Degradación y reciclaje biológico del PET

Millán Cáceres, Maria Fernanda 1 Jiménez Avella, Diego 2

Resumen

El tereftalato de polietileno (PET) es un material altamente recalcitrante en el medio ambiente. Su

producción ha ido en aumento en los últimos años y gracias a su mal manejo y uso masivo, ha sido
reconocido como una amenaza para el medio ambiente y la salud humana. Varios mecanismos se
han usado para el manejo de este material, sin embargo, son costosos, liberan contaminantes y
requieren alta energía. Es por esto que, la biodegradación mediante el uso de enzimas hidrolíticas
producidas por microorganismos ha surgido como una alternativa sostenible y viable para el
manejo de residuos de PET. En los últimos años varias enzimas con potencial han sido
caracterizadas, y, además, gracias a esfuerzos de ingeniería, se han mejorado su habilidad para
degradar los enlaces éster del PET, su termoestabilidad y la caracterización de rutas metabólicas.
Lo anterior permite abrir las puertas a la economía circular y al upcycling.

Palabras clave:
Tereftalato de Polietileno, biodegradación, hidrolasas de PET, bio reciclaje, upcycling.
Los plásticos sintéticos se conforman de largas cadenas de polímeros derivados de subproductos
de combustibles fósiles (Magalhães, Cunha & Sousa, 2021). Estos se caracterizan por ser livianos
y tener propiedades tanto físicas como químicas muy estables, lo que lo hacen muy duraderos y,
por ende, una opción prioritaria para muchas aplicaciones industriales. La producción de plásticos
sintéticos ha sido un hito en la historia, actualmente se usan de manera masiva y son utilizados en
gran variedad de sectores, específicamente para empaquetamiento y construcción. Haciéndolos así
necesarios para la sociedad moderna (Thompson et al. 2009). Adicionalmente, tiene un bajo costo
debido a que los procesos de producción están bien establecidos y cuentan con una alta capacidad
(Barnes et al., 2009; Andrady, 2011; Hidalgo-Ruz et al., 2012.).

Debido a la amplia aplicación de los plásticos en la vida cotidiana, desde inicios del siglo XXI, la
producción de plástico ha incrementado de manera acelerada debido a su alta demanda y, como
consecuencia de su pobre manejo, la generación de residuos plásticos se ha triplicado en las últimas
dos décadas (Beat Plastic Pollution, 2020). Se espera que para el año 2050, si se continúa con las
tasas de consumo actuales, se llegaría a producir 33.000 millones de toneladas de plástico
(Rochman et al. 2013; Zimmermann 2020). Los principales plásticos son el polietileno de alta y
baja densidad, el polipropileno, el poliestireno, el tereftalato de polietileno (PET), entre otros.

Específicamente el PET, al ser un material de vida corta y de un solo uso, su uso indiscriminado y
manejo inadecuado a la hora de disponerlo, resulta en una gran cantidad de plástico acumulado en
el ambiente. Esto lo convierte en una gran preocupación debido a que este, es un material altamente
recalcitrante y de pobre capacidad para ser biodegradado en condiciones ambientales (Webb et al.,
2013). En consecuencia, este exceso de plástico presenta varios riesgos tanto a ecosistemas
marinos como terrestres y, eventualmente a los humanos (Thompson et al., 2020). En particular,
los micro plásticos, los cuales son potencialmente peligrosos debido a su toxicidad a la hora de ser
ingeridos o inhalados. Ya que, pueden llegar a liberar compuestos químicos considerados
peligrosos para la salud. A este tipo de perturbación ambiental, se le denomina “contaminación
plástica”.
Hoy en día, se utilizan dos estrategias muy comunes para el manejo de los plásticos. La primera,
es la deposición en rellenos sanitarios, los cuales presentan sin número de desventajas. A pesar de
que los desechos plásticos expuestos en el ambiente pueden ser degradados por foto, bio, y termo
despolimerización oxidativa, esto puede llegar a tomar un largo periodo de tiempo (desde 50 a
incluso más de 100 años) e incluso no logran tener un efecto significativo sobre el material (Barnes
et al., 2009; Browne et al., 2011; Mohanan et al., 2020). Aquí la degradación de estos desechos es
lenta también debido a las condiciones anaeróbicas en el que se encuentra el vertedero (Samak et
al., 2020), y su acumulación en el tiempo lleva a la contaminación de aguas subterráneas y,
ecosistemas marinos y terrestres (Magalhães et al., 2021).

La segunda, es la incineración, lo que conlleva a la generación de compuestos tóxicos y volátiles

como furanos y dioxinas (Li et al., 2001), los cuales representan peligro a la salud humana. Debido
a la actual escasez de espacio para depositar los residuos, el alto costo y la generación de
compuestos tóxicos, la baja efectividad de estas dos estrategias, hace que esta problemática sea
una preocupación a nivel global. Es por esto por lo que, el reciclaje industrial se ha convertido en
una alternativa para lidiar con los desechos plásticos (Samak et al., 2020). El objetivo de este
reciclaje (Figura 1.) es el de convertir los desechos plásticos en materiales que pueden ser
reutilizable de nuevo. Esta implica un menor uso de energía y recursos, y adicionalmente también
permite disminuir la huella de carbono a diferencia que con la producción de novo de plástico
(Quartinello et al., 2017; Maurya, et al., 2020).

