminación de residuos de caucho, puede estar
representada por la biodegradación que permite evitar o
limitar las complicaciones relacionadas con la contaminación
ambiental (Andler, 2020). La biodegradación del caucho
natural depende de varios factores y, entre ellos, las
características del polímero (es decir, el peso molecular, la
cristalinidad, la presencia de grupos funcionales,
sustituyentes o aditivos), el tipo de microorganismos
involucrados y el posible polímero precursor. Los
tratamientos juegan un papel importante (Ali Shah et al.,2013
). El proceso de biodegradación evoluciona a través de
cuatro transiciones consecutivas, que son el biodeterioro, la
biofragmentación, la asimilación y la mineralización. Durante
el primero, las propiedades químicas y físicas del polímero
se alteran, mientras que durante el segundo paso, la
escisión enzimática permite la descomposición del polímero.
La asimilación es la captación de las moléculas por parte de
los microorganismos; finalmente, la mineralización es la
fase concluyente, caracterizada por la liberación de CO2
y H2O, en condiciones aeróbicas, y de CO2, CH4, y
H2O, en anaeróbicos (Pathak & Navneet, 2017). En particular,
el caucho, al ser un producto natural, se somete a
varios ciclos de biomineralización también cuando se
encuentra en forma reticulada, como es el caso de los
guantes de látex o caucho vulcanizado (Ali Shah et al., 2013).
Numerosos bacterias y hongos, capaces de degradar el NR
como fuente de carbono y energía, están presentes en
ambientes naturales, y entre ellos, los de la microflora del
suelo han sido frecuentemente aislados y estudiados para
examinar su potencial de biodegradación del caucho (Imai
et al. ,2011).
La degradación bacteriana del caucho ha sido
ampliamente estudiada desde 1936, cuando, por primera
vez, se describió el aislamiento de bacterias degradantes del
caucho mediante placas de látex superpuestas, donde las
colonias bacterianas crecieron formando halos translúcidos
(Jen- drossek et Alabama., 1997). Tanto las bacterias Gram (+)
como las Gram (-) pueden biodegradar este polímero;
bacterias pertenecientes al grupo del CNM (Corynebacte‑
rium, nocardia, y Mycobacterium) y los
actinomicetos, como Actinoplanos, Streptomyces, y
Micromonospora, han sido enumerados por Yikmis y Steinbüchel
(2012) como biodegradables prometedores. En los últimos años,
también las bacterias pertenecientes aGordonia
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spp. han sido considerados por su capacidad de
biodegradación del caucho junto con la capacidad de
formación de biopelículas (Braga et al.,2019; Huong,2020).
El primer conocimiento sobre la capacidad de biodegradación
NR de los hongos filamentosos fue reportado por De Vries en el
año 1928, quien describió la biodegradación NR, en cultivo
líquido, por Aspergilo sp. yPen‑ icillium sp .: la disminución de
peso NR obtenida alcanzada
15,5% después de 19 meses de incubación. En los años
siguientes, numerosos estudios confirmaron la posibilidad
de biodegradar NR por medio de estas especies de hongos y
se agregaron otras nuevas (Rose & Steinbüchel,2005).
Recientemente, Pathak y Navneet (2017) enumeró, entre las
especies implicadas en la degradación de polímeros de
caucho natural y sintético, A. niger, Aspergillus
flavus, Fusarium solani, Pycnoporus cinnabarinus,
y Mucor rouxii como los más frecuentes. Los hongos estudiados,
en su mayor parte, se aislaron directamente de la superficie del
caucho o del suelo, mientras que la degradación se llevó a cabo
en cultivo líquido, o directamente sobre la superficie del caucho,
o inoculando las cepas en el suelo junto con NR enterrado.
fragmentos (Mollea & Bosco,
2020). En los últimos años se han reportado ejemplos de estudios
de biodegradación de NR mediante cultivos de hongos puros con
el método de enterramiento en suelo.Cladosporium fulvum,
aislado del suelo, fue capaz de degradar anchos discos NR,
enterrados en el suelo, permitiendo obtener una
5.3% de pérdida de peso del caucho después de 60 días de incubación
(Nawong et al., 2018).
Cuando se considera un enfoque de biodegradación, es
necesario estimular inicialmente la actividad de aquellos
microorganismos capaces de eliminar los compuestos
tóxicos posiblemente presentes en la composición del
caucho, es decir, principalmente hongos; por ejemplo,
Stevenson et al. (2008) estudió la capacidad del hongo
Resinicium bicolor para eliminar componentes tóxicos.
Posteriormente, la biodegradación puede ser llevada a cabo por
otras especies microbianas degradantes.
La mayoría de los estudios sobre la degradación microbiana
del caucho se han realizado, a escala de laboratorio, en cultivos
líquidos que a menudo utilizan un medio mineral mínimo
enriquecido con el caucho como única fuente de carbono. Según
lo informado por Yahya et al. (2011), la tasa de degradación
microbiana del caucho está influenciada por la formulación del
caucho, pero también por el tipo de microorganismos
involucrados y sus interacciones con el medio ambiente. Las
tasas de biodegradación de NR son más lentas que las de otros
polímeros naturales; esto es
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particularmente debido a la estructura química ramificada
del caucho en sí (Qu et al., 2016; Rose y Steinbüchel,
2005). Por todas estas razones, puede ser útil realizar estudios a
escala de laboratorio estableciendo microcosmos del suelo que
exploten la microflora natural del suelo; Este es un buen enfoque
para evaluar, también durante períodos prolongados de
incubación, la capacidad microbiana de degradar el caucho, la
actividad potencial de la biomasa del suelo autóctono y también
la estrategia de biorremediación más eficaz. La biodegradación
del caucho es un proceso lento; por lo tanto, requiere largos
períodos de incubación (es decir, de algunas semanas a meses)
para permitir el crecimiento de la biomasa y modificaciones
