Informe °n 2 Final Andrea

PRACTICA N°2 TINCION DE GRAM
“Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia”
Universidad Nacional del Callao

Escuela Profesional de Ingeniería Química
Informe de Laboratorio N°02

Tinción de Gram
• Asignatura: Laboratorio de Microbiología

• Grupo: 90 G
• Docente: Herrera Sanchez Sonia Elizabeth
• Integrantes:
❖ Astocondor Silva, Sandro
❖ Ávila Herencia, Fiorela
❖ Benites Tantalean, Brizeth
❖Bravo Sanchez, Crhistian
❖Del Aguila Tunque, Andrea
Bellavista, febrero del 2021

INDICE
I.INTRODUCCION ..................................................................................................................... 3
II.OBJETIVOS............................................................................................................................. 4
III.MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 5
3.1. Tinción de Gram ........................................................................................................... 5
3.2. Clasificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas .......................... 7
3.3. Diferencias de bacterias Gram negativas y Gram positivas ............................. 8
3.4. Enfermedades que produce la Salmonella .......................................................... 10
3.5. Listar las pruebas del laboratorio, tratamiento .................................................. 11
3.6. Patogenia de la Salmonella...................................................................................... 12
3.7. Prevención ................................................................................................................... 13
IV.EQUIPOS Y MATERIAES ................................................................................................. 15
VI.RESULTADOS .................................................................................................................... 22
VII.DISCUSION......................................................................................................................... 23
VIII.RECOMENDACIONES .................................................................................................... 24
IX.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................ 25
X.ANEXOS ................................................................................................................................ 26
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO 2

I.INTRODUCCION
Dentro del estudio de la microbiología está presente distintas técnicas para

estudiar la morfología celular bacteriana en los laboratorios. Una de ellas, es
considerada como uno de los métodos más importantes en el campo de estudios
bacteriológicos, está conformada por una serie de pasos el cual se denomina
tinción gram.
De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes

grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más
fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante
(Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo
en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las
células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un
colorante de contraste (safranina) dando un color rosa suave para que puedan
observarse.

II.OBJETIVOS
✓ Realizar la tinción Gram de coloración bacterianas

✓ Observar al microscopio algunas formas bacterianas
✓ Observar la morfología de la célula bacteriana.
✓ Identificar si las bacterias son Gram (+) o Gram (-).
✓ Adquirir destreza en la prelación de frotis bacterianos
✓ Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.
✓ Identificar características en las bacterias en estudio en base a las
diferentes tinciones.

III.MARCO TEÓRICO
3.1. Tinción de Gram
La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica

de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las
bacterias. Esta técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra
de cualquier origen, que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos
después, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el
colorante permanezca en la pared bacteriana, y se trataría de bacterias Gram
positivas y, en el segundo la pared tendría un color rosado, serian bacterias
Gram negativas.
Figura 1.

El procedimiento de tinción más ampliamente usado en bacteriología, Nos

permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos taxonómicos: Gram
positivas y Gram negativas, según sea su comportamiento frente a la tinción. Se
cree que la diferencia en la coloración que adquieren los dos grupos de bacterias
se debe a la distinta composición química de la pared celular. Las bacterias Gram
positivas tienen una gruesa capa de mureína o peptidoglicano (de 20 a 80 nm de
espesor) en su pared, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una
capa de peptidoglicano (2 nm) más fina y una capa más externa de
lipopolisacáridos, lipoproteínas y lípidos.
Figura 2.

Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación
de la mayoría de bacterias. La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones.
Algunas bacterias no tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias y, no se
podrán identificar, al igual que los virus.
3.2. Clasificación de bacterias Gram negativas y Gram positivas
Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular interna y una pared de
peptidocluno. En cambio, las negativas poseen una pared celular más
completa. Las positivas no cuentan con una membrana externa.
Las negativas tienen membrana externa que forma un saco rígido alrededor de
la bacteria.
Figura 3.

3.3. Diferencias de bacterias Gram negativas y Gram positivas
Diferencias de bacterias Gram Positivas y Gram Negativas
BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Poseen una pared celular más compleja:
Poseen una pared celular interna y una -Pared celular interna
pared de peptidoglucano -Pared de peptidoglucano
-Bicapa lipídica externa
Membrana externa: forma un saco rígido
alrededor de la bacteria, mantiene
No tiene membrana externa estructura y es barrera impermeable a
macromoléculas, ofrece protección en
condiciones adversas.
Espacio periplasmático: espacio entre la
No tiene espacio periplasmático superficie externa de la membrana
citoplasmática y la interna de la
membrana externa
La red de mureína está muy desarrollada

La red de mureína presenta una sola capa
y llega a tener hasta 40 capas.
En la tinción Gram, retienen la tinción Quedan coloradas

azul.

Pared celular de las bacterias Gram positivas
Figura 4.
Pared celular de las bacterias Gram Negativas
Figura 5.

