ESTUDIOS BIOFISICOS EN MACROMOLECULAS

I.-DICROÍSMO CIRCULAR

CD es una técnica espectroscópica de absorción que provee información acerca de la

estructura de macromoléculas biológicas.
La señal medida en CD es la diferencia entre las Abs (A) de la luz polarizada circularmente hacia
la izquierda (l) y hacia la derecha (r):

CD = A(r) - A(l)

Se utiliza como fuente luz polarizada (UV-VIS) y las muestras a analizar, además de
absorber, deben ser óptica// activas: deben ser quirales, es decir, no disponer de un plano de
simetría y no ser superponibles con su imagen especular.
La teoría de dicroísmo circular fue desarrollada por Biot y Fresnel: un rayo de luz polarizado
en un plano puede considerarse formado por dos componentes polarizados circularmente, uno a la
derecha y el otro a la izquierda. Estos componentes están en fase y son de la misma amplitud. Al
pasar por un medio ópticamente activo (es decir que rota el plano de la luz polarizada), cada
componente interactúa de manera diferente con los centros quirales de las moléculas presentes en el
medio. Esta interacción induce un desfasamiento y un cambio de magnitud en ambos componentes
polarizados circularmente, lo que provoca una rotación del plano de polarización en un ángulo alfa
La desviación en el plano de la luz polarizada se debe al cambio en el índice de refracción entre la
luz polarizada circular a la izquierda y a la derecha. La distorsión de este plano genera una elipse:

A B
(A) Los vectores de los componentes del haz antes de llegar a la muestra. (B) Esos mismos
vectores después de interactuar con los solutos de la muestra, fuera de fase. La onda
resultante: polarización elíptica, debido a la diferencia en absorción que presenta la molécula
para cada tipo de polarización circular.

La rotación del plano y la diferente absorción de los componentes circularmente polarizados

varían de acuerdo con la longitud de onda, pudiéndose obtener espectros de estos fenómenos, esto
es, gráficas de la rotación o elipticidad versus la longitud de onda.
 Las medidas de CD se realizan determinando la diferencia de absorbancias entre la luz
polarizada circularmente hacia la izquierda A(l) y hacia la derecha A(r). Teniendo en cuenta la ley
de Lambert-Beer, que define el proceso de transición electrónica en la espectroscopia UV-VIS, se
puede expresar esta diferencia de absorbancias como:

∆A(λ) = AL(λ) -AR(l) = [εL(λ) -εR(λ)].l.c= ∆ε.l.c

donde c es la concentración molar del soluto quiral, ε es el coeficiente de extinción molar y l el paso
de luz. Cuando la luz polarizada atraviesa un medio quiral, los vectores eléctricos describen una
elipse cuyo eje mayor se encuentra en un nuevo ángulo de rotación. Cuando los vectores eléctricos
de las dos componentes circulares se encuentran en la misma dirección, la suma de sus magnitudes
proporciona el eje semimayor de la elipse, y cuando están en direcciones opuestas, la diferencia de
sus magnitudes proporciona el eje semimenor de la elipse. El CD se define mediante la relación
entre el eje semimayor y semimenor. Esta relación es la tangente del ángulo θ, conocido como
elipticidad.
Este ángulo θ generalmente es muy pequeño, por lo que puede aproximarse tan θ ≈ θ y se
relaciona con la absorbancia mediante la siguiente expresión:
θ = 32,98. ∆A
o expresado como elipticidad molar:
[θ] = 3298.∆ε

θ a
b tg θ = a/b θ = arctg (a/b)
a es eje menor, b el mayor θ vs. λ espectro de CD

Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta
cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética. En la región del
ultravioleta cercano, los cromóforos más importantes son los grupos aromáticos de las cadenas
laterales de triptófano, tirosina, y fenilalanina. Ya que la asimetría en estos grupos químicos se debe
exclusivamente a su entorno y como los residuos aromáticos se encuentran distribuidos en toda la
macromolécula, los espectros en esta región son un reflejo de la conformación global de la proteína.
Además las señales en esta región son extremadamente sensibles a los cambios en la conformación.
Los espectros de dicroísmo en la región del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los
enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí. La asimetría de estos cromóforos
se debe al arreglo espacial de la cadena principal de la proteína, por lo cual, las señales de dicroísmo
circular se pueden interpretar en términos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir,
del porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformación estructural (hélices , hojas
, giros y otros tipos estructurales).