El reciclaje mecánico no cambia la estructura del polímero, es el mecanismo más usado y tiene un
buen costo beneficio. En general en este proceso se recolecta, muele y desinfecta el material para
finalmente fundirlo, darle forma y reutilizarlo. A pesar de esto, este método no es aplicable para
plásticos multicapa o que son sensibles a la temperatura ya que dan como resultado el deterioro
del material (Scalenghe, 2018; Magalhães et al., 2021). Adicionalmente, también se ha observado
que los productos formados a partir de residuos de PET reciclados mecánicamente son de mala
calidad debido al estrés mecánico y la fotooxidación causados por el calor de fusión (Park & Kim,
2014; Kawai et al., 2019; Maurya et al., 2020). Además, este tipo de reciclaje representa un peligro
para la salud humana y el medio ambiente debido a que es fuente de compuestos orgánicos tóxicos
(Al-Sabagh et al., 2016; Magalhães et al., 2021).

El reciclaje químico, consiste en la degradación del polímero en unidades más sencillas que son
los monómeros, los cuales serán re sintetizados para la manufactura de nuevos productos. Para
lograr este rompimiento y cambio en su estructura química, se hace uso de catalizadores selectivos
y activos, los cuales son productos químicos agresivos que van a permitir que se den estos tipos
de reacciones (Park & Kim, 2014). Esto se realiza mediante procesos como glicolisis, basada en
glicol; hidrolisis, basada en ácidos fuertes y la aminolisis, basado en aminas; entre otros (Joo et
al., 2018; Maurya et al., 2020). El problema de esta vía es que es costosa, requiere un alto uso de
energía y es peligrosos debido a que se generan compuestos orgánicos volátiles (Paszun &
Spychaj, 1997; Karayannidis & Achilias, 2007; Maurya et al., 2020)

A pesar de que estos dos mecanismos de reciclaje son usados, no dejan de ser un riesgo para el
medio ambiente y la salud. Y adicionalmente, solo una pequeña fracción de los desechos plásticos
son reciclados, por lo que no es suficiente para manejar los desechos plásticos en una creciente
industria (Samak et al., 2020).
Es por esto que inicia el interés en mecanismos con menor impacto tanto en el ambiente como para
la salud humana. La biodegradación es un mecanismo que ha ido ganando atención, esta estrategia
es mediada por microorganismos, en este caso, se da el rompimiento del polímero plástico en sus
monómeros (Focht, 2021; Magalhães et al., 2021) gracias a la excreción de enzimas y metabolitos
extracelulares (Bryant et al., 2016; Montazer et al., 2020; Magalhães et al., 2021). En este sentido,
ocurre la unión de la enzima a la superficie del plástico, esta cataliza la ruptura del enlace del
polímero en monómeros que finalmente pueden ser usados por los microorganismos como fuente
de carbono o recurso de energía (Mohanan et al., 2020). A pesar de que los petro plásticos no son
compuestos químicos naturales, gracias a la hidrofobicidad de la superficie plástica, los
microorganismos son capaces de formar biopelículas sobre la superficie y así logran potenciar el
proceso de degradación (Kale et al., 2015; Samak et al., 2020). Actualmente, se ha llegado a
registrar alrededor de 90 microorganismos capaces de degradar este material, la mayoría en
condiciones in vitro (Jumaah, 2017; Mohanan et al., 2020). Y también, se han logrado identificar
enzimas de tipo lipasa, esterasas, PETasas y cutinasas (Wang et al., 2008; Ribitsch et al., 2011;
Ma et al., 2012; Bollinger et al., 2020; Maurya et al., 2020).

Debido a la gran diversidad de estructuras químicas que tienen los plásticos sintéticos, cada uno
muestra una distinta susceptibilidad a la degradación por parte de las enzimas secretadas por los
microorganismos (Zimmermann, 2017, 2020). Los mecanismos de biodegradación para residuos
plásticos están relacionados con los tipos de enlaces que hay en las cadenas del polímero. Es por
esto por lo que los mecanismos de degradación de petroplásticos se pueden clasificar en tres grupos
Polímeros con esqueleto de carbono; polímeros con cadenas laterales de enlace éster; y polímeros
con enlaces hetero/ carbamato(uretano) (Mohanan et al., 2020). Mientras los polímeros que
contienen esqueleto de carbono son difíciles de atacar por enzimas debido a su estructura, los
plásticos que contienen enlaces éster como el PET, pueden ser blanco de enzimas para ser
degradados y reciclados (Zimmermann, 2020).

Figura 1. Tipos de reciclaje usados actualmente para los residuos plásticos.

