Docente

Guía de
laboratorio

Agrícola
Mejora genética
de plantas

RANSG NESIS Objetivos:

Realizar un uso adecuado
de los conceptos
relacionados con la
En el instituto de biotecnología José Celestino Mutis se realizan ensayos ingeniería genética de las
para mejorar las variedades de plantas especificas con un gen que plantas.
potencia la producción de aminoácidos esenciales. Usted ha sido
Conceptos y
contratado como asistente de investigación para realizar la
transformación de hojas o callos usando una técnica especifica Habilidades:
(biobalística, cocultivo o agro-infiltración).
Mejoramiento genético de
plantas con sus
respectivas etapas,
técnicas y estrategias.

RECURSOS
RELACIONADOS

Contenidos:
Mejora genética de
plantas,
micropropagación,
generalidades de la
microbiología, cultivo in
vitro y medios de cultivos
esenciales.

Laboratorios:
Transformación de
bacterias, verificación de
la transgénesis, práctica
libre.
 EQUIPOS DE LA SIMULACIÓN

Cabina de flujo Escalpelo y Lupa móvil y

Cámara climática
laminar Pinzas micropipeta

Tubos falcón y cajas Cajas de Petri y

Mechero Pistola biobalística
con filtros frascos beaker

SECUENCIA DE REALIZACIÓN

Ingrese al simulador virtual de mejora

genética de plantas, registre su
información personal y seleccione la
imagen que se muestra (Figura 1).

Lea la situación / desafío, luego haga clic

en el ícono cerrar para salir de la
introducción y acceder al laboratorio
(Figura 2).
Fig. 1
Durante el laboratorio, puede hacer clic en
el ícono de información para leer la
situación, los procedimientos o para
acceder a las ecuaciones según sea
necesario. Haga clic en el ícono de ayuda
para preguntas comunes. En cualquier
momento, si desea detener el proceso en
el laboratorio y limpiar la estación de
trabajo, haga clic en el ícono de la
Fig. 2
papelera . Haciendo clic en el icono
del lápiz puede acceder al registro de
datos. El ícono le permite acceder al
cuaderno de notas para dar respuesta a
las preguntas complementarias. Si
requiere hacer uso de la calculadora use el
ícono (Figura 3).
1. Identificación de elementos y materiales Fig. 3
para la práctica de laboratorio:

Cabina de flujo laminar.

Cámara climática.
Una gradilla para tubos Falcón (1) y (2).
Un beaker con tapa de aluminio.
Dos cajas de Petri vacías.
Dos piezas metálicas.
Un escalpelo.
Un beaker con alcohol. Fig. 4
Mechero.
Una caja con papeles de filtro.
Una pistola pirobalística.
Una jeringa.
Micropipeta de 1000 µL.
Caja de puntas para micropipeta.
Caja de descarte de puntas para
micropipetas.
Un frasco lavador. Fig. 5
Una lupa con brazo móvil.
Cuaderno de notas.
Calculadora.

2. Identificación de medios de cultivo y

bacterias:

Cuatro frascos con plantas completas.

Frascos con callos (cuatro en cada frasco).
Dos cajas de Petri con medio para cultivo. Fig. 6
Un tubo Falcón (1) con pellet (bacterias) en
el fondo y líquido sobrenadante.
Un tubo Falcón (2) con líquido blanco
traslucido.
Bandejas con plantas.

3. Tratamientos a explantes para

transgénesis:

Inicialmente encienda la cabina de flujo Fig. 7

laminar y automáticamente se encenderá
la luz ultravioleta. Mientras esta luz se
encuentre encendida no se puede abrir la
vista ampliada de la cabina, debe esperar
un momento hasta que la cabina pase al
modo operativo (Figura 4).
Encienda el mechero antes de iniciar
cualquier tipo de operación, dando clic
sobre él. Tenga en cuenta que de no
 hacerlo saldrá una alerta de riesgo Fig. 8
biológico (Figura 5).
Tenga en cuenta verificar muy bien la
situación para tener claro el tipo de
explante que le corresponde, así como el
procedimiento que debe seguir según la
operación que le fue planteada:

o Agro infiltración
o Biobalística.
o Cocultivo.
Fig. 9

4. Preparación de Pellet (bacterias) para agro-

infiltración y cocultivo:

Arrastre el beaker que tiene el papel

aluminio y la gradilla con los tubos Falcón
al área de trabajo en la cabina de flujo
laminar (Figura 6). El beaker se encuentra
en la cámara climática, la cual debe abrir
con un clic.
Fig. 10
De un clic al beaker para destaparlo y otro
clic en cada uno de los dos tubos Falcón
(1) y (2) para destaparlos.
Luego, arrastre el tubo Falcón (1) hacia el
beaker y vierta el contenido sobrenadante
decantándolo. Tenga en cuenta dejar el
líquido del fondo en el tubo Falcón (1) que
es llamado pellet (bacterias), después de
esto, se beben llevar de nuevo a la gradilla
(Figura 7).
Fig. 11
Ahora, se debe arrastrar una micropipeta
desde la base donde está alojada hacia la
caja de las puntas e insertar una de las
puntas sobre la punta de la micropipeta
acercándola a la punta (Figura 8).
Ajuste el volumen de 50 µL a sorber,
desplace la micropipeta hacia el tubo
Falcón (2) que contiene un líquido
traslúcido y presione el émbolo con un clic
para sorber el volumen configurado
Fig. 12
(Figura 9).
Se debe arrastrar la micropipeta hacia la
boca del tubo (1) que tiene el pellet
(bacterias). Luego, se debe verter el
contenido de esta presionando con un clic
de nuevo el émbolo (Figura 10).
Después de esto se debe descartar la
punta de la micropipeta arrastrándola
hacia la caja de descarte de puntas y se
 debe presionar el botón de descarte Fig. 13
(Figura 11).
Lleve la micropipeta a su sitio y con un clic
se cierra el tubo Falcón (1).
De esta manera se prepara el pellet
(bacterias) para los procesos de
agroinfiltración o cocultivo.

5. Preparación de plantas y callos para las

operaciones:

Fig. 14
De un clic en la puerta de la cámara
climática para abrirla y arrastre hacia el
área de trabajo en la cabina de flujo
laminar la caja con plantas o los frascos
con los callos según se le solicite en la
situación.
Arrastre una caja de Petri al área de
trabajo y con un clic destápela, luego con
un clic se destapa el frasco con los callos
o plantas.
Para cortar los callos o plantas se usa el Fig. 15
escalpelo, para esto solo se requiere un
leve movimiento del escalpelo dentro del
frasco beaker. Antes de usar el escalpelo
o las pinzas, deben pasarse por el fuego
del mechero. De no hacerlo se puede
continuar la simulación, pero se generará
una alerta de riesgo por contaminación. Al
final se debe tapar la caja de Petri de
nuevo.
Con las pinzas se arrastran de a uno a uno Fig. 16
los callos hacia la caja de Petri que se
encuentra sin tapa (Figura 12).

Ahora guíese de un punto específico del

procedimiento según le indique la situación
propuesta:
o Cocultivo (6) Fig. 17
o Agroinfiltración (7)
o Biobalística (8)