Transiciones electrónicas:
 Las bandas observadas en los espectros de absorción y de CD de macromoléculas en solución
corresponden principalmente a las transiciones electrónicas entre los niveles vibracionales más bajos
y diversos niveles vibracionales en el primer estado excitado.
Una transición electrónica se produce porque el campo eléctrico de la radiación, el magnético o
ambos inducen a los electrones a un nuevo estado de energía. El efecto del campo eléctrico es un
rearreglo lineal de los electrones llamado “momento dipolar eléctrico de la transición” y se denota
por el vector µ. La dirección de µ es la misma que la del dipolo de polarización, esto es la dirección
en la cual los electrones son empujados. El campo magnético induce un rearreglo circular de la
densidad electrónica llamado “momento dipolar magnético de transición, m”
En una molécula aquiral la redistribución neta de electrones se da siempre en el plano,
pudiendo ser lineal (µ≠0; m=0) o circular (µ=0; m≠0), pero también puede darse que ambos
momentos sean diferentes de 0 y en este caso el rearreglo es en una espiral. En una molécula quiral,
el rearreglo de electrones durante una transición es siempre helicoidal.
Si la hélice formada por el movimiento de electrones es hacia la derecha (dextrógira), es más
fácilmente inducida por luz polarizada hacia la izquierda, y se observa una señal positiva de CD;
mientras que si es hacia la izquierda, se induce más fácilmente por luz polarizada hacia la derecha, y
la señal es negativa. Esto es debido a que el vector del campo eléctrico de la luz interactúa con µ, y
simultáneamente el vector del campo magnético de la luz interactúa con m.

Estos dos sistemas aromáticos tienen 6 anillos fusionados, en el primero son coplanares entre
si y en el segundo, uno de los anillos esta en otro plano (el anillo 1 no está unido al 6). Si se mira
desde arriba, el primero seria como una dona, y el segundo como un fracción de hélice. En la
molécula aquiral (la primera) hay una distribución plana de los electrones, confinada en dos planos,
uno por arriba de la molécula y otro por debajo, mientras que en la quiral (la segunda), la
distribución de los electrones es helicoidal. Entonces, tenemos que para el primer caso, el momento
dipolar eléctrico es cero (se anulan) y el momento dipolar magnético resultante es un vector hacia
arriba (por la regla de la mano derecha). En el segundo caso, tanto el momento dipolar eléctrico
como el magnético son diferentes de cero. Ambos vectores están dirigidos hacia arriba. El producto
escalar de µ.m es también distinto a cero lo que implica que ambos vectores no son perpendiculares.
Para que una transición sea permitida en CD (para que una sustancia absorba en CD) debe
inducirse una circulación helicoidal de corriente, es decir, que el producto escalar entre los
momentos dipolares sea distinto de cero. Esto es lo que se conoce como las reglas de selección de
CD.

Análisis de la estructura proteica usando CD:

CD es una de las técnicas mas sensibles para determinar las estructuras 2rias y monitorear
cambios en dicha estructura. Es el puente de unión entre la secuenciación (estruc 1ria) y las técnicas
cristalográficas o RMN (estruc 3ria)
El cromóforo en el UV lejano (180 a 250nm) es el enlace peptídico; y en el UV cercano (250
a 350nm) son los residuos aromáticos, Tyr, Trp y Phe, y el pte S-S de Cys. El CD en el UV lejano
permite obtener medidas empíricas de la estructura de la proteína y su conformación. Se pueden
diferenciar αhélices, hojas β giros β y random coil. En el CD en el UV-cercano se debe constatar que
la proteína tenga un espectro. La intensidad en el cercano es mucho menor que en el lejano por lo
que se requiere mayor cc de proteína. Esto es debido a que en una proteína hay menos residuos
aromáticos que enlaces peptídicos. Este tipo de CD depende del plegamiento de la proteína
(estructura 3ria) y es como una huella dactilar de la misma en condiciones nativas (plegada). Esto
implica que este método es útil para saber si la proteína está correctamente plegada. También se
puede seguir el cambio conformacional provocado por algún ligando que se una a un residuo
aromático.

UV Lejano UV Cercano

En amarillo se observa el espectro en el UV Lejano de la proteína plegada y en verde el de la

misma proteína pero desplegada o desnaturalizada. Esta última casi no tiene señal de CD debido a
que como la proteína pierde su estructura secundaria, pierde su quiralidad. En el UV-Cercano se
verifica que la proteína tenga un espectro, es un control cualitativo que sirve para chequear la
integridad de la proteína.
En una proteína plegada o péptido el enlace amida no se encuentra aislado sino en un arreglo
continuo y debido a las interacciones entre los grupos amida de las proteínas es que cambia la
estructura electrónica y las propiedades espectrales. El desdoblamiento excitónico es entre los
planos definidos por los enlaces peptídicos, que actúan como dímeros muy similares aunque los aa
tienen distintos grupos R. Los desdoblamientos que surjan van a depender de la orientación de uno
de los planos con respecto al siguiente. Si se cumplen los dos requisitos para que haya dicroísmo
cuando tenemos un dimero, que ambos cromóforos estén lo suficientemente cerca y que sean muy
parecidos, entonces podremos ver el espectro de CD. De acuerdo al tipo de estructura secundaria de
la que se trate, se van a tener patrones de acoplamiento, distancias y orientaciones características.
La Poly-L-Lisina se utilizó como modelo debido a que en solución acuosa y a distintos pH adquiere
diferentes estructuras secundarias.