significativas en la masa / estructura del caucho (Ali Shah et al.,
2013). Un ejemplo reciente es el de una prueba de enterramiento
del suelo a gran escala que ha demostrado la alta
biodegradabilidad del NR en presencia de la microflora natural
del suelo; Se obtuvo una pérdida de masa del 16,2% después de
solo 45 días y del 38,3% al final del tiempo de incubación (90 días)
enterrando sondas delgadas en un suelo rico en nutrientes y
exponiéndolas a la microflora del suelo (Mastalygina et al.,2020).
Los ensayos realizados en microcosmos, a escala de laboratorio,
no siempre garantizan resultados reproducibles in situ, por la
influencia de factores químicos, físicos y biológicos, pero
permiten tener en cuenta estos aspectos, simulándolos en
condiciones controladas. condiciones, y para verificar la
biodegradabilidad del caucho (Bosco & Mollea,2019; Bosso y col.,
2015). Este último aspecto puede ser de interés considerando,
por ejemplo, la influencia de la meteorización natural en el
debilitamiento del caucho. Cuando el caucho se expone a
condiciones ambientales directas o indirectas (por ejemplo, luz,
calor, oxígeno y humedad), la estructura insaturada se modifica.
En particular, el oxígeno puede atacar fácilmente el caucho,
degradar el polímero y puede causar el endurecimiento o
ablandamiento del caucho (Muni- andy et al.,2017). Al mismo
tiempo, las condiciones ambientales influyen directamente en las
clases microbianas y las vías degradativas involucradas en el
proceso de biodegradación; por ejemplo, en presencia de
disponible O2, Los microorganismos aerobios predominan en la
degradación del material polimérico y aumentan la producción.
ing nueva masa microbiana junto con CO2 y H2O como
productos finales (Ali Shah et al., 2013).
El objetivo del presente trabajo fue la evaluación de la
biodegradación del NR mediante un consorcio microbiano
seleccionado de forma natural en un suelo recogido en un botadero
de neumáticos. Los principales parámetros (es decir, fuente primaria
de C y adición de suelo fresco, aireación del suelo y humedad)
13
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mantenimiento) que el control del proceso de
biodegradación ha sido monitorizado mediante análisis
microbiológicos y respirométricos; además, se ha
determinado la pérdida de peso seco y se han evaluado
las modificaciones microscópicas de NR mediante
micrografías de microscopio electrónico de barrido (SEM).
2. Materiales y métodos
Los ensayos experimentales sobre la biodegradación del caucho
natural (NR) se han realizado a escala de laboratorio, en
microcosmos que contienen suelo procedente de un vertedero
de neumáticos y láminas NR.
2.1 Caucho natural
El caucho natural (NR) incubado en el microcosmos se
conoce comercialmente como caucho de Malasia estándar
de grado L (SMRL); consiste encis-1,4-poliisopreno y se
caracteriza por un peso molecular de aproximadamente 500
kDa y un nivel de insaturación del 98% (mol / mol). Las
muestras NR se cortaron en forma redonda (Ø
2,54 cm) a partir de discos preparados con un diámetro
de unos 15 cm y un grosor de 0,2 cm.
2.2 Preparación y caracterización del suelo
El suelo utilizado para el experimento de biodegradación se
recogió de un vertedero ilegal de neumáticos, ubicado en
una zona rural, en la región de Piemonte, en el noroeste de
Italia. Se muestreó a una profundidad de 20 cm, se pasó por
un tamiz de 2 mm y se almacenó a + 4 ° C, en recipientes de
vidrio, hasta su utilización.
2.2.1 Contenido de suelo-agua
La humedad del suelo (H), expresada como su contenido de
agua, se determinó pesando pequeñas porciones (5–10 g) y
secándolas, a 105 ° C, al menos durante 24 hy hasta que el
peso alcanzara un valor constante. El% de humedad se
calculó como se indica en la Ec.1 (las cantidades de suelo se
expresan en gramos):
[(
orgánico %= peso seco del suelo 105◦C - peso final del suelo
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Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
[( ) ]
H% = Tierra húmeda - peso seco del suelo105◦C ∕Tierra húmeda × 100
(1)
2.2.2 W Capacidad de retención de agua (WHC)
Se saturaron veinticinco gramos de suelo con 100 mL de
agua destilada y se dejaron a temperatura ambiente durante
2 h. A continuación, se selló el fondo de un embudo Buchner
con un papel de filtro humedecido: la muestra de suelo se
extendió uniformemente sobre el filtro y el sistema se
conectó a una bomba de vacío para extraer agua de la
muestra. Finalmente, se recuperó la muestra de suelo y se
secó a 105 ° C hasta alcanzar un peso constante.
El% de WHC se calculó como se indica en la Ec. 2:
[( ) ]
HC% = tierrasaturado - peso del suelo105◦ ∕peso seco
C del suelo105◦C × 100
(2)
En Eq. 2, "tierrasaturado"Es la masa de la inicial
mezcla suelo-agua, mientras que "peso seco del suelo 105
° C”Es el de la tierra seca; las cantidades se expresan en
gramos.
2.2.3 Determinación del pH del suelo
El pH del suelo se determinó con el método potenciométrico
utilizando un medidor de pH. Las medidas se han realizado
humedeciendo el suelo (10 g), contenido en un vaso de
precipitados, con 25 ml de agua destilada o KCl 1 M
solución, o CaCl 0,01 M2 solución.
Las muestras se mantuvieron durante 2 h en continuo
emocionante. Luego, se dejó reposar cada suspensión
durante 10 min y se midió directamente el pH de la fase
líquida dentro del vaso de precipitados mediante un
medidor de pH. El valor de pH del suelo informado es el
promedio de los tres obtenidos con agua destilada y las dos
soluciones salinas.
2.2.4 Contenido de carbono orgánico del suelo
Una porción de tierra, 5 g, se secó a 105 ° C hasta que se
alcanzó un valor constante del peso. Después de eso, el
suelo seco se dejó durante 4 ha 650 ° C y luego
ponderado. El contenido de carbono orgánico% (Corgánico%)
se determinó como se indica en la Ec. 3:
) ]
650◦C ∕peso seco del suelo 105◦C × 100 (3)
Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227 Página 5 de 15 227