6. Operaciones con cocultivo:

Arrastre la caja de Petri vacía y la caja de

papeles de filtro al área de trabajo dentro
de la cabina de flujo laminar y con un clic
abra cada una de las cajas. Luego, lleve un
papel de filtro hasta la caja de Petri y
colóquelo en su interior (Figura 13). Fig. 18
 Arrastre la caja de Petri con los explantes
(callos o fragmentos de hojas) que preparó
en el procedimiento anterior hacia el área
de trabajo en la cabina de flujo laminar
(Figura 14).
De igual manera lleve la gradilla con el
tubo Falcón (1) que tiene el pellet
(bacterias) (Figura 14). Se destapa la caja
de Petri con clic y el tubo Falcón (1) con un
Fig. 19
clic.
Luego, se arrastra el tubo Falcón (1) hacia
la caja de Petri con los explantes y se
decanta el líquido sobrenadante sobre ella
(Figura 15).
Se agarran los explantes y se colocan en
la caja Petri que tienen el papel de filtro, al
final con un clic se tapa. Luego, se abre la
cámara climática y se arrastra la caja de
Petri con papel de filtro y explantes al
interior y se cierra con un clic. Se da clic en Fig. 20
el panel de control y se enciende la cámara
(Figura 17).
Luego, se abre la cámara de climatización
y se arrastra la caja de Petri hacia el área
de trabajo y con clic se destapa.
Se arrastra el frasco lavador al área de
trabajo y se vierte agua encima de ellos
para lavarlos (Figura 18). Se arrastra otra
caja de Petri con medio de cultivo hacia el
área de trabajo y con un clic se destapa.
Con la pinza se agarran los explantes que
Fig. 21
se lavaron y se llevan a la caja Petri que
tiene el medio de cultivo para sembrar
entre los explantes (Figura 19).
Con un clic cierre la caja de Petri y llévela
a la cámara climática. Ahora, con un clic
abra el panel de control, el cual se
encuentra configurado con un tiempo de
15 días de oscuridad, temperatura 25
grados Celsius y 87% de humedad
relativa. (Figura 20)
Después de transcurrido el tiempo de Fig. 22
oscuridad para todos los casos, se
realizará la observación de la caja de Petri
con la lupa donde se cuenta el número o
cantidad de explantes buenos o vivos
según sea la situación (Figura 21).

7. Operaciones con agro-infiltración

 Arrastre el frasco de boca ancha con la
tapa traslucida que tiene la planta (tiene de
3 a 9 hojas de acuerdo a la situación) hacia
el área de trabajo en la cabina de flujo
laminar. Con un clic se destapa el frasco y
queda la planta con las hojas listas para el
procedimiento (Figura 22).
Luego, de clic a la gradilla de los tubos
Falcón y llévela al área de trabajo,
después de clic en el tubo Falcón (1) que Fig. 23
tiene el pellet (bacterias) para destaparlo
(Figura 23).
Ahora se arrastra la jeringa (de 2.5 mL)
hacia el tubo Falcón (1) y se sorben 2.5 mL
del líquido dando clic en la jeringa (Figura
24).
Acerque la jeringa hacia una de las hojas
de la planta y con un clic active el control
de expulsión del líquido y vierta 0.5 mL
Fig. 24
sobre la hoja. Escoja otros cuatro puntos
de la hoja y realice la misma operación en
los puntos separados.
Una vez terminado la infiltración en las
hojas de la planta, se cierra el recipiente
con un clic y se lleva a la cámara climática
para ubicarlo dentro de ella. Con un clic se
Fig. 25
abre el panel de control y se enciende la
cámara climática (Figura 25).
Después de transcurrido el tiempo de
oscuridad, se evalúan mediante
observación las hojas que sobrevivieron
(Figura 26).