PET
El PET es uno de los principales petro plásticos que más se producen a nivel mundial ya que es
usado para la fabricación de botellas, envases y fibras textiles debido a su peso ligero, durabilidad
y resistencia química (Zimmermann, 2020). Su producción ascendió a 56 millones de toneladas en
el año 2013 (Neufeld et al., 2016; Mohanan et al., 2020). A pesar de que solo constituye una
pequeña parte de todos los residuos plásticos que hay, este es el material más factible para
someterlo a un proceso de biodegradación mediante el uso de hidrolasas de poliéster microbianas
(Zimmermann, 2020).
El PET es un poliéster sintetizado por la policondensación del ácido tereftálico (TPA) y etilenglicol
(EG) (Figura 2.), formando así un polímero poliéster semi aromático (Hiraga et al., 2019; Maurya
et al., 2020). Este polímero se caracteriza por tener microestructuras tanto amorfas como
cristalinas y esta última característica es la que va a determinar el grado de biodegradabilidad del
polímero. Ya que debido a que las estructuras cristalinas son regiones muy ordenadas, estas no
pueden ser atacada fácilmente por enzimas microbianas (Zimermmann & Billig, 2010;
Zimermmann, 2020) y es por esto que la tasa de biodegradación decrece con el aumento de la
cristalinidad de la estructura del plástico (Taniguchi).

Este poliéster aromático tiene una alta temperatura de transición vitrea (Tg) de 60-65 °C en
solución acuosa (Kawai et al., 2014; Mohanan et al., 2020). Esto significa que a esta o sobre esta
temperatura, las regiones amorfas del polímero van a iniciar un movimiento macromolecular,
haciendo que estas regiones sean más flexibles y de mayor acceso para el ataque enzimático
microbiano (Mohanan et al., 2020). Entonces cuando se hace reaccionar al PET con una hidrolasa,
se obtienen los principales productos que son TPA y EG, los cuales son monómeros benignos en
el ambiente (Taniguchi et al., 2019). Y unos productos de hidrolisis transitorios que son tereftalato
de bis- (2-hidroxietilo) (BHET) y el tereftalato de mono – (2-hidroxietilo) (BHET) (Zimermmann,
2020).
De lejos, PET ha sido el polímero más estudiado en términos de biodegradación y se ha enfocado
en identificar hidrolasas capaces de clivar enlaces éster de los dominios amorfos del PET
(Taniguchi et al., 2019). Estas enzimas suelen degradar con la ayuda de moléculas de agua. Como
resultado, se han encontrado un gran número de enzimas con posible rol degradador, sin embargo,
el número de hidrolasas que son eficientes para este proceso, aun son muy limitadas. Tan solo
cuatro hidrolasas de PET (cutinasas) han sido identificadas como degradadoras eficientes del
polímero en sus monómeros (Kawai et al., 2020; Samak et al., 2020).
 E
G

Hidrolasa T
P
+𝑯𝟐 𝑶
A

PET B
H
E
T

M
H
E
T

Figura 2. Estructura química del PET y sus productos de degradación. Fuente:

Adicionalmente, se debe tener en cuenta que hay varios factores que restringen el ataque
enzimático a este tipo de plástico: temperatura, pH, grupos funcionales mínimamente reactivos en
la estructura, la movilidad de la cadena, la cristalinidad y, la hidrofobicidad de la superficie
(Taniguchi et al., 2019). Y también, la estabilidad intrínseca de la enzima.

A la fecha, se ha logrado identificar muy bien 24 diferentes enzimas hidrolíticas de PET (PHE)
(Magalhães et al., 2021) pertenecientes a lipasas, cutinasas y esterasas (Sulaiman et al., 2012;
Yoshida et al., 2016; Magalhães et al., 2021). Estas PHE se caracterizan por pertenecer a una
misma clase, la 3.1, las cuales actúan sobre enlaces éster (Ogata et al., 1999; Magalhães et al.,
2021). Estas enzimas presentan uno o dos enlaces de disulfuro, los cuales tienen un rol crítico en
la integridad y estabilidad de la enzima (Magalhães et al., 2021). Adicionalmente, presentan el
mismo dominio catalítico conservado (triada catalítica) y un plegamiento típico alfa/beta.

Este dominio catalítico tiene tres residuos de aminoácidos que funcionan juntos en el sitio activo
de estas enzimas y se encargan de romper el enlace éster. Esta triada catalítica se conforma de una
serina (nucleófilo), una histidina y un residuo cargado negativamente que puede ser un aspartato
o glutamato (Rajagopalan et al., 2014; Magalhães et al., 2021). Para poder estabilizar la reacción
de rompimiento, se encuentra un oxianión, el cual se compone de dos o tres residuos (Ordentlich
et al., 1998; Magalhães et al., 2021). Es importante mencionar que la temperatura es una de las
principales variables que afecta la actividad de las enzimas y en este caso, la temperatura de fusión
enzimática (Tm) es aquella que se relaciona con la estabilidad y actividad catalizadora de la PHE.