2.2.5 Caracterización microbiológica del suelo
El suelo ha sido caracterizado microbiológicamente
para detectar el número de microorganismos
autóctonos y discriminar entre bacterias y hongos.
Para ello se preparó el Agar Extracto de Malta (MEA,
extracto de malta 20 g / l, glucosa 20 g / l, peptona 2
g / l, agar 20 g / l) ajustando el valor de pH a 4 o
5, agregando una solución de HCl; el medio se esterilizó con
vapor (121 ° C, 2 atm, 20 min) y se vertió en las placas de
Petri a una temperatura de aproximadamente 50 ° C. El pH 4
es favorable para el crecimiento de hongos, mientras que el
pH 5 permite el bacteriano. La caracterización microbiana se
ha realizado para el suelo antes del experimento de
biodegradación en diferentes tiempos de incubación. Se han
aplicado dos métodos diferentes: el de “dilución del
suelo” (mediante esparcimiento e inclusión de inóculo) y los
de “placa de suelo”.
La dilución del suelo se ha preparado mezclando suelo y
agua destilada estéril en una proporción de 1: 2 (peso:
volumen). La suspensión se ha mantenido en agitación, a
125 rpm, con bolas de vidrio, en condiciones estériles
durante 1 h. Al final, la suspensión se ha diluido con agua (1:
100, 1: 1000, 1: 10,000) y se han esparcido homogéneamente
100 µl de cada dilución sobre la superficie de las placas MEA
para el método de extensión. En el caso del método de
inclusión, se vertieron 500 µl de cada dilución en el centro de
la placa de Petri, se cubrieron con MEA líquido y luego se
dejaron solidificar. Los platos se incubaron en la oscuridad, a
temperatura ambiente durante 48 h. En ambos casos, al final
de la incubación, se han contado las colonias microbianas y
los resultados obtenidos se han expresado como UFC /
precinto integrado en el tapón. Se vertió una cantidad
de 200 g de tierra y se dispersó en el fondo de cada
jarra; además, se añadió agua destilada para llevar la
humedad del suelo al 35% del WHC medido. Cuando
fue necesario, cada componente del microcosmos se
esterilizó con vapor a 121 ° C y 2 atm de presión,
durante 20 min. Además, durante el transcurso del
tiempo de la biodegradación, el medio Czapek (CZ
medio, composición: glucosa 30 g / l, NaNO3 3 g / l,
K2HPO4 1 g / l, MgSO4 0,5 g / l, KCl 0,5 g / l, FeSO4
0,01 g / l), con o sin glucosa.
El aparato para CO2 la captura se colocó en la parte
superior del suelo en el medio de cada microcosmos; como
se muestra en la Fig. 1, estaba compuesto por una base de
plástico con tres pines (Ø 8 cm, altura 3 cm) para sostener el
recipiente para la solución de NaOH (capacidad
100 ml), utilizado para CO2 capturar. Una vez que el CO2 Se
colocó el aparato de captura, los microcosmos fueron
Sellado cuidadosamente y mantenido a temperatura
ambiente y en el ciclo natural de luz / oscuridad.
La configuración del microcosmos se enumera en la Tabla 1;
para cada línea, se prepararon microcosmos por triplicado. En lo
que respecta a los microcosmos que contienen las muestras NR,
dos de las cuatro muestras fueron