8. Operaciones con pistola de biobalística:

Se arrastra la caja de Petri con los

explantes (callos o hojas) preparados con
anterioridad tal y como se explica en el Fig. 26
p n o 5 preparaci n de plan a ca o
para la operacione .
Ubique la caja de Petri de manera vertical,
dando clic en la zona activa (Figura 27).
Luego, se arrastra la pistola de
Biobalística hasta el área de trabajo y se
ubica en frente de la caja de Petri con los
explantes en la cabina de flujo laminar a
una distancia aproximada de quince (15)
centímetros (Figura 27).
La pistola de biobalística tiene un indicador Fig. 27
de distancia que se mantiene encendido
 con colores verde, amarillo y rojo teniendo
en cuenta la distancia correcta, aceptable
e incorrecta, respectivamente (Figura 28).
Tenga en cuenta que, si la distancia es
mayor o menor, la supervivencia de los
explantes disminuye de manera
proporcional por cada centímetro de
diferencia.
Después de tener la pistola en la posición
adecuada se da clic para accionarla y
disparar hacia los explantes (Figura 28). Fig. 28
La cantidad habilitada de disparos es de
cinco (5). Si se realizan más de esta
cantidad de disparos se disminuirá la
utilidad de las hojas o callos.
Luego de realizar los disparos la pistola se
devuelve a su lugar inicial. Regrese la caja
de Petri a la mesa dando clic en la zona
activa, ciérrela con un clic en la tapa y
llévela a la cámara climática.
Dando clic sobre la cámara climática se
Fig. 29
abre la puerta y se ingresa la caja de Petri.
Se da clic en el panel de control y se
enciende (Figura 29).
Después de transcurrir el tiempo de
oscuridad, se realiza la observación de la
caja de Petri con la lupa donde se cuenta
el número o cantidad de explantes buenos
y vivos según sea la situación (Figura 30).

9. Recomendaciones operativas de trabajo en

el laboratorio:

No abrir la cabina de flujo laminar mientras

tenga encendida la luz ultravioleta. Fig. 30
Tener presente que el aire de la cabina de
flujo laminar debe estar encendido al inicio
de la práctica de lo contrario se tendrán
problemas de contaminación.
Hacer la manipulación de los explantes
con las pinzas metálicas y no colocar más
de dos explantes en cada uno de los
frascos con medio de cultivo.
No destapar los frascos con el medio de
cultivo por fuera de la cabina de flujo
laminar debido a que hay probabilidades
de contaminación.
Los explantes no se pueden cultivar sin ser
diseccionados debido que existe
Fig. 31
 probabilidades de que no respondan al
tratamiento.
Se debe utilizar la lupa en el momento de
cortar los explantes y para examinar los
frascos después de terminar el proceso.

10. Cálculos en el laboratorio:

Use el botón de información para

consultar las ecuaciones relacionadas con Fig. 32
esta práctica de laboratorio.
Con los datos de los explantes vivos o bien
desarrollados calcule el porcentaje de
explantes transformados.

11. Registros de datos:

Tenga en cuenta que para esta práctica de

laboratorio se solicita ingresar en el
registro de datos: número de explantes
sembrados y porcentaje de supervivencia
de explantes. El nombre de la planta,
técnica de transformación y tipo de
explante, se ingresarán de manera
automática (Figura 31).
Una vez ingresados todos los valores Fig. 33
solicitados en el registro de datos, haga
clic en el bo n erificar para comprobar
si son correctos (Figura 31).

12. Preguntas complementarias:

Use el botón de cuaderno de notas

para dar respuesta a las preguntas
planteadas en éste (Figura 32).
Tenga en cuenta que son cuatro
preguntas complementarias a responder,
donde debe usar la flecha para pasar a
la siguiente.

13. Evaluación y reportes de laboratorio:

Si los valores ingresados son correctos

continúe con la evaluación y la generación
del reporte de laboratorio (Figura 33).

DESARROLLO DE LABORATORIO

En este laboratorio se debe realizar transformación genética de plantas (hojas o callos) por medio de alguna
de las tres técnicas posibles (cocultivo, agroinfiltración o biobalística).
En este caso se mostrará el desarrollo para la técnica de agro-infiltración en hojas.

Situación propuesta

Fig. 34

Siembra para el crecimiento de explantes:

Siguiendo con el procedimiento explicado con anterioridad, se debe encender la cabina de flujo laminar,
esperar el tiempo que requiere la luz ultravioleta y arrastrar hacia la cámara las plantas y los tubos tipo Falcón
(Figura 35.1). Arrastre la jeringa hasta el tubo tipo Falcón 1 y sorba 2.5 mL del líquido (Figura 35.2).