El mecanismo general que se ha propuesto para la degradación de PET es que el microorganismo

libera PHE y estas se van a unir a la superficie del plástico, esto da lugar al acortamiento de la
cadena del polímero (hidrólisis) reduciendo su peso molecular y produciendo oligómeros, dímeros
y monómeros que serán solubles en agua. Estas unidades son capaces de atravesar la membrana
celular y así poder ser integrado al metabolismo celular vía el ciclo del ácido tricarboxilico y usada
como fuente de carbono por el microorganismo (Samak et al., 2020).

Enzimas que hidrolizan PET

La biodegradación de este tipo de plástico es un descubrimiento impresionante ya que dan una luz
en cuanto a la biorremediación en sitios contaminados con plástico. Estas enzimas tienen la
capacidad de hidrolizar PET debido a su solubilidad en agua (Khairul-Anuar et al., 2022). Esto les
permite asimilar los monómeros como fuente de carbono que luego se metabolizan en 𝐶𝑂2, 𝐻2 𝑂 ,
𝐶𝐻4 y 𝑁2 (Seo et al., 2009; Khairul-Anuar et al., 2022). Este tipo de enzimas comparten varias
características como, por ejemplo, un sitio activo estrecho, una hendidura activa que tiene
macromoléculas aromáticas y afinidad por materiales hidrofóbicos en la región activa (Gao et al.,
2021) (Tabla 1.).
Cutinasas
La mayoría de las enzimas capaces de degradar PET son de tipo cutinasas (E.C 3.1.1.74) las cuales,
son producidas en su mayoría por microorganismos saprófitos. Presentan una triada catalítica
conservada de tipo Ser-His-Asp (Egmond & de Vlieg, 2000; Maurya, et al., 2020) y presentan un
puente de disulfuro. Las cutinasas catalizan la ruptura de los enlaces éster de la cutina para ser
usados como fuente de carbono (Maurya et al., 2020). En el sitio activo de estas enzimas, se pueden
acomodar compuestos de alto peso molecular, por lo que son capaces de hidrolizar naturalmente
una amplia variedad de poliésteres sintéticos como el PET (Tabla 1.) (Dimarogona et al., 2015;
Maurya et al., 2020). En los últimos años, las cutinasas han llamado la atención de muchos
investigadores debido a que poseen propiedades que hacen posible la degradación del PET ya que
son capaces de producir TPA con alta eficiencia en condiciones de reacción suaves (Furukawa et
al., 2019).

Lipasas
Las lipasas (EC 3.1.1.3) son enzimas capaces de catalizar la hidrolisis de enlaces éster, sin
embargo, su actividad es baja. Esto se debe a que las lipasas presentan una cadena de polipéptidos
sobre el sitio activo (Brocca et al., 2009; Gonzales- Bacerio et al., 2010). Esta característica hace
que el sitio activo este protegido y, por ende, la lipasa se mantenga inactiva. Para su activación, se
requiere de la activación interfacial lo que significa que debe haber la presencia de una interfaz
insoluble y una fase acuosa (Reis et al., 2009) para desplegar al máximo su actividad catalítica
(Malcata, 1996; Ransac et al., 1996; Gonzales- Bacerio et al., 2010). La presencia de la tapa sobre
el sitio activo debilita la canalización del sustrato hacia los sitios de unión del sustrato, lo que
podría reducir la actividad de hidrólisis, especialmente en condiciones desfavorables (Khairul-
Anuar et al., 2022). Es importante mencionar, que la información disponible acerca de su potencial
como degradador de poliésteres aun es muy limitado.

Esterasas
Las esterasas son enzimas capaces de hidrolizar ésteres usualmente de cadena corta con regiones
alifáticas pero su actividad se limita a acil esteres de cadena corta (Maurya et al., 2020). Presentan
una triada catalítica conformada por Ser-Asp-His (Lee et al., 2017).
Carboxil esterasas
Las carboxil esterasas (EC 3.1.1.1) presentan una triada catalítica conformada por Ser- His- Glu.
tiene una amplia especificidad de sustrato debido a su sitio activo abierto y un bolsillo de unión
distintivo que permite la unión con un amplio rango de sustratos (Sood et al., 2018). Las
carboxilesterasas se caracterizan por hidrolizar acil gliceroles de cadena corta y solubles en agua
(<10 átomos de carbono) (Chahinian et al., 2005; Hotta et al., 2002; Khairul-Anuar et al., 2022).

PETasa y MHETasa
La PETasa (EC 3.1.1.101) muestra la mayor actividad hidrolítica de PET a temperatura ambiente,
aunque es termolábil (Taniguchi et al., 2019). Presentan una triada catalítica conformada por Ser
160- His237- Asp206 (Magalhães et al., 2021). Esta enzima tiene un sitio de unión elongado el
cual se divide en dos subsitios: En el subsitio I, los enlaces éster son rotos en el sitio de escisión
mientras que en el subsitio II, proporciona un espacio para que se den interacciones hidrofóbicas
y el resto del polímero se pueda adherir al sustrato (Taniguchi et al., 2019).

