UNALM Dpto.

Química

Primer Examen de Prácticas de Enzimología 2020-II

Nombre………Stefany Elizabeth Crisostomo Quispe……………………………….

1. Un grupo de estudiantes de enzimología realizan un estudio de fostasa ácida en hígado.

Para ello se ha preparado un extracto crudo de hígado de oveja (M1) y otro de hígado de
pescado (M2). En ambos casos con 3g de tejido homogenizados en 12ml de buffer acetato.
Después de centrifugar el volumen obtenido en ambos casos fue de 8ml. Se ha preparado el
siguiente protocolo para medir la actividad enzimática de la fosfatasa ácida (No se
consideran las repeticiones de las muestras por que el CV fue 0):

BM M BM M
Oveja Oveja Pescado Pescado
Buffer 2.5 2.5 2.5 2.5
pNFF 0.2 0.2 0.2 0.2
5 minutos A 37⁰C
Extracto crudo 0.1 0.1
10 minutos A 37⁰C
NaOH 1M 1 1 1 1
Extracto crudo 0.1 0.1
A 410nm 0.112 0.712 0.110 0.410
Coeficiente de extinción molar = 18400

A) Determine la actividad enzimática de fosfatasa ácida en hígado de oveja y pescado, exprese

en U/g hígado.
En oveja:
Am = 0.712-0.112 _____Am= 0.6
A=a.b.c
0.6= (18400)(1).c
C=3.26x10-5M
 32.6 umoles_____1000ml
0.326=X_____ 10ml

 0.326umoles/min______0.1ml homo
26.08umoles/min=X_____ 8ml
 26.08umoles/min________3g hígado
8.693=X______1g
 La actividad enzimática de fosfatasa acida en hígado de oveja es de 8.693umoles/min/g
higado
En pescado:
Am = 0.410-0.110 _____Am= 0.3
A=a.b.c
0.3= (18400)(1).c
C=1.63x10-5M
 16.3 umoles_____1000ml
0.163=X_____ 10ml

 0.163umoles/min______0.1ml homo
13.04umoles/min=X_____ 8ml
 13.04umoles/min________3g hígado
4.347=X______1g
La actividad enzimática de fosfatasa acida en hígado de pescado es de 4.347umoles/min/g
hígado

B) Los estudiantes necesitan extraer la enzima del hígado y purificarla y para ello deben
escoger la muestra apropiada (hígado de oveja o de pescado), considerando que durante el
proceso de purificación se perderá cierta cantidad de enzima, ¿cuál de las muestras
escogería? Explique
 Se es más recomendable usar la muestra de hígado de oveja, ya que esta presenta una
mayor actividad enzimática que la de pescado. Si se pierde una cierta cantidad de
muestra esta no afectaría tan gravemente como si fuera la del pescado, pues en esta
última presenta menor actividad, dándonos a entender que en la muestra del pescado
hay menor concentración de enzima o no tiene las condiciones óptimas para su correcto
funcionamiento.

2. Un tesista realizó el siguiente ensayo de actividad del inhibidor de tripsina (AIT) en una
muestra de harina de camote. La extracción del inhibidor se realizó de la siguiente
manera: a 1g de harina de camote se agregó 50ml de NaOH 0.001M, se reguló el pH a 9.4
y se dejó en reposo por 16 horas. Luego se filtró y el filtrado se enrazó en una fiola a 100
ml. Con este extracto del inhibidor se prepararon varias diluciones (M1y M2). Para
preparar las muestras diluidas se tomó la cantidad indicada (0.5; 0.75) en una fiola de
 25ml que se enrazó a volumen con agua destilada. Los valores de A de las muestras son
obtenidos como promedio de 2 repeticiones cuyo CV fue menor de 3%.

BST ST RST BM1 M1 BM2 M2

Dilución 0.5/25 0.75/25

Bapna 2 2 2 2 2 2 2

Agua 1 1 1

Muestra 1 1 1 1
diluida

5 minutos a 37ºC

Tripsina 0.5 0.5 0.5 0.5

10 minutos a 37ºC

Acético 35% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Tripsina 0.5 0.5 0.5

A410nm 0.02 0.48 0.46 0.003 0.28 0.003 0.1935

a) Determine la actividad del inhibidor de tripsina por miligramo de harina.

En M1: 0.5 ml en una fiola de 25ml que se enrazó con agua destilada
En M2: 0.75 ml en una fiola de 25 ml que se enrazo con agua destilada.

Muestra1
Am1 =0.28-0.003 = 0.277
 Actividad de tripsina
 ST 1UT______0-01
45UT=X ______0.45
 M1: 1UT____0.01
27.7UT=X______0.277
Entonces:
45____100%
27.7_____x= 61.56%

 El grado de inhibición (GI) seria 100-27.7= 72.3%

 Hallando la actividad del inhibor de tripsina en (UTI)
UTI= 45-27.7= 17.3UTI
 Expresando en UTI/1mg de harina
 1g ----- 100ml
x ------ 0.5ml
x = 0.005 g⇒5mg
5mg ----- 25ml (fiola donde se diluyo)
w ------ 1ml
w = 0.2mg
Entonces:
17.3 UTI ------ 0.2mg
Z ------ 1mg
Z =86.5 UTI/mg harina

Muestra2
Am2 =0.1935-0.003 = 0.1905
 Actividad de tripsina
 ST 1UT______0.01
45UT=X ______0.45
 M2: 1UT____0.01
19.05UT=X______0.1905
Entonces:
45____100%
19.05_____x= 42.33%

 El grado de inhibición (GI) seria 100-42.33= 57.67%

 Hallando la actividad del inhibor de tripsina en (UTI)
UTI= 45-19.05= 25.95UTI
 Expresando en UTI/1mg de harina
1g ----- 100ml
x ------ 0.75ml
x = 0.0075 g⇒7.5mg
7.5mg ----- 25ml (fiola donde se diluyo)
w ------ 1ml
w = 0.3mg
Entonces:
25.95 UTI ------ 0.3mg
Z ------ 1mg
Z =86.5 UTI/mg harina

b) Llene el siguiente cuadro y analice o explique los resultados obtenidos

M1 M2
Dilución 0.5 0.75
GI % 72.3 57.67
UTI/mg harina 86.5 86.5
 - En la muestra 1, se pude observar que el grado de inhibición esta fuera del rango de 30-
70%, nos da a entender que los resultados no son confiables y se tendría que volver a
realizar la muestra.
- En la muestra 2, se puede observar que el grado de inhibición se encunetra dentro del
rango de 30-70%, esto indicaría que la dilución que se realizó a 0.75 ml en una fiola de
25ml es correcta.
- Las cantidades de enzima inhibida resultaron iguales debido a que presentaban un cv
muy bajo
c) El tesista sospecha que si realiza un ensayo con una dilución mayor a 0.75/25 (como
1.5/25), probablemente podría encontrar un resultado (UTI/mg de harina) menor al
obtenido en cualquiera de las diluciones realizadas. ¿Podría usted explicar en que se basa el
tesista para tal suposición?
- El tesista se basa en que cuando hizo una mayor dilución tuvo mejores valores que
cuando la realizó con valores bajos, el pensaría que si aumentando la dilución se
obtendría un menor grado de inhibición de la tripsina; sin embargo, la cantidad de
UTI/mg de harina va ha ser el mismo por su CV muy bajo.