gramotierra.

En cuanto al método de la placa de suelo, se han

colocado muestras de suelo (50 o 100 mg) en el medio de las
placas de Petri. Después de eso, se agregaron 500 µl de
agua destilada estéril y la mezcla se mezcló bien para
obtener una suspensión homogénea. Finalmente, se
vertieron 20 ml de MEA líquido, preparado a pH 4 o pH 5,
sobre la suspensión de suelo. Además, en este caso, las
placas de Petri preparadas se mantuvieron en la oscuridad
ya temperatura ambiente; el recuento microbiano se realizó
después de 48 h de incubación.

2.3 Configuración del microcosmos

El montaje de los microcosmos del suelo se llevó a cabo en

frascos de vidrio sellados (capacidad 1 l), que tenían una goma Figura 1 Montaje del microcosmos del suelo en un frasco de vidrio

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 227 Página 6 de 15 Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227

tabla 1 Configuración de la línea de microcosmos los fragmentos, lavados o no, se secaron en estufa a
Número Muestra NR Vapor del suelo
55 ° C durante 24 hy luego se pesaron mediante
de NR esterilización a vapor- balanza analítica.
muestras esterilización- ción
2.4.3 Análisis SEM
Control abiótico 4 sí sí
(AC) línea
Control biótico (BC) 0 No No La morfología de la superficie NR se investigó mediante
línea análisis SEM. NR, lavado o no, se fijó durante la noche
Biodegradacion 4 No No con una solución de glutaraldehído al 5% y luego se
(BD) línea analizó usando LEO / Zeiss 1450VP SEM (voltaje del haz: 5
kV). Las piezas NR se fijaron con alfileres sobre cintas
adhesivas conductoras y luego se recubrieron con oro
colocados en la parte superior del suelo, mientras que los demás fueron antes de analizarlas. El modo de imagen utilizado fue el
enterrados a 1 cm de profundidad. de electrones secundarios (modo SE).

2.3.1 Determinaciones respirométricas

La evaluación de la actividad de respirometría, dentro de
los microcosmos sellados, se realizó mediante el
medida del CO producido2, capturado por una solución
de NaOH (1,5 N), utilizando una titulación ácido-base con
HCl 1,5 N, BaCl2 1 M como agente precipitante, y una
solución de fenolftaleína, como indicador de color (Mol-
lea et al., 2005).
2.4 Análisis de las muestras NR
Se tomaron muestras periódicas de NR de los microcosmos y
se analizaron para evaluar el grado del proceso de
biodegradación. El alcance de la biodegradación se
cuantificó mediante la determinación de la pérdida de peso
en seco, mientras que los cambios en la morfología del
caucho se examinaron con análisis SEM.
2.4.1 Método de lavado NR
Las láminas de NR, muestreadas de los microcosmos, se
lavaron para eliminar las partículas de suelo y la biomasa
adherida siguiendo el procedimiento previamente descrito
por Mollea y Bosco (2020).
2.4.2 Peso seco NR
El peso seco de los fragmentos de caucho se evaluó en el
momento de la instalación del microcosmos y, periódicamente,
durante la incubación en los microcosmos. NR
3. Resultados y discusión
3.1 Caracterización del suelo
3.1.1 Caracterización químico-física
El suelo utilizado para los experimentos de biodegradación,
recogido de un vertedero ilegal de neumáticos en el
noroeste de Italia, se clasificó como franco limoso y se
caracterizó por una WHC del 66% y una humedad del 10%
(p / p). Resultó débilmente alcalino, pH 7,5, y su contenido de
carbono orgánico fue igual al 11%.
3.1.2 Caracterización microbiana
El suelo se caracterizó microbiológicamente por medio
de recuentos en placa de los microorganismos
cultivables con dos métodos diferentes, dilución del
suelo, por extensión o inclusión, y placas de suelo. Las
UFC de bacterias y hongos filamentosos se determinaron
en placas de agar extracto de malta (MEA) a dos valores
de pH diferentes, 5 y 4, respectivamente. Se
establecieron tres réplicas para todos los análisis y se
informan los valores medios obtenidos.
La caracterización se realizó, en el micro-
configuración cosm (t0), para el suelo no incubado. Además,
con el fin de identificar los aspectos cuantitativos y
cambios cualitativos en la microflora autóctona del suelo
después de 97 días de incubación, se repitió la
caracterización, en presencia o no de muestras NR, para
microcosmos BD y BC respectivamente.
En mesa 2, la UFC / gtierra, obtenidos con los
métodos de dilución del suelo y placa de suelo. Como

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Tabla 2 Recuento de células viables: resultados (UFC / gsuelo) obtenidos Tabla 3 Recuento de células viables para el suelo en los microcosmos
para el suelo no incubado (t) con
0 la dilución del suelo y la placa de suelo. BC y BD: se muestran los resultados (UFC / g suelo) obtenidos después
métodos a pH 4 y pH 5 de 97 días de incubación a pH 4 y pH 5. También se informan las
relaciones de los valores de UFC / g en suelo entre las líneas BD y BC y
UFC / gtierra
entre las líneas BD, en los dos valores de pH.
pH 4 pH 5 UFC / gtierra

Dilución del suelo pH 4 pH 5

Extensión 5,1 × 105± 2,3 × 105 3.9 × 106± 1,6 × 106
Línea BC 9,4 × 104± 10 × 104 8.0 × 105± 6,9 × 105
Inclusión 1,2 × 104± 1.0 × 104 1,6 × 106± 0,5 × 106
Línea BD 3.8 × 105± 3,9 × 105 1,2 × 106± 4,6 × 105
Placas de suelo 1.8 × 103± 1,1 × 103 1.0 × 103± 0,6 × 103
UFC / gtierra /UFC / gtierra