Esta es una enzima producida por Ideonella sakaiensis y es capaz de degradar PET en MHET y
TPA como productos principales (Magalhães et al., 2021). Esta enzima presenta dos puentes de
disulfuro los cuales le otorgan a la PETasa una mayor estabilidad térmica. Adicionalmente, se
identificó otra enzima producida por I. sakaiensis perteneciente a la familia de las tanasas llamada
MHETasa (EC 3.1.1.102) (Kawai et al., 2014) la cual trabaja en conjunto con la PETasa para
degradar por completo el PET en sus monómeros. En ese orden de ideas, la PETasa rompe al PET
en oligómeros y la MHETasa rompe estos oligómeros en monómeros que pueden ser usados
posteriormente como fuente de energía. Esta enzima es capaz de degradar a MHET usando la
serina para realizar un ataque nucleofílico al grupo carbonílico (C=O) (Pinto et al., 2021; Khairul-
Anuar et al., 2022).

Mecanismo propuesto para PETasa y MHETasa

Magalhães et al. Explica en su trabajo una compilación del mecanismo propuesto de la PETasa
basado en la unión de cuatro moieties a la enzima (Figura 3.). Esta se divide en dos pasos,
generación de corte en PET y etapa de digestión final. Este inicia con la unión de la PETasa al
sustrato (PET) en el subsitio I, que es donde se dan las reacciones catalíticas mientras que las otras
tres unidades de PET se unen de manera hidrofóbica al subsitio II. En esta posición, el enlace éster
se encuentra en una posición que favorece que sea atacado. His 237 desprotona a Ser160 y Ser160
se vuelve más reactivo y ataca al grupo carbonilo del enlace éster. Cuando este ataque ocurre, el
oxianión (Met161 y Tyr 87) estabiliza la reacción. Una vez se da el primer ataque nucleofílico, se
forma el primer intermedio tetraédrico. Al ser muy inestable este primer intermedio, este se rompe
y libera el primer producto y, un intermedio Acil. Este intermedio es atacado por una molécula de
agua y esto termina en ultima con un segundo producto. Al final este rompimiento resulta en dos
cadenas de PET con distintas terminales.

En el último paso de digestión, las dos cadenas clivadas son digeridas y convertidas en distintas
moléculas según los terminales que tengan. Una vez el enlace éster de la molécula con terminal
HE se rompe, este da lugar a la producción de MHET y HE-PET(n-1). Y ocurre un segundo clivaje
del enlace éster de esta última molécula. Igualmente, para la molécula con terminal TPA, esta es
atacada al enlace éster dando lugar a TPA y HE-PET (n-1), el cual también sufre en rompimiento
como el ya mencionado con anterioridad. La finalidad de este proceso es el de obtener la
acumulación de 4 moléculas MHET, TPA y EG (Joo et al., 2018; Magalhães et al., 2021). Los
productos de la hidrolisis de PET son transportados al espacio periplasmático a través de una
proteína de la membrana externa llamada porina (Taniguchi et al.,2019). Allí, la MHETasa, se
encuentra como lipoproteína anclada en la membrana externa e hidroliza a MHET en TPA y EG
(Yoshida et al., 2016; Taniguchi et al., 2019). TPA es llevada dentro del citoplasma por una
proteína transportadora y después, integrada al ciclo de Krebs mediante la vía del ácido
protocatéquico. Igualmente, para EG, este es metabolizado vía ciclo de Krebs (Pérez-Pantoja et
al., 2012; Wilkes & Aristilde, 2017; Taniguchi et al., 2019).
Gracias a los esfuerzos en la identificación de múltiples enzimas, se ha llegado a comprender mejor
los mecanismos de degradación enzimática de PET. Sin embargo, a pesar del gran avance que ha
habido en cuanto a la caracterización de enzimas hidrolasas, su actividad aun es muy baja para ser
aplicado en procesos de reciclaje bio catalítico a nivel industrial. Además, factores como la
cristalinidad del PET, la temperatura, el pH de la reacción y aditivos presentes en los plásticos,
afectan la degradación alterando la actividad de la enzima o inhibiendo el acceso al enlace éster
del PET (Maurya et al., 2020).
Tabla 1. Enzimas conocidas capaces de degradar PET.