Gráficos de CD de las estructuras secundarias

UV-Lejano

Hay dos transiciones en el UV lejano tanto para las proteínas plegadas como para las desordenadas.
Una es la transición π π* que se presenta como un pico positivo a 212 nm, y la otra es negativa a
195nm y corresponde a la n π*.

α-hélices:
En la estructura de hélice α la secuencia aminoacídica gira alrededor de un eje y las cadenas
laterales quedan en la superficie de la hélice. Cada giro tiene una unidad repetitiva de 3.6
aminoácidos. La hélice se encuentra estabilizada por enlaces de hidrógeno de los grupos amida,
entre el hidrógeno unido al nitrógeno (electropositivo) del residuo (i) y el átomo de oxígeno
(electronegativo) del residuo (i+4).
Las hélices son anfipáticas; tienen una zona polar en la superficie y una zona hidrofóbica en la cara
interna.
 Los espectros muestran un doble mínimo a 222nm y 208nm, y un máximo intenso a 191nm.
El máximo presenta una intensidad alta debido a la asimetría intrínseca de hélice.
Las intensidades de las 3 bandas reflejan el grado de abundancia de la estructura helicoidal
en la proteína.
La transición π π* se desdobla en 2 transiciones debido al acoplamiento excitónico:
π π* ┴ máximo positivo a 191nm. Es la de mayor energía.
π π*⁄⁄ mínimo negativo a 208-210nm
Además, el acoplamiento excitónico de esta transición, baja la energía de la transición n π*
produciendo un corrimiento hacia el rojo. Así, la transición n π* se presenta como un mínimo
negativo a 222nm

Lámina β:

La cadena polipeptídica está prácticamente extendida en forma de lámina. La distancia axial

entre los aminoácidos es de 3.5 Å y está estabilizada por puentes de hidrógeno entre grupos NH y
CO de las diferentes cadenas polipeptídicas. Las cadenas adyacentes en la hoja β pueden estar
dirigidas en la misma dirección (hojas β paralelas) o en direcciones opuestas (hojas β antiparalelas).
 Las proteínas con estructura 2ria
mayoritariamente β presentan un máximo simple
y un mínimo simple, pero sus espectros son muy
variables porque las hojas pueden ser paralelas o
antiparalelas y por la variación en el largo y
ancho.
π π* banda positiva entre 190 y 200nm
n π* banda negativa entre 210 y 225nm

α + β:

En las proteínas que son mezcla de 2 dominios: α y β separados, generalmente predomina la

forma del espectro de la α hélice, ya que esta es intrínsecamente asimétrica. Sin embargo, la
intensidad del máximo es mucho menor que en el espectro de la hélice sola.
α + β significa que la proteína tiene ambos dominios, pero bien diferenciados en el espacio:
primero un dominio α y luego uno β, o al revés. n π* banda negativa a 222nm (mínimo) π π*
banda negativa a 208-210nm (mínimo)
π π* banda positiva a 190-195nm (máximo)

La banda a 208-210nm tiene mayor intensidad que la de 222nm θ210 > θ222
α / β:

α/β significa que la proteína tiene una mezcla de los dos dominios.
El espectro es similar al anterior. La diferencia es que la banda a 222nm generalmente tiene
mayor intensidad que la banda a 208-210nm. θ210 < θ222
Random Coil:
 Para las proteínas sin estructura ordenada (oligopéptidos, polipéptidos cortos con puentes
disulfuro o grupos prostéticos y proteínas desnaturalizadas) se observa un mínimo intenso a 200nm y
puede haber algunos máximos o mínimos débiles por encima de 210nm debido a las partes de la
proteína plegadas al azar.

Giros β:

Los giros β se producen cuando la cadena peptídica cambia bruscamente y, generalmente se

encuentran en zonas superficiales de las proteínas. En el giro β están involucrados cuatro residuos
que están formando un ángulo de 180 grados.

Los giros β tienen un espectro bien definido, sin embargo son difíciles de observar en el
espectro global.
El espectro de los giros β tipo I se parece al de las hélices α en la región del UV 210 a 220
nm, pero la banda positiva a 190 es más débil. Los giros β tipo II originan un espectro similar al de
la hoja β, pero corrido al rojo entre 5 y 10nm. En ciertas circunstancias los giros tipo I pueden dar un
espectro similar al del tipo II.
Las transiciones características de un giro β son las n π* que muestran una banda negativa débil a
220-230nm y la π π* que muestra una banda positiva a 220-210nm y una negativa a 180-190nm.
 El espectro en el UV-lejano se puede suponer como la suma de los espectros componentes de
la estructura 2ria: θt = xα θα + xβ θβ + xc θc
Siendo θt la elipticidad experimental corregida, x un factor que se calcula a partir de la estructura
terciaria de la proteína obtenida por cristalografía de rayos X, y θ son los espectros de cada tipo de
estructura, hélices α, laminas β y random coil. El segundo término presenta un error intrínseco ya
que la estructura β se puede perder debido a la gran variabilidad en los espectros de las hojas beta y
el tercer término presenta un error entre el 5 y 10%, debido a que se pierden los giros β.
Cuando se tienen una proteína en estudio no conocida, con CD solo puedo saber el
porcentaje de estructura secundaria que presenta. Por medio de algoritmos se ajustan los espectros
de proteínas conocidos al nuestro y se obtiene el % de cada estructura 2ria componente de la
proteína, y una supuesta estructura 3ria que luego se debe corroborar por medio de otras técnicas.
Por otro lado, comparando con otras proteínas de estructura conocida se puede predecir la ubicación
de esas estructuras secundarias.