La tinción requiere cuatro soluciones un colorante o tinte básico, un mordiente

(sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el tinte), un decolorante
(elimina el tinte de una célula teñida) y un segundo tinte o colorante de contraste
(tinte de color diferente a la inicial). Tras la tinción con el primer colorante (Cristal
violeta) se efectúa una decoloración con etanol que arrastrará al colorante sólo
en las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram negativas se
teñirán después con el colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.(Natalben, 2015)
3.4. Enfermedades que produce la Salmonella
Cuando el intestino está infectado, los síntomas comienzan generalmente entre

12 y 48 horas después de la ingestión de las bacterias. Se producen náuseas
y cólicos abdominales, seguidos rápidamente por diarrea acuosa, fiebre y
vómitos. Por lo general, la Salmonella remite en un término de 1 a 4 días. En
ocasiones, los síntomas son más graves y duran mucho tiempo.
Mucho tiempo después de que desaparezcan los síntomas, algunas personas
siguen excretando bacterias en sus heces A estas personas se las conoce
como portadoras.
Cerca del 10 al 30% de los adultos desarrollan artritis reactiva semanas o

meses después del cese de la diarrea. Este trastorno causa dolor e inflamación,
generalmente en las caderas, las rodillas y el tendón de Aquiles (que conecta
el hueso del talón y el músculo de la pantorrilla).
Si se desarrolla bacteriemia y se propaga la infección pueden producirse otros
síntomas. Por ejemplo, si un hueso está infectado, la zona que lo recubre suele
estar sensible o dolorida; si está infectada una válvula cardíaca, la persona
siente dificultad para respirar, y si está infectada la aorta se siente dolor en la
espalda y el abdomen.
Las personas afectadas suelen recuperarse bien. Las excepciones son las
personas que ya sufrían un trastorno, sobre todo uno que debilitara el sistema

inmunológico, antes de la infección por Salmonella o antes de sufrir una

complicación debida a la infección.
3.5. Listar las pruebas del laboratorio, tratamiento
Detección
• Mediante coprocultivo: Se analizan las heces del paciente para poder
aislar la salmonela, también se puede optar por un frotis rectal, aunque se
prefiere el primer método. Sería el método más utilizado para el diagnóstico
de la gastroenteritis causada por esta bacteria. También resulta de una
gran utilidad una vez haya finalizado el tratamiento para poder reconocer a
aquellos individuos que resulten ser portadores crónicos de la bacteria.
• Mediante hemocultivos: Es decir, cultivos llevados a cabo gracias a
una muestra de sangre. Esta técnica es útil en los casos graves, como
la fiebre tifoidea, en los que la salmonela pasa al torrente sanguíneo. En
estos casos, suelen resultar positivos las muestras que han sido recogidas
durante la primera semana de la infección.
• Serología o determinación de anticuerpos: Es poco útil en esta
infección, incluso en aquellos pacientes no tratados.
• Análisis del alimento: Si se tiene la convicción de que un determinado
alimento ha sido el causante de la salmonelosis y todavía se tiene en poder
un aparte de él, puede entregarse para que realicen pruebas sobre el
mismo y valoren la presencia de las bacterias en su interior.
Tratamiento
• Para la infección intestinal, líquidos
• Para las personas que están en riesgo de contraer o han contraído

bacteriemia, antibióticos
• En caso de abscesos, drenaje quirúrgico
La Salmonella provoca infección intestinal que se trata mediante la

administración de líquidos por vía oral o, en infecciones graves, por vía

intravenosa. En las personas con Salmonella intestinal, los antibióticos no

acortan el tiempo de recuperación y pueden provocar que las bacterias se
excreten en las heces durante más tiempo. Por lo tanto, no suelen
administrarse antibióticos. Sin embargo, a las personas con riesgo de
bacteriemia (como los residentes de edad más avanzada de una residencia de
ancianos, los bebés y las personas con infección por VIH), así como las
personas con dispositivos o materiales implantados (como prótesis articulares,
válvulas cardíacas o injertos de vasos sanguíneos) se les administran
antibióticos. Puede administrárseles ciprofloxacino, azitromicina o ceftriaxona
durante varios días. A los niños se les administra trimetoprima-sulfametoxazol.
A las personas con bacteriemia se les administran antibióticos como
ciprofloxacina o ceftriaxona aproximadamente durante 2 semanas. Si la
bacteriemia continúa, se administran antibióticos entre 4 y 6 semanas.
Los abscesos se vacían quirúrgicamente, y se administran antibióticos durante
4 semanas como mínimo.
Si la aorta, una válvula del corazón, u otras áreas (tales como las
articulaciones) están infectadas, generalmente se requiere cirugía y
administración de antibióticos durante semanas o meses.
3.6. Patogenia de la Salmonella
Su patogenia comienza con la ingestión del inóculo cuya acción y efecto es

la inoculación, que puede variar de 103 a 106 células. Si el inóculo es
suficientemente grande, superará la barrera gástrica que supone el pH ácido.
El patógeno logra atravesar la barrera intestinal y es fagocitado a nivel de las
células M de los enterocitos y placas de peyer (esto se da habitualmente a nivel
del íleon terminal y primera porción del colon). Su protección frente
a polimorfonucleares, sistema del complemento e inmunoglobulinas le permite
diseminarse linfáticamente y colonizar los territorios del hígado y bazo.
Comenzará entonces a multiplicarse y a aumentar en número, aumentado la
posibilidad de que un hospedero sufra una bacteriemia.