Número de
Tipo de enzima Enzima Microorganismo Triada catalítica Oxyanion hole Temperatura pH Productos de degradación Ref.
puentes de disulfuro

LC-Cutinasa (LCC) Thermobifida fusca Ser165 - His242 - Asp210 Met166 - Tyr95 50°C 8.0 TPA, EG, MHET 1 Sulaiman et al. , 2012

TfHCut Thermomonospora fusca Ser170- His248- Asp216 Met171 - Tyr100 65°C 6.0-6.5 TPA 1 Kleeberg et al ., 1998

SvCut190 Saccharomonospora viridis AHK190 Ser176 - His254 - Asp222 Phe106 - Met177 60 - 65°C - TPA, BHET, MHET 1 Kawai et al., 2014

TfCut1 (DSM44342) Thermobifida fusca DSM44342 Ser130 - His208 - Asp176 Met131 - Tyr60 - - BHET 1 Muller et al., 2005

Tf Cut2 Thermobifida fusca KW3 Ser130 - His208 - Asp176 Met131 - Tyr60 55 – 65◦C - TPA, MHET 1 Muller et al., 2005

Cutinasa TcCut1 Thermobifida cellulosilytica Ser131- His209- Asp177 Tyr61 - Met132 - - TPA, MHET 1 Herrero- Acero et al. , 2011

TcCut2 Thermobifida cellulosilytica Ser131- His209- Asp177 Tyr61 - Met132 - - TPA, MHET 1 Herrero- Acero et al. , 2012

TaCut1 Thermobifida alba Ser169 - His247 - Asp215 Tyr99 - Met179 - - TPA - Kitadokoro et al., 2012

FoCut5a Fusarium oxysporum Ser121- His189-Asp176 Ser43-Gln123 40°C 8.0 TPA, MHET 1 Dimarogona et al. , 2015

HiCut Humicola insolens Ser105 - His173 - Asp160 Gln106-Ser28 80°C 8.5 TPA, BHET, MHET 1 Ronkvist et al., 2009

ScSub1 Streptomyces scabies Ser114 - His195 - Asp182 - - - TPA 2 Komeil et al. , 2013

PmCut Pseudomonas mendocina - - - - - - Kellis et al., 2005

FsCut Fusarium solani Ser120 - His188 - Asp175 Gln121-Ser42 50°C - TPA, BHET, MHET - Dimarogona et al., 2015

TcCut1278 y TcCut0390 Thermomonospora curvata Ser130 - His207 - Asp176 Met131 - Phe62 50°C 7.5 - 11.0 - - Oeser et al. , 2014

CaLipB Candida antarctica Ser105 - His224 - Asp187 Thr40 - Gln106 37 - 50 °C 7.0 TPA, BHET 3 De Castro et al., 2017

Lipasa BsEstB Bacillus subtilis Ser189 - His399 - Glu310 Ile12 - Met78 40°C 7.0 TPA, MHET Ribitsch et al., 2011

TlLip Thermomyces lanuginosus Ser146 - His 258 - Asp201 Ser83 - Leu147 45 °C 7.0 TPA, BHET, MHET 3 Brueckner et al., 2008

TaEst1 Thermobifida alba Ser169 - His247 - Asp215 Met170 - Tyr99 50°C - TPA - Ribitsch et al ., 2012

Esterasa EsEstB Enterobacter sp. HYI Ser110 - Asp158 - His190 - 40 °C 8.0 TPA, MHET - Qiu et al., 2020

ThEst Thermobifida halotolerans - - - - TPA, BA, HEB, MHET - Ribitsch et al ., 2012

Carboxil esterasa TfCa Thermobifida fusca Ser185 - His415 - Glu319 - 50 - 60 °C 6.0 BHET 1 Billing et al., 2010

Hidrolasa BhrPETase HR29 Ser165 - His242 - Asp210 - 70 °C 6.0 - 8.0 TPA, BHET, MHET 1 Xi et al., 2021

PETasas IsPETasa Ideonella sakaiensis Ser160 - His237 - Asp206 Tyr87 - Met161 30 °C 9.0 MHET 2 Yoshida et al., 2016

MHETasa IsMHETasa Ideonella sakaiensis Ser225 - His528 - Asp492 Gly132 - Glu226 45 °C 6.5 - 9.0 TPA, EG 5 Yoshida et al., 2016
El ejemplo más claro es la temperatura, ya que la mayoría de las enzimas muestran un bajo
desempeño a temperaturas moderadas restringiendo así la degradación de PET in situ. Y, por otro
lado, para que sea posible y favorable el rompimiento del polímero, la temperatura debe ser igual
o superar la Tg que es de 65 °C por lo que es importante que las enzimas sean termoestables
(Zimmermann, 2020).

PET

+ 𝐻2 𝑂

Triada catalítica

+ 𝐻2 𝑂

Figura 3. Mecanismo de degradación propuesto para I. sakaiensis. Fuente: Taniguchi et al., 2019
Métodos para mejorar la termoestabilidad de las enzimas