Para poder estimar la estructura secundaria hay que tener en cuanta las siguientes
suposiciones:
Las estructuras tridimensionales obtenidas por métodos como cristalografía de rayos X se
retienen en solución acuosa (ya que x se calcula con la estructura cristalográfica, y además porque
las estructuras de referencia se obtienen por este método). (valido)
La combinación de los distintos elementos estructurales 2rios individuales se suman para dar el
espectro de CD, y la estructura 3ria no influye. (no valido)
Al espectro de CD en el UV-lejano solo contribuye el cromóforo peptídico y no los AA
aromáticos y demás cromóforos no peptídicos. (no valido)
Cada elemento estructural (α-hélice, hoja β, etc) se describe como un simple espectro de CD, y
el efecto de variabilidad geométrica se asume como despreciable.

Aplicaciones y usos de CD:

Determinación de la estructura 2ria de proteínas que no pueden ser cristalizadas.
Estudio de ligando
Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T, solventes, etc.
Determinación de estructuras 2rias de proteínas de membranas (difíciles de cristalizar) y dentro
de vesículas lipídicas (in vivo)
Estudio de interacciones proteína-proteína y ácidos nucleico-proteína
Estudios de aspectos estructurales de: ácidos nucleicos, polisacáridos, péptidos, hormonas y
otras moléculas pequeñas.

Ventajas:
Experimento simple, rápido y no destructivo.
Requiere menores cc q las precisadas para RMN.
 Escala de t menor que RMN. Puede servir para el estudio de una interacción ligando-MM, en
donde el L tiene un muy corto t de residencia
Se usa para cualquier tamaño de molécula.
Es el complemento de técnicas más detalladas y precisas (Cristalografía y RMN)

Limitaciones:
La deconvolución de un espectro en 4 o 5 componentes que no varían de proteína a proteína
puede ser una sobre simplificación.
Los espectros de referencia de prot 100 % α-hélices no se pueden comparar con espectros de
prot que solo tengan una fracción de α-hélices (la intensidad aumenta con la longitud de la hélice)
Las bandas del UV-cercano puede contribuir al espectro en el UV-lejano.
Las formas de las curvas en el UV-cercano dependen de la estructura 2ria y 3ria.

Fuentes de error:
Desviaciones y distorsiones en los espectros de estructuras típicas, sobre todo en las laminas β q
tienen espectros muy variables
La absorción de los aromáticos y ptes disulfuro.
Error al suponer que no hay interacción entre las estructuras 2rias (regla de aditividad)
Absorción del solvente: Hay que trabajar con buffers muy diluidos y que no absorban a
menos de 200nm

Consejos para obtener buena información a partir del espectro de CD:

Primero es necesario correr un espectro de absorbancia normal para verificar que los valores de
absorbancia mantengan linealidad según la Ley de Beer y ver el rango de λ.
Toda la luz que llegue a la celda debe pasar a través de la muestra, no debe reflejarse en las
paredes o base de la celda.
Generalmente se usan cubetas cilíndricas ya que estas tienen menos birrefringencia (línea base
de CD) y además usan menor cantidad de muestra. Sin embargo, las celdas rectangulares son más
económicas y pueden usarse para espectroscopia de absorbancia por lo que el CD y el espectro
estándar se pueden hacer a partir de la misma muestra. Además en estas últimas se pueden hacer
titulaciones seriadas ya que en un principio puede llenarse un 60% de la cubeta y luego ir
agregando gradualmente.
Se debe tomar el espectro de la línea base con el solvente o buffer y luego sustraerlo al de la
muestra para poder obtener el gráfico final.
El espectro de CD generalmente escanea de λ de mayor a menor, por lo que se debe seleccionar
un rango de λ que comience al menos 20nm más allá que el que abarca la absorbancia normal.
La concentración de la muestra debe ser tal que los valores de absorbancia estén entre 0,2 y 1,5.
Cuando es mayor a 2 la señal de CD no es confiable. El valor óptimo de absorbancia es 1,1. Para
valores mayores, se debe verificar que la señal de CD sea proporcional a la cc de la muestra
corriendo un espectro con una muestra diluida.
Evitar buffer que absorban. Tengo que usar buffers que sean transparentes (fosfatos, boratos,
Tris) Trabajar con bajas cc de fuerza iónica.
 Evitar turbidez. Muchas veces lo que se hace es filtrar la muestra con filtros de 50 micras antes
de ponerla en la cubeta para medir CD.