Línea BD / línea BC 1,9 3.2

Respecto al método de dilución del suelo, los valores obtenidos
para las técnicas de esparcimiento e inclusión a pH 4 fueron
diferentes (5.1 × 105 y 1,2 × 104 respectivamente), alrededor de
un orden de magnitud, mientras que a pH 5, la diferencia era
insignificante. Esto podría explicarse por el hecho de que el
método de inoculación influye principalmente en el crecimiento
de hongos filamentosos, generalmente aeróbicos; por el
contrario, el bacteriano se ve menos afectado. Por tanto, el suelo
analizado muestra un elevado número de microorganismos
autóctonos, ambos
ría (3.9 × 106 UFC / gtierra) y hongos (5.1 × 105 UFC /
gramotierra). La UFC / gtierra Los valores obtenidos con el método
de la placa de suelo a pH 4 se duplicaron con respecto a
a aquellos a pH 5 para el mismo orden de magnitud (1.8 × 10
3a pH 4 y 1.0 × 103 a pH 5). Al mismo tiempo, estos
resultados fueron inferiores a los encontrados con el
método de dilución del suelo, independientemente del valor
del pH.
Los mismos métodos, utilizados para la caracterización
microbiológica del suelo no incubado, se aplicaron al suelo,
adicionados o no con láminas NR (líneas BD y BC,
respectivamente), incubados en los microcosmos durante 97
días (Fig. . 2). Se tomaron muestras de suelo
Línea BDpH5 /BD 3,0
líneapH4
de cada uno de los tres microcosmos de las líneas BC y
BD; Los resultados obtenidos con los dos métodos de
inoculación en suspensión de suelo, difusión e inclusión,
han sido promediados y se muestran en la Tabla3.
Por lo tanto, para cada línea, un valor medio (UFC / gtierra) por
cada combinación de "tipo de microcosmos-valor de pH" fue
determinado.
Los resultados referidos al día 97 de incubación muestran
claramente que en presencia de láminas NR (BD
línea), la UFC / gtierra número de hongos filamentosos y
bacterias fue bastante mayor (3.8 × 105 y 1,2 × 106 a
pH 4 y pH 5 respectivamente) que el obtenido en los
microcosmos BC a ambos valores de pH (9,4 × 104 y
8.0 × 105 a pH 4 y pH 5 respectivamente).
La UFC / gtierra Los resultados se compararon entre
sí mediante la relación "líneas BD / BC", cálculo
con el mismo valor de pH, y la "línea BDpH5 /BD
líneapH4"Ratio, como se muestra en la Tabla 3. Los valores de
la relación de la línea BD / BC indican que en el micro BD
cosmos, colonias de bacterias y hongos fueron

Figura 2 Detalles de las

láminas NR colocadas en la
superficie del suelo: micelio
fúngico que cubre la superficie
en el 97th día de incubación