Aquí, la ingeniería de proteínas ha jugado un papel fundamental ya que el uso de las herramientas
bioinformáticas ha permitido el avance en el entendimiento sobre las enzimas y el mejoramiento
de su cinética (Maurya, et al., 2020). Actualmente se conocen estrategias de mutagénesis, edición
del genoma, sustituciones simultaneas de aminoácidos, genómica computacional y evolución
dirigida, entre otras (Samak et al., 2020).
Estudios han evaluado sustituir el sitio de unión para 𝐶𝑎2+ con un puente de sal (Then et al., 2016).
Estos puentes de sal ofrecen una mejor conformación y estructura a la enzima y además contribuye
al reconocimiento, degradación, catálisis y estabilidad de las proteínas (Ban et al., 2019). Mas
adelante también se evaluó agregar pares de cisteínas con el fin de formar puentes de disulfuro en
posiciones alternativas de la enzima (Nakamura et al., 2021; Wei et al., 2022). Es importante
mencionar que estos puentes de disulfuro son críticos en cuanto a la estructura y funcionalidad de
la enzima. También se ha reportado la expresión de forma recombinante de la PETasa en otras
cepas bacteriana como Escherichia coli, Bacillus subtilis y Pichia pastoris. El uso de estos
microorganismos permite su manipulación sencilla, rápida expresión de proteínas y menor costo
en su manejo y cultivo (Rosano & Ceccarelli, 2014; Shi et al., 2021). En pocas palabras, esto
permite mejorar la secreción de PETasa.
La mutagénesis dirigida (Wei et al., 2022) mediante la ingeniería de proteínas para mejorar la
termoestabilidad de las enzimas se ha evaluado también. Este proceso puede mejorar tanto la
termoestabilidad como la actividad catalítica. En donde, se generan mutaciones específicas
mediante la sustitución de residuos en la enzima (Samak et al., 2020). En este caso, al conocer la
estructura y función detallada de la enzima, se pueden realizar cambios deseados como mutaciones
en posiciones en las que el residuo de tipo salvaje no está favorecido y que permiten la ganancia
de una función. Un claro ejemplo es la ThermoPETase la cual tiene tres sustituciones de residuos
en su estructura y permitió el aumento de su Tm en 8.8 °C (Son et al., 2019; Wei et al., 2022).
Este procedimiento se puede realizar mediante el método PCR (Hongyuan et al., 2022).
Para identificar residuos de aminoácidos para mutagénesis y así mejorar la actividad catalítica
también es posible hacer uso de molecular docking y enzyme contact-surface analysis para
investigar el modo de unión de un sustrato modelo (Jutapat et al., 2022).
Tambien existen modelos informáticos que permiten identificar las posiciones en los que los
residuos de aminoácidos del wildtype no son óptimas y mediante predicciones probabilísticas,
entrega sustituciones potenciales que pueden mejorar el desempeño de degradación de PET. Lu et
al. en su estudio en 2022, hizo uso del algoritmo MutCompute, el cual, aprende de microambientes
químicos locales en la base de datos Protein Data Bank (PDB) de más de 19000 estructuras de
proteínas con el fin de identificar mutaciones efectivas diseñadas computacionalmente. Pudieron
demostrar que podían depolimerizar una botella de plástico a 50°C. En otro estudio, se sometieron
variantes de la PETasa a presión de selección al aplicar temperaturas elevadas. En este caso, se
obtuvo una variante HotPETasa con una Tm de 82.5 °C la cual presenta una mayor actividad para
hidrolizar PET semicristalino que otras enzimas descritas previamente.Es importante mencionar
que el proceso para mejorar la capacidad de las enzimas para la degradación de PET se basa es
principalmente en mejorar su actividad catalítica mas no únicamente su termoestabilidad.

Mediante el uso de enzimas hidrolasas se ha propuesto un modelo sostenible y viable para el