3.7. Prevención
En verano, con la llegada del calor deben extremarse las precauciones, ya que
las altas temperaturas pueden favorecer la multiplicación de la Salmonella.
En concreto, se aconseja tomar las siguientes medidas preventivas para evitar

la aparición de casos de salmonelosis.
• En la elaboración de alimentos de consumo inmediato en los que figure el

huevo como ingrediente, especialmente mayonesas, salsas y cremas, se
sustituirá el huevo por ovoproducto pasterizado (huevina), excepto
cuando estos alimentos sigan un posterior tratamiento térmico superior a
75ºC en el centro de los mismos. Además de elaborarse con ovoproducto
pasterizado, las salsas mayonesas tendrán un pH ácido (menor de 4,2).
Otra alternativa más sencilla es recurrir a las mayonesas de origen
industrial.
• Se tendrá un especial cuidado a la hora de conservar los alimentos donde
figure el huevo u ovoproducto como ingrediente, manteniéndose a una
temperatura de refrigeración máxima de 8ºC, y consumiéndose el mismo
día de su elaboración (caducidad 24 horas).
• Respecto a los huevos frescos, se recomienda su conservación en
frigorífico una vez adquiridos hasta su consumo, manteniéndolos en una
zona del mismo separados de otros alimentos.
• Inmediatamente antes de utilizar el huevo (no antes), se recomienda
lavarlo con agua y detergente y secarlo bien. No se hará antes, ya que de
lo contrario eliminaríamos una cutícula protectora de la cáscara que lo
protege durante su conservación.
• Evitar la caída de trozos de cáscara en la yema y clara a la hora de cascar
el huevo, desaconsejándose cascarlo en el borde de platos o recipientes.
Otras recomendaciones generales para evitar toxiinfecciones alimentarias por

Salmonella son:
Lavarse bien las manos después de ir al servicio y antes de elaborar alimentos.

Evitar contaminaciones cruzadas manteniendo aislados los alimentos crudos de

los ya cocinados, conservados en recipientes tapados, manteniendo los
alimentos que así lo requieran a temperaturas de refrigeración adecuadas.
Cocinar bien los alimentos de origen animal, especialmente la carne y los

huevos, evitando que queden crudos en su interior.
Respecto al agua de consumo, en aquellos países o lugares donde ésta no sea

potable, se deberá consumir agua envasada con garantías, que sea abierta en
su presencia, y evitar el consumo de hielo. También nos aseguraremos de que
las ensaladas y frutas hayan sido lavadas con agua potable.

IV.EQUIPOS Y MATERIAES
• Muestra
• Colorantes: cristal violeta, Lugol, alcohol acetona, safranina
• Piceta
• Bandeja de poco fondo
• Puente de vidrio
• Microscopio
• Aceite de inmersión
• Reloj con segundero
• Portaobjetos

V.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Colocaremos unas gotas de la muestra con salmonella en el portaobjeto.

Luego colocaremos el portaobjeto sobre el puente y a continuación añadiremos
unas gotas de cristal violeta. Dejaremos actuar por 1 minuto. (El colorante tiñe
todas las células).
2. Transcurrido el minuto. Escurrimos el exceso de colorante y lavamos con

agua hasta que el portaobjeto este incoloro.

3. Añadimos el segundo reactivo que es el Lugol al portaobjetos y nuevamente

dejamos actuar por 1 minuto. (El Lugol actúa como mordiente).
4. Transcurrido el minuto. Escurrimos el exceso de lugol y lavamos con agua

hasta que el portaobjeto este incoloro.

5. Añadimos unas gotas de alcohol acetona. Como la muestra es de salmonella

se arrastra las células violetas de las gram negativas por lo que estas quedan
incoloras.
6. Inmediatamente quitaremos el exceso con agua destilada.

7. Se vierten unas gotas de safranina y dejamos que actúe 1 minuto. (Este

reactivo solo tiñe de color rojo a las células que se decoloran como es el caso
de la Salmonella).
8. Transcurrido el minuto. Escurrimos el exceso de safranina y lavamos con

agua destilada.

9. Después dejamos secar la muestra.
10. A continuación, colocaremos la muestra dentro del microscopio y veremos

su morfología y color. También se añaden unas gotas de aceite de inmersión
para aumentar la resolución.

11. Como la muestra es Salmonella, el color es rojo por ser gran negativa y la
forma es de bacilos.

VI.RESULTADOS
Con el método de tinción de Gram se pudo determinar que la Salmonella es una

bacteria Gram negativa y su forma es de bacilos.
Este método utilizado nos ayudó a identificarla y aislar su presencia. El

fundamento de la técnica se basa en las diferencias de las paredes celulares
entre las bacterias Gram negativas, donde la capa de peptidoglicano es delgada
y las de