Fig. 35.1 Fig. 35.2

Ahora lleve la jeringa a 5 de las 6 plantas y vierta de a 0.5 mL en cada una, para esto de clic en la jeringa
para abrir su vista ampliada y dando clic de nuevo vierta la cantidad exacta (Figura 36.1 y 36.2).
 Fig. 36.1 Fig. 36.2

Ahora, deberá tapar el recipiente con las plantas y llevarlo de nuevo a la cámara de climatización (Figura
37.1), una vez cierre la cámara, entre al panel de control, enciéndala sin configurar los parámetros y espere
a que el tiempo requerido termine (Figura 37.2).

Fig. 37.1 Fig. 37.2

Finalmente, regrese las plantas a la cabina de flujo laminar y observe los resultados con ayuda de la lupa. En
este caso se obtuvieron 3 plantas verificadas (Figura 38.1) de las cuales solo una se encontraba en mal
estado (Figura 38.2), y 3 plantas sin verificar (Figura 38.3). Note que las plantas verificadas son aquellas con
círculos en sus hojas.

Fig. 38.1 Fig. 38.2 Fig. 38.3

Cálculos en el laboratorio de biotecnología

Para el registro de datos se requiere conocer el porcentaje de supervivencia. Por lo tanto, se realizarán dichos
cálculos con la ayuda de las ecuaciones encontradas en el botón .

Porcentaje de supervivencia:

𝑁° 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑗𝑎𝑠 𝑣𝑒𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑦 𝑏𝑢𝑒𝑛𝑎𝑠

% ∗ 100
𝑁° 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑗𝑎𝑠 𝑣𝑒𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎𝑠

2
% ∗ 100
3

%𝑺 𝒑𝒆 𝒊 𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂 %

Finalmente, se procede a realizar el registro de datos.

REGISTRO DE DATOS

En este espacio se muestra la información recopilada en el registro de datos. Recuerde que los datos de cada
práctica de laboratorio son aleatorios.

Fig. 39
 PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

A continuación, se muestran las respuestas esperadas a las preguntas complementarias que se deben
registrar en el cuaderno de notas.

1. ¿Qué son genes de resistencia a herbicidas?

R// Son aquellos genes que poseen la habilidad heredada de sobrevivir a una dosis de herbicida, lo que
con el tiempo podría generar resistencia en la planta completa.

2. ¿En qué consiste el método de trasformación por agro-infiltración?

R// Los tejidos de la planta son infiltrados con una suspensión líquida de Agrobacterium, que contienen
los genes que se desean expresar en la planta. Existen dos procedimientos para infiltrar los tejidos de
la planta, uno utiliza la inyección de jeringas sin agujas y el otro utiliza cámaras de vacío.

3. ¿Qué desventajas presenta el método de transformación por biobalística?

R// La principal desventaja es la falta de control, porque al ser un disparo no se puede verificar muy bien
la cantidad de ADN que entra a cada célula o que se inserta en un lugar adecuado, lo que lleva a que la
célula no funcione correctamente o muera.

4. ¿Qué otros métodos de mejora genética existen distintos a agroinfiltración, biobalística y cocultivo?

R// Electroporación, transformación mediada por Agrobacterium y vectores virales.

PREGUNTAS CONCEPTUALES

Preguntas de selección múltiple

Enunciado: Existen diferentes métodos para lograr el mejoramiento genético de plantas entre los más usados
encontramos la agro-infiltración, la biobalística y el cocultivo. A partir del enunciado determine:

¿Por qué en biobalística no es necesario usar Agrobacterium?

a. No se usan células vegetales.

b. Es una técnica de regeneración celular.
c. Emplea proyectiles que llegan al interior de las células (respuesta correcta).
d. Emplea bacterias diferentes al Agrobacterium.
¿Cuál de los métodos permite obtener mayor cantidad de material genético foráneo en los tejidos
vegetales transformados?

a. La agro-infiltración (respuesta correcta).

b. La PCR.
c. El cocultivo.
d. La biobalística.

¿Cuál de los métodos permite lograr una transformación estable?

a. La biobalística
b. La agro-infiltración.
c. LA PCR
d. El cocultivo (respuesta correcta)