13
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 227 Página 8 de 15
más numerosos que los presentes en los controles BC:
más precisamente, aproximadamente el doble (1,9) a pH
4 y el triple (3,2) a pH 5. Este comportamiento podría
atribuirse a la presencia de NR, en el BD microcosmos,
como fuente adicional de carbono. Además, comparando
los resultados obtenidos en las líneas BD
en los dos valores de pH (línea BDpH5 /Línea BDpH4 relación), el
valor de la relación de 3 simplemente indica que el número
El número de colonias bacterianas fue mayor que el de las
fúngicas y no necesariamente que el papel de las bacterias
fuera predominante en la biodegradación del NR.
Otra comparación interesante, reportada en la
Tabla 4, fue el número de microorganismos en
incubado0) y suelo incubado a los 97 días. En la
línea BC, fue posible observar un drástico
disminución tanto de colonias bacterianas (−64%) como
de hongos (−61%) en comparación con las presentes
inicialmente en el suelo no incubado. Por el contrario, en
la línea BD, las colonias bacterianas se mantuvieron casi
estables (-16%) mientras que hubo un aumento notable
en las fúngicas (+ 47%). Al mismo tiempo, después de 97
días de incubación, en los microcosmos BD, se ha
observado que las láminas NR, colocadas en la superficie
del suelo, fueron colonizadas extensamente por
abundantes hifas fúngicas: NR puede representar una
fuente alternativa de C para estos microorganismos
capaces de secretar enzimas extracelulares, como ya ha
sido demostrado en cultivos líquidos por Mollea y Bosco (
2020).
Los resultados informados en la tabla 4 de acuerdo con
las imágenes de la Fig. 3, a los 97 días de incubación, donde
se muestra una comparación de los microorganismos en las
líneas BC y BD. En las placas de MEA preparadas a pH 4, la
diferencia en el número de colonias de hongos entre la línea
BC (izquierda) y el control BD
Cuadro 4 Los valores de UFC / g de suelo del suelo no incubado y después
de 97 días de incubación, para el suelo de las líneas BC y BD, a pH 4 y pH 5,
mostraron que los resultados son un promedio de los obtenidos con los dos
métodos diferentes de dilución del inóculo del suelo. . También se muestra
el% de variación en las colonias microbianas.
pH UFC / gtierra no- UFC / g
IllinoisF
suelo incubado 97 díasentonceso
(t0) incubación
4 2,6 × 105 Línea BC 9,4 × 104
Línea BD 3.8 × 105
5 2,8 × 106 Línea BC 8.0 × 105
Línea BD 1,2 × 106
13
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Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
(derecha), a los 97 días de incubación, fue notable
(Fig. 3a). Por el contrario, en placas de MEA a pH
5, no se evidenció una diferencia significativa en el
número de colonias bacterianas (Fig. 3b).
3.2 Estimulación de la actividad microbiana en el
microcosmos
Se ha evaluado la actividad y crecimiento de la biomasa,
en todos los microcosmos, mediante respirometría
mediciones; más precisamente, CO2 se controló la
producción.
La humedad relativa (HR%) del suelo se mantuvo al 35%
mediante la adición de agua destilada en el transcurso del
tiempo de la incubación. La presencia de agua disponible en
el suelo del microcosmos es fundamental porque, según
informa Mastalygina et al. (2020), el agua puede absorberse
en la estructura NR y la hace susceptible a la actividad de
microorganismos que degradan el suelo.
Además, siempre que una desaceleración en el CO2
se observó producción, probablemente debido a un desequilibrio
relación C / N aumentada, se adicionó 10 ml de medio CZ (sin
glucosa y con doble concentración de sales), con el fin de
evitar una disminución de la concentración microbiana.
crecimiento. En la Fig.4, el comportamiento del CO
total2 producción en BC (cuadrados en el gráfico) y BD
(triángulos en el gráfico) se reporta microcosmos. En
cualquier caso, la adición de medio CZ tuvo un posi-
efecto positivo sobre el CO2 producción; sin embargo,
fue posible observar que en los microcosmos BD, el
CO total2 producidos fue mayor que en los BC. Al
comienzo de la incubación, alrededor de 13 días,
las dos curvas se superpusieron, probablemente en relación
con los nutrientes inicialmente presentes en el suelo y
fácilmente explotables en los microcosmos BC y BD. Después
de la primera adición de medio CZ (12 días), fue posible
ble para observar un CO más alto2 producción en líneas BD.
La diferencia en CO2 La producción entre las líneas BC y BD
aumentó durante el tiempo de incubación y, después
100 días, el CO total2 producido en los microcosmos
BD fue más del doble (674 mg) que el de
los controles bióticos (290 mg). Muy probablemente, esta
Variación %
diferencia podría explicarse por la presencia de NR como
fuente adicional de C en los microcosmos de BD.
−64
3.2.1 Suplementación de suelo fresco
+ 47
−61
Después de 99 días de incubación, la cantidad de suelo en el
−16
microcosmos se redujo casi a la mitad debido al muestreo
Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
Fig. 3 Recuentos viables de
MEA a pH 4 (a) y pH 5 (B)
para el suelo muestreado de
los microcosmos BC y BD en
el 97th día de
incubación (dilución 1: 100)
para el control de la humedad y el pH, y para los ensayos
microbiológicos. En ese momento, se devolvió al valor inicial
(200 g) mediante la suplementación de suelo fresco (el
mismo que se utilizó para el montaje del microcosmos). El
valor de HR se ajustó al 35% añadiendo agua destilada. En
todos los tipos de microcosmos (es decir, líneas BC y BD), la
adición de suelo promovió el crecimiento de la biomasa (ver
Fig.4). Como están las cosas
posible observar a partir del CO total2 tendencia de producción,
el efecto positivo de la suplementación de suelo fresco
La adición de nutrientes orgánicos y sal aumentó la
actividad microbiana en ambos tipos de microcosmos.
Este aspecto fue particularmente evidente en
Microcosmos BC donde una marcada disminución de CO2
La producción se registró entre los años 80 y
99 ° día de incubación: después de la adición de suelo fresco
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Página 9 de 15 227
(Día 100), una recuperación en el CO2 la producción fue
evidente a pesar de que con una tasa inferior a la de
la línea BD.
3.2.2 Aireación del suelo
Durante el tiempo de incubación, el suelo franco limoso
indujo la estratificación del agua en la interfaz con
la fase gaseosa, obstaculizando el O2 intercambio entre
la fase gaseosa y el suelo. Como consecuencia, el aero-
Se inhibió el metabolismo bic, que es el principal
mecanismo de biodegradación. Para evitarlo, a partir del
día 183 de incubación, el suelo se mezcló periódicamente
en cada microcosmos. Como se muestra en la Fig.5,
en los 6 días posteriores a la primera mezcla, el CO2 La tasa de
producción creció rápidamente (14,7 mgCO2 /día). Después,
13
 227 Página 10 de 15 Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227

Figura 4 CO total2 tendencias de 1600

producción en la Columbia Británica y
Líneas BD. Las flechas
indican la adición del medio 1400
CZ (sin glucosa y con una
concentración de sal doble).
La línea vertical en el día 100 1200
indica the flexible
mentación de suelo fresco
1000

CO2 (mg) 800

600

400

200

Línea BD Línea BC
0
0 50 100 150 200 250
Tiempo (días)

los microcosmos se dejaron, sin mezcla alguna, por un 3,3 mgCO2 /día. En particular, entre el día 205 y el
período de incubación más largo de 18 días, durante 209, se registró un estado estable. Sin embargo-
que el CO2 la producción disminuyó a una tasa de menos, después de la tercera mezcla, realizada en la 209a.