Comparación de CD con UV-VIS:

El dicroísmo circular y la espectroscopia UV-vis son técnicas de espectroscopia de absorción

electrónica basadas en el mismo proceso, el cambio de configuración electrónica molecular del
estado fundamental a un estado excitado debido a la absorción de radiación electromagnética. En el
caso del UVvis se utiliza como fuente luz no polarizada, mientras que en los procesos dicroicos la
luz está polarizada.
En la forma de espectroscopia más simple, la absorción, se mide cuanta luz de una dada
frecuencia es absorbida por una colección de moléculas. Para que una sustancia absorba es necesario
que cambie el momento dipolar de la transición.
El dicroísmo circular mide la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente hacia
la derecha y hacia la izquierda. Como en CD se realiza una resta, se pueden obtener picos positivos
y picos negativos, lo que permite ganar resolución. Así el CD tiene poca intensidad pero alta
resolución.
Cuando se produce la interacción entre 2 monómeros, se tiene un desdoblamiento excitónico
de distinta energía. En UV-vis se obtienen 2 picos simétricos respecto de donde estaría la transición
(E0) del monómero, sin embargo que se pueda ver o no depende de la orientación de los dipolos.
Así, si D+ o D- es = 0, o si la intensidad de uno de los picos es mayor que la del otro, entonces un
pico no se verá, y parecerá que solo ha ocurrido un corrimiento al azul o al rojo dependiendo del
caso. En CD, esto no ocurre. Si bien el V12 es el mismo que en UV-vis, ya que la muestra tiene las
mismas transiciones, lo que cambian son las reglas de selección:
Una componente es positiva y la otra negativa.
La intensidad de cada uno ya no depende del dipolo de transición, sino de una fuerza rotacional
R+ y
R-
La intensidad de R+ es la misma que la de R-.
En CD aparecen siempre las 2 componentes.
II.-CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (HPLC)

La cromatografía líquida o high performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de

cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica . También se la denomina a
veces cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta resolución (high
pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en
desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta
presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la
fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes
de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de
la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de
retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías
incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión
dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados
son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos
como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.
Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la composición de la fase
móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una
cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal
hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del
compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del
compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo,
utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor
concentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones
elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de
optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos.
Tipos de HPLC
Cromatografía de fase normal
La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema
HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos sobre la base
de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza
cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la
fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto
y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase
móvil) aumenta el tiempo de retención.
La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino
también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden
diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el
tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a
aumentar el tiempo de retención.
La NP-HPLC cayó en desuso a los años 1970 con el desarrollo del HPLC de fase reversa
o reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retención puesto
que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la silica o alúmina de la
cromatografía.
Cromatografía de fase inversa (o reversa)
La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de
polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la
silica tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17
. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las
moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.
El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la
introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que
a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase
reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de
repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase
estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la
disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico
está dominado por el aumento de la entropía, y la consecuente disminución de la energía libre,
asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico
disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de
partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. En
general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor
porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver
reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de
retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al
tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros
lineales puesto que la superficie total se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar
la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal
en la tensión superficial, y como la entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada
precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.
Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por
este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el
valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto
de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que
neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar,
pero en general mejoran la separación cromatográfica.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica
normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con
cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían
dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso
pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes
metálicas del aparato de HPLC.
Cromatografía de exclusión molecular
La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía por filtración en
gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una
cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de
purificación. También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura
cuaternaria de las proteínas purificadas.
La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las
moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más precisamente, según su radio de
Stokes.
En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman
una red tridimensional porosa. A los fines prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas
partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia, estas partículas
son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no
podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar
libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de
caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.