manejo de PET como lo es la economía circular. En donde se busca que el PET se mantienga en
circulación por más tiempo y, además, sea bioreciclado (Wei and Zimmermann, 2017; Tournier et
al., 2020; Zimmerman, 2020).
El reciclaje es una manera efectiva de manejar los residuos de plástico. Se ha demostrado la
factibilidad de tener un biorreactor enzimático compuesto de hidrolasas de PET y carboxil
esterasas las cuales, en conjunto, pueden llegar a hidrolizar de manera eficiente la parte amorfa del
PET en sus monómeros TPA y EG (Zimmermann, 2020). Estos pueden ser fácilmente recuperados
por precipitación y destilación para que así puedan ser usados en la síntesis de nuevo PET
(Zimmermann, 2020) o manufactura de otros tipos de materiales. El problema de este proceso es
que requiere altos niveles de energía, por lo que no es tan viable.
Gracias a los avances en microbiología sintética, el desarrollo del bio reciclaje de PET se vuelve
aún más atractivo. La idea del upcycling es que, mediante los monómeros de PET, se logren
manufacturar productos químicos y materiales con un valor agregado (Kenny et al., 2008; Rorrer
et al., 2019; Blank et al., 2020; Sohn et al., 2020; Dissanayake and Jayakody, 2021). El upcycling
ya ha sido demostrado usando métodos químicos como hidrogenólisis (Vollmer et al., 2020;
Westhues, Idel, y pirolisis (Vollmer et al., 2020) pero estos siguen significando un gran costo
energético y también tienen desventajas ambientales.
En cambio, lo que se propone para el bio-upcycling es en pocas palabras, un proceso en el cual se
iniciaría con la biodegradación del PET en sus monómeros gracias a enzimas hidrolasas, seguido
de la metabolización por parte de microorganismos de estos monómeros que luego secretarán
moléculas valiosas (Tiso et al., 2020). Y así, permita la creación de una economía material circular
para el PET (Sohn et al., 2020; Tiso et al., 2020). En este momento, la atención se centra en el
reciclaje de PET en material biodegradable, específicamente en biopolímeros parecidos al plástico
como oportunidad para mejorar la eficiencia del recurso y extender su vida y uso, y así, contribuir
a la economía circular (Wierckx et al., 2015; Narancic et al., 2021).
Con el aislamiento de I. sakaiensis, la degradación biológica completa del PET en sus monómeros
es un hecho y permite pensar en utilizar estos monómeros como feedstock para otros
microorganismos y que estos produzcan productos químicos. Recientes estudios han demostrado
que, mediante ingeniería genética, se puede desarrollar cepas metabólicamente modificadas
capaces de metabolizar TPA y EG, y posteriormente, capaces de producir otros elementos. Un
claro ejemplo es usar TPA y EG como feedstock para la producción de polihidroxialcanoatos
(PHAs) y en bio poliuretano por Pseudomonas umsongensis GO16 (Tiso et al., 2021), la cual, es
una cepa modificada. Mediante el enfoque innovador de la evolución adaptativa en laboratorio
(ALE), la cual es una estrategia exitosa en la cual se busca generar cepas con mutaciones efectivas
y deseadas para adaptarlas a condiciones deseadas. En este caso se buscaba que Pseudomonas
umsongensis GO16 aumentara el espectro metabólico y que pudiese metabolizar eficientemente
EG.
En este orden de ideas, el PET es hidrolizado completamente en sus monómeros mediante enzimas
hidrolíticas y, después, convertidas por P. umsongensis GO16 en PHA e hidroxialcanoiloxi-
alcanoato (HAA). PHA al ser un polímero intracelular, requiere de algunos métodos para su
extracción y su procesamiento posterior. Estos son la extracción con solvente, método de flotación,
digestión, extracción de fluidos supercríticos, entre otros (Raza et al., 2018). HAA es purificado y
químicamente co polimerizado para así formar poli(amida uretano) (bio-PU) (Tiso et al., 2021).
PHA es un material biodegradable, este es un poliéster alifático de alto peso molecular producido
a partir de feedstocks renovables (Fuessl et al.,2012). Los PHA son sintetizados vía fermentación
de un sustrato de carbono dentro de un microorganismo como mecanismo de almacenamiento de
carbono y energía. Los PHAs tienen diversas propiedades interesantes como material ya que es
biodegradable y tiene una excelente biocompatibilidad (Amstutz et al., 2019). Dado lo anterior,
este material cuenta con un amplio rango de aplicaciones en el área de empaquetamiento (Rehm,
2010). De hecho, este material representa el 1.2% del bioplástico total que existía globalmente en
el 2019 (Bioplastics, 2019; Tiso et al., 2021).

La bioconversión de TPA en cinco distintos compuestos aromáticos usando Escherchia coli

modificada y diseñada para expresar enzimas metabólicas para rutas biosintéticas para usar TPA
ha sido estudiada (Kim et al., 2019). Aquí, el TPA es convertido en ácido gálico, pirogalol, catecol,
entre otros, por vía del ácido protocatéquico (PCA) (Kim et al., 2019) mediante reacciones simples
o combinadas de hidroxilación, descarboxilación, clivaje del anillo oxidativo y metilación
(Dissanayake & Jayakody, 2021). El PCA también puede ser usado para sintetizar ácido adípico,
el cual es un importante precursor de nailon 6, 6 (Johnson et al., 2016; Salvador et al., 2019).

El desarrollo de microorganismos más eficientes metabólicamente hablando mediante ingeniería,

ha sido un enorme avance para los microbiólogos sintéticos y metabólicos. Por lo que se hace
realmente importante identificar las principales rutas metabólicas y catabólicas de TPA y EG, ya
que son clave a la hora de optimizar el proceso y desarrollo del upcycling.

Conclusión

La acumulación de petro plásticos en el ambiente y sus efectos negativos son una realidad. A pesar
de los varios mecanismos de manejo y reciclaje que hay en la actualidad, ninguno es efectivo y la
acumulación de PET se mantiene en aumento. Gracias a la evolución de la bioingeniería y la
investigación científica, se ha dado a conocer métodos prometedores para hacer un correcto
manejo de estos desechos como lo son el uso de enzimas hidrolíticas. Estas prometen ser
estrategias más efectivas y seguras, sin embargo, debido a su baja actividad y estabilidad térmica,
aun no pueden ser llevadas a un nivel industrial. A pesar de los grandes avances en cuanto
ingeniería metabólica y de proteínas, aún queda un largo camino para caracterizarlas
completamente, entender sus rutas metabólicas y optimizar su actividad modificándolas. El
upcycling de PET sigue siendo una oportunidad con gran potencial y más aun pensando en una
economía circular, en donde la biotecnología permite darles un valor agregado a los desechos
mediante el aprovechamiento de la versatilidad metabólica de los microrganismos.
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