Figura 5 Influencia de la aireación

del suelo en la tendencia de 2
producción total de CO 1350

1300

1250
CO2 (mg)

1200

1150

Línea BD
1100
180 190 200 210 220
Tiempo (días)

13
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Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
día, el CO2 la tasa de producción tuvo una reanudación, y
alcanzó un valor de 13,3 mgCO2 /día, muy similar al
obtenido después de la primera mezcla.
3.2.3 Efecto de la adición de NR en microcosmos BC
Con el fin de confirmar el efecto estimulante de NR sobre
microorganismos autóctonos biodegradantes, después
de 68 días de incubación, se diversificaron los
microcosmos de la línea BC y se evaluó el efecto de la
adición de diferentes fuentes de C (es decir, glucosa y
NR). Más precisamente, las sales inorgánicas del medio
CZ se agregaron en todos los microcosmos: BC one
permaneció invariable, se agregó glucosa en el
microcosmos BC-G y se colocaron láminas NR en el suelo
del microcosmos BC-NR.
Durante el tiempo de incubación, los microcosmos mostraron
un comportamiento diferente (Fig. 6). En el duodécimo día de
incubación, BC (triángulos blancos) tenía la baja
est CO2 tasa de producción, 2 mgCO2 /día, y BC-G
(cuadrados negros) mostró un aumento previsible, 12
mgCO2 /día, debido a la adición de la fuente C de fácil
uso. Por el contrario, BC-NR (cuadrados blancos)
mostró un CO2 tasa de producción, 3,75 mgCO2 /día, simi-
lar al de la línea BD, 4.58 mgCO2 /día (triángulos
negros), lo que confirma que el NR representa, para
Figura 6 CO2 tendencias de 1600
producción en la línea BD y
en las líneas BC agregadas o
no con fuente de C (glucosa o 1400
NR)
1200
1000
CO2 (mg)
800
600
400
200
80
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los microorganismos del suelo, una fuente de C que puede
biodegradarse pero no es fácil de metabolizar. Este hecho también
fue confirmado por las tendencias de las curvas respirométricas en los
últimos 36 días de incubación (día 200 ÷ 236): mientras que las curvas
BC y BC-G mostraron una significativa
ralentización significativa del CO2 tasa de producción seguida
por un estado estacionario, 1,25 mgCO2 /día y 1,11 mgCO2 /
día, respectivamente, las curvas BD y BC-NR fueron
sigue creciendo con una tasa comparable, 4.72 y 4.55
mgCO2 /día respectivamente. Estos comportamientos permiten describir la
biodegradación del NR como un proceso lento pero continuado.
Fenómeno uous. Además, el CO2 producción
tasa de la curva BC-NR (4.55 mgCO2 /día), en estos
últimos días de incubación, era muy similar a la del
Línea BD (4,58 mgCO2 /día) al día 12.
Aunque la tendencia de respirometría de BC-NR fue
comparable a la de los microcosmos BD, después de 100
días de incubación, la pérdida total de peso seco de las
láminas NR fue del 3,8%, aproximadamente la mitad de la
obtenida, en el mismo período, en los microcosmos de la
línea BD (7,5%), como se describirá en el párrafo 3.4.2.
3.3 Análisis en hojas NR
El grado de biodegradación de las láminas NR se
evaluó mediante el cálculo de la pérdida de peso seco;
Línea BD
antes de Cristo
BC-G
BC-NR
100 120 140 160 180 200 220 240 260
Tiempo (días)
13
 227 Página 12 de 15
además, se realizaron micrografías SEM de las muestras,
antes y después de la incubación, con el fin de
caracterizar los cambios morfológicos de la superficie del
caucho debido al proceso de biodegradación.
3.3.1 Determinación de la pérdida de peso seco NR
El peso seco de todas las muestras NR se midió antes de
la preparación de los microcosmos. Durante el período
de incubación, a la hora especificada en la Tabla5, se
extrajo una hoja NR de cada uno de los tres
microcosmos BC y BD y se lavó para eliminar las
partículas del suelo y la biomasa. El peso seco de cada
hoja se evaluó nuevamente usando el procedimiento
descrito en la sección de Materiales y Métodos.
En mesa 5, los resultados obtenidos en la línea BD
Los microcosmos se compararon con los del
microcosmos BC-NR. A partir de los valores reportados,
es posible observar que el% de pérdida de peso de las
láminas NR, derivadas de los microcosmos BD, fue
siempre mayor que las de las BC-NR; por tanto, la
pérdida de peso provocada por la actividad de
biodegradación prevaleció sobre la degradación química.
Al final del período de incubación, 236 días, la pérdida de
peso en el microcosmos BC-NR fue igual al 3,7%,
aproximadamente una cuarta parte de la de la línea BD,
15,6%. En el microcosmos BD, se agregaron láminas NR
al inicio de la prueba, lo que explica la mayor pérdida de
peso, mientras que en el BC-NR se colocaron 70 días
después. Además, en lo que respecta al microcosmos
BD, el mayor tiempo de incubación, en presencia de NR,
ha permitido la selección de la biomasa biodegradable
NR.
El resultado obtenido en la línea BD se puede comparar
con el informado por Mastalygina et al. (2020), quien
describió un experimento de degradación de NR mediante
una prueba de suelo a gran escala. Encontraron una pérdida
de peso seco NR similar, 16,2%, en un período de incubación
de 45 días, que es cinco veces menor que la reportada en
Cuadro 5 % De pérdida de peso seco de las hojas NR en el BC-NR
microcosmo y línea BD
Tiempo (días) Microcosmos BC-NR Línea BD
76 1,9 ± 0,3 7,5 ± 0,5
163 2,2 ± 0,3 12,3 ± 1,2
197 3,1 ± 0,1 12,9 ± 1,4
236 3,7 ± 0,1 15,6 ± 2,5
13
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Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
el presente trabajo. Hay que subrayar que el suelo,
utilizado en el trabajo mencionado, fue formulado con
porciones ricas como tierra de jardín y estiércol de
caballo. Por el contrario, en el presente trabajo se utilizó