Cromatografía de intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre

los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga
son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de
intercambiadores iónicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y
dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los
intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño. Un incremento
en la concentración del contraión (respecto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de
retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de
intercambio catiónico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las
cromatografías de intercambio aniónico. Este tipo de cromatografía es ampliamente utilizado en las
siguientes aplicaciones: purificación de agua, concentración de componentes traza, Ligand-
exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange
chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.
Cromatografía basada en bioafinidad
Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de
formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos involucra la
participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones
electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre
las partículas de la muestra y la fase estacionaria.
Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHPLC)
Se trata de un método que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi totalmente en desuso
debido al auge de la secuenciación), que permite detectar la presencia de variaciones en el ADN
aunque no se determinan específicamente cuáles. En este caso, se utiliza la técnica cromatográfica
para la detección de heterodúplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de
ácidos nucleicos.
El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura normalmente) una muestra
que contenga tanto el ADN problema como un ADN control, que no es más que el mismo ADN
problema pero en su versión silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a renaturalizar
(disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas cadenas de ADN que vuelvan a unirse con
sus respectivas complementarias (cadena "a" silvestre con cadena "b" silvestre; o bien cadena "a"
mutante con cadena "b" mutante) no presentarán diferencia con el estado original; sin embargo, si
por ejemplo una cadena "a" silvestre híbrida con una cadena "b" mutante, aquella región (más o
menos amplia) en la que exista mutación no complementará, formándose un bucle u horquilla, es
decir, una región en la que las bases nitrogenadas no son complementarias y no establecen las
uniones características por puentes de hidrógeno en la doble hélice de ADN. Dichas estructuras son
los denominados heterodúplex (dúplex de ADN híbridos). Estos heterodúplex migran de forma
diferente a los homodúplex en la columna de cromatografía de fase reversa(al igual que lo hacen en
un gel de agarosa o acrilamida). La separación se realiza en condiciones desnaturalizantes variables,
detectándose las moléculas de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm. Esto origina un pico de
elución a un tiempo característico. A medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes
los heterodúplex migran por delante de los homodúplex, apareciendo los picos correspondientes a
heterodúplex antes en el gráfico resultante, el cromatograma. De esta manera, como los
heterodúplex se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homodúplex, ambas moléculas dan
lugar a picos de elución distintos.
Previo al proceso inicial de desnaturalización se suele llevar a cabo una PCR para la amplificación
del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb.
Con este sistema pueden detectarse fácilmente sustituciones de una base, inserciones o deleciones,
con un coste reducido y de manera rápida (aproximadamente 16 minutos).1
Diámetro interno
El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de
muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de
diámetro interno más grande (>10mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos
para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se
utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y
la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar
columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen
otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas
principalmente en espectrometría de masas.
Medida de las partículas
La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de
partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5µm de
diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor
separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de
forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir
la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez,
aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.
Tamaño del poro
Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños
proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una
cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo, una proteína
que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá
con facilidad.
Presión del sistema
La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en
su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta
40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para
poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más pequeño
en las columnas (< 2 micrómetros). Estos nuevos aparatos, denominados ultra performance liquid
chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presión (unas 1000
atmósferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca registrada de Waters
Corporation aunque a veces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).

III.-DIFRACCION DE RAYOS X
 Los Rayos X se descubrieron en 1895 por el físico alemán Röntgen y recibieron ese nombre porque
se desconocía su naturaleza en ese momento. En 1912 se estableció de manera precisa la naturaleza
de los rayos X. En ese año se descubrió la difracción de rayos x en cristales y este descubrimiento
probó la naturaleza de los rayos X y proporcionó un nuevo método para investigar la estructura de la
materia de manera simultánea. Los R-X son radiación electromagnética de la misma naturaleza que
la luz pero de longitud de onda mucho más corta. La unidad de medida en la región de los r-x es el
angstrom (Å), igual a 10-10 m y los rayos x usados en difracción tienen longitudes de onda en el
rango 0.5-2.5 Å mientras que la longitud de onda de la luz visible está en el orden de 6000 Å. El
espectro contínuo. Los rayos X se producen cuando una partícula cargada eléctricamente con
suficiente energía cinética es frenada rápidamente. Los electrones son las partículas utilizadas
habitualmente y la radiación se obtiene en un dispositivo conocido como tubo de rayos x
Los rayos x emitidos consisten en una mezcla de diferentes longitudes de onda y la variación de
intensidad con λ depende del voltaje del tubo. La figura muestra el tipo de curvas obtenidas. La
intensidad es cero hasta cierta longitud de onda, llamada λlim, aumenta rápidamente hasta un
máximo y entonces decrece sin un límite abrupto en la parte de larga longitud de onda. Esta
radiación se denomina radiación continua o blanca, pues está formada igual que ocurre con la luz
blanca por muchas longitudes de onda.

En la actualidad, la difracción de rayos X tienen muchas aplicaciones en el estudio de la materia

sólida: Unas veces a partir de mezclas de polvo mono o policristalinas y otras a partir de cristales
con menos de un milímetro de diámetro, pueden realizarse estudios no destructivos de diversos
tipos:
 Análsis cualitativo.
 Análisis cuantitativo
 Análisis microtextural
 Tamaño de cristalito= mosaico= dominio coherente. Cristalinidad.
 Deformación no homogénea (strain)
 Tensores de dilatación térmica( termodifracción)
 Cambios de fase (reacciones en estado sólido, procesos secuenciales)
 Análisis estructural. Posiciones atómicas, oscilaciones atómicas de carácter térmico, desorden
posicional, etc.)
FUNDAMENTO TEÓRICO DE DIFRACCIÓN DE RAYOS-X
El fundamento de las técnicas de difracción se basa en la interacción de la estructura cristalina de un
sólido con una fuente de rayos X, esta estructura cristalina está presente en muchos sólidos tanto
naturales como artificiales y consiste en la repetición periódica de los átomos o moléculas que
forman este sólido en las tres direcciones del espacio