un suelo franco limoso pobre sin más modificaciones.
Sobre este aspecto, diferentes autores han informado
que la tasa de biodegradación depende, entre diferentes
factores, del tipo de suelo (Doi & Fukuda,2013; Grima y
col.,2000).
Los valores porcentuales de pérdida de peso, obtenidos a
163, 197 y 236 días de incubación, probablemente se
subestimaron porque el método de lavado, adecuado
para láminas NR muestreadas a los 76 días, ha resultado
ineficaz para eliminar las partículas del suelo y la
biomasa de la superficie del caucho incubado durante
más tiempo. En este último caso, la biomasa filamentosa
penetró en el interior de la estructura NR incrustando
partículas de suelo y dificultando el lavado. Por el
contrario, en las láminas NR, recogidas a los 76 días de
incubación, la biomasa se adhirió débilmente a la
superficie y, por tanto, fue más fácil de eliminar. Estos
resultados, obtenidos en los dos tiempos de incubación,
también fueron evidenciados por análisis SEM, como se
informa en el párrafo 3.4.2.
3.3.2 Micrografías SEM
La extensión de la colonización microbiana, en particular la
fúngica, se ha evaluado en el transcurso del tiempo del
experimento de biodegradación por medio de micrografías
SEM. Se han tomado muestras periódicas de las hojas de NR
de los microcosmos; Los fragmentos de muestra se cortaron
y analizaron sin ningún tratamiento (los fragmentos solo se
han limpiado suavemente para eliminar las partículas
gruesas del suelo) o después del procedimiento de lavado
(ver la sección Material y métodos) para eliminar toda la
biomasa que había colonizado el caucho. Como se muestra
en la Fig.7, después de 42 días de incubación, el micelio era
evidente en áreas limitadas de la superficie del caucho;
además, la colonización fue principalmente superficial (ver el
lado derecho de la (a) micrografía). Por el contrario, al final
del tiempo de incubación, 236 días, la capa de micelio era
más gruesa; cubría extensamente toda la superficie de
caucho, y la red difusa de hifas estaba fuertemente anclada a
la superficie (como se muestra en el lado izquierdo de la (b)
micrografía). El ancho de la unión de los hongos a la
superficie NR también ha sido evidenciado por los resultados
del procedimiento de lavado en los dos tiempos de
incubación. Después de 42 días,
Contaminación del suelo del aire del agua (2021) 232: 227
Figura 7 SEMmicrografías
del micelio desarrollado en la
superficie NR (modo SE). a, b
NR sin lavar después de 42 y
236 días de incubación
respectivamente, mientras
CD son las muestras lavadas
relacionadas
la goma parece limpia con huellas hacia afuera de las
hifas removidas (como lo indican las flechas en la Fig. 7c)
que muestra la eficacia del lavado. Por el contrario, a los
236 días, el micelio estaba estrictamente conectado al
caucho y, por esta razón, una capa de hifas ancladas
permanecía estrictamente adherida a la superficie
incluso después del vigoroso tratamiento de lavado (Fig.
7d).
4. Conclusiones
En el presente trabajo, se prepararon pruebas de
microcosmos para verificar la capacidad de la microflora
autóctona del suelo para biodegradar el caucho natural.
Para ello, se incubaron láminas de NR durante
aproximadamente 6 meses en microcosmos del suelo y se
evaluó la actividad y el crecimiento de la biomasa mediante
actividad respirométrica y conteos microbianos, mientras
que la degradación de NR se determinó mediante pérdida de
peso seco y análisis SEM.
A partir de las mediciones respirométricas, se estableció
que la biomasa del suelo autóctono fue capaz de
utilice el NR como la única fuente de C, ya que el CO2 producción
en los microcosmos que contienen las muestras NR
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era considerablemente más alto que aquellos sin ellos. La
pérdida de peso seco de las láminas NR incubadas confirmó
que el consorcio microbiano “seleccionado naturalmente”
pudo biodegradar eficientemente el polímero: después de
236 días de incubación, las muestras NR de los microcosmos
de la línea de biodegradación (BD) mostraron un pérdida de
peso del 15,6%, aproximadamente cuatro veces superior a la
obtenida en el control biótico añadido con NR (3,7% en el
microcosmos BC-NR).
Las micrografías SEM resaltaron los cambios
morfológicos ocurridos en la superficie NR y
permitieron observar que las hifas fúngicas
penetraron en el caucho creando canales y pliegues;
este fenómeno requiere un tiempo de incubación
bastante largo, del orden de unos 2 meses.
La biodegradación se lleva a cabo principalmente por biomasa
aeróbica, especialmente hongos filamentosos; por lo tanto, era
fundamental mezclar periódicamente el suelo para asegurar
una distribución homogénea de O2 y el mantenimiento
del metabolismo aeróbico durante mucho tiempo
períodos. Para los microorganismos, el NR parece ser
una fuente de C, inmediatamente disponible aunque
difícil de usar, lo que hace que la biodegradación sea
un fenómeno continuo pero muy lento (orden de
meses).
13
 227 Página 14 de 15
Dado que la superficie específica es una de las principales
variables que controlan el rendimiento de biodegradación en
una fase sólida granular, es necesario proporcionar un
pretratamiento de NR para reducir su tamaño.
Los resultados obtenidos en el estudio del microcosmos,
realizado a escala de laboratorio, proporcionaron información
útil en términos de aireación del suelo y enmienda de nutrientes
con miras a una futura ampliación del proceso de
biodegradación.
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http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
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