Sobre esta estructura tridimensional se pueden trazar infinitos planos paralelos donde cada uno de
los cuales pasará por una serie puntos. Si cogemos uno de estos planos, a una cierta distancia existirá
otro plano donde la distribución de puntos que corta será la misma, a la distancia entre estos dos
planos se llama distancia interplanar “d”, tendremos infinitos planos paralelos a distancias múltiplos
de “d”. Si por dos de estos planos de la estructura se hace incidir un haz de rayos X, se da el
siguiente fenómeno: Si el frente de ondas que se difracta por el primer plano lo hace con un ángulo
θ, el frente de ondas del segundo plano también se va difractar con un ángulo θ, con esta nueva
trayectoria que se describe si los dos frentes no están en fase ocurre una interferencia destructiva y
se anula uno al otro, pero si los dos salen en fase, hay una interferencia constructiva y el haz
difractado no se anula y es detectable, esto ocurre cuando la diferencia de recorrido entre los dos
frentes es un múltiplo de la longitud de onda λ y matemáticamente: 2d senθ = nλ (Ley de Bragg),
como cada familia de planos tiene una distancia d, vamos a detectar estos planos a diferentes
ángulos, y los resultados serán diferentes según la estructura de lo que estemos midiendo, por lo que
podemos caracterizar las fases que componen la muestra en base a los diferentes “picos” de
detección que son en realidad las reflexiones de los planos de cada fase, para una rápida
identificación se tienen tabulados los valores de las diferentes fases en fichas y se comparan con los
resultados obtenidos.
Diagrana de difracción de rayos x

IV.-CRIOMICROSCOPIA ELECTRONICA

Qué es la criomicroscopía?

La criomicroscopía permite estudiar muestras biológicas sin alterar sus propiedades, puesto que
evita los colorantes o los haces de electrones desprendidos por los rayos X.

La microscopia electrónica convencional deshidrata las muestras (muchas veces constituidas por una
gran cantidad de agua), de modo que las altera. También las altera el uso de colorantes o de sales
empleados para mejorar la resolución de la imagen.
 Hasta los años 1980, cuando Jacques Dubochet y su equipo inventaron la criomicroscopía
electrónica, se congelaba la muestra para conservarla en su estado original.

La tecnología moderna permite reconstruir la muestra biológica -por ejemplo de un virus o una
bacteria- en tres dimensiones.

Aplicación de la criomicroscopía electrónica, recibe Nobel de Química 2017

Yuraima Padrón
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A los investigadores Joachim Frank, Richard Henderson y Jacques Dubochet, el día miércoles 04 de
octubre les fue otorgado el Premio Nobel de química por el desarrollo de la técnica de la
criomicroscopía electrónica como un método para la determinación de las estructura de biomoléculas
con una alta resolución.

Este trio de investigadores, con la técnica en cuestión simplifican el procedimiento para poder observar
bloques de moléculas, los cuales son un elemento primordial para la constitución biológica.
Cabe destacar, que cada uno de estos investigadores trabaja en universidades distintas,  Joachim Frank
en la Universidad de Columbia, en Estados Unidos, Richard Henderson en la Universidad de
Cambridge, en el Reino Unido y Jacques Dubochet en la Universidad de Lausana en Suiza.

Aporte de cada investigador a la técnica de criomicroscopía electrónica

Mediante esta técnica, es posible congelar en forma rápida las moléculas conservando su forma
natural, siendo Frank quien logró procesar las imágenes un tanto borrosas que se obtenían en forma
bidimensional y transformarlas en estructuras en tercera dimensión, y es considerado el fundador de la
técnica de la criomicroscopía electrónica.

En el caso de Henderson, su aporte consistió en presentar la forma estructural de una molécula de

origen bacteriano en una resolución atómica.

Finalmente Dobuchet, consiguió la manera de enfriar el agua en forma más rápida y que se solidifica
en torno a la muestra biológica, este proceso es conocido como vitrificación.

El proceso de congelamiento se realiza con la aplicación de gas propano o de nitrógeno líquido,

teniendo la precaución de que no se formen cristales de hielo, que puedan distorsionar la imagen al
refractar el haz de electrones del microscopio.

Beneficios de  la técnica de criomicroscopía electrónica

Para los investigadores, el entendimiento de las proteínas en su estado natural, es de vital importancia

en todos los aspectos de la ciencia, ya que su actuación tiene una gran influencia en cada organismo
vivo.

Con esta técnica es posible la captura de imágenes de las agujas con las que el virus de
la Salmonella ataca a otras células. También, es importante en la determinación de las proteínas que se
encuentran relacionadas con la resistencia a la acción de los antibióticos, así como en la determinación
de cuáles son las estructuras moleculares que ejercen el gobierno del ritmo circadiano.
Aun cuando el Nobel se ha otorgado a un avance en la tecnología y no a un descubrimiento científico,
los investigadores señalan, que el impacto de este avance, será de gran utilidad para la resolución de
muchos problemas relacionados con la salud, ya que el uso práctico de la misma es diverso.

Un ejemplo de la utilización de la criomicroscopía electrónica, fue en el estudio del papel del virus del
zika en la ocurrencia de microcefalia en bebes, ocurrida recientemente en Brasil, ya que pudieron
generarse imágenes en tercera dimensión del virus y en consecuencia localizar blancos potenciales
para la actuación de los fármacos para combatir este virus.

Cabe destacar, que en opinión de Sara Snogerup Linse, quien es la directora del comité del Nobel, esta
investigación ha llevado a la química a una nueva era.

¿Qué es la crío-microscopía de transmisión electrónica?

El microscopio de transmisión electrónica (TEM, por sus siglas en inglés) produce una señal a partir
de un haz de electrones que es dispersado por su interacción con la muestra Acta Herediana vol. 61,
N° 1, octubre 2017 - marzo 2018 61 en estudio y recogido por un detector que produce imágenes
bidimensionales. El voltaje de aceleración típico (100-300 kV) confiere a los electrones una
velocidad relativística (i.e. significativamente cercana a la velocidad de la luz) para la que se calcula
una longitud de onda de 3 pm (1 pm = 10-12 m). [1]avoiding the expense of high-voltage
microscopy but providing the possibility of atomic resolution even in the absence of lens-aberration
correction. For specimens thicker than a few tens of nm, the image intensity and scattering contrast
are likely to be higher than at lower voltage, as is the visibility of ionization edges below 1000eV (as
required for EELS elemental analysis Esta pequeñísima longitud de onda permite un límite teórico
de resolución diminuto, mucho más allá de los 200 nm de la microscopía de luz visible o de los 20
nm alcanzados con las últimas técnicas de localización por fluorescencia.[2] Dado que los átomos
tienen tamaños varias veces más grandes que este límite (el átomo de hidrógeno mide
aproximadamente 10-10 m), ya por principio TEM debería resultar una técnica óptima para observar
estructuras moleculares con resolución atómica. Imagen tomada de la ref. bibliog[3]. Richard
Henderson fue pionero en buscar la aplicabilidad de TEM para elucidar la estructura de moléculas
biológicas. Determinó que uno de los problemas principales que debían superarse era la cantidad de
energía transmitida por el haz de electrones, que es tan alta que puede destruir la muestra en estudio.
Utilizando pulsos de baja energía, sus exploraciones rindieron fruto en 1975 con su trabajo sobre la
bacteriorodopsina. Esta proteína está naturalmente embebida en la membrana celular de
halobacterias, en donde genera energía a partir de la captación de luz. Resultaba imposible conservar
bacteriorodopsina en estado nativo, pura y concentrada para su cristalización y análisis
Bibliografía
 BRENDA FINA. DICROISMO CIRCULAR Laboratorio de Biología Ósea y Metabolismo
Mineral Facultad Cs. Médicas - UNR - Rosario - Argentina laboratorio@biologiaosea.com.ar
www.biologiaosea.com.ar © 2006 - 2009 Todos los derechos reservados
http://www.biologiaosea.com.ar/files/seminarios/sem%20dicrosimo%20circular.pdf

 Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) "High capacity and low cost detection of
prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC". Jorunal of Neuroscience Methods,
139:263-269

 UNIVERSIDAD POLITECNICA DE CARTAGENA difracción de rayos x

https://www.upct.es/~minaeees/difraccion_rayosx.pdf

 FUNDAMENTO DE DIFRACCION DE RAYOS X

https://investigacion.us.es/docs/web/files/fundamentos_drx.pdf
 Nobel de Química 2017 a los padres de “un método guay para ver moléculas”– Premio
Nobel de Química 2017: Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson ganan por
su técnica para observar moléculas

 Alfredo Florez Ariza1 y Daniel Guerra Giraldez Crío-microscopía electrónica. Resolviendo

la estructura molecular de la vida al detalle atómico Cryo-electron microscopy. Solving the
molecular structure of life at the atomic detail .

 EVA N. breve historia de la criomicroscopia electrónica INVESTIGACION Y CIENCIA

mayo 2016

 UNIVERSIDAD DE ALICANTE. SERVICIOS TECNICOS DE INVESTIGACION

dicroísmo celular https://sstti.ua.es/es/instrumentacion-cientifica/unidad-de-rayos-x-de-
monocristal-y-espectroscopias-vibracional-y-optica/dicroismo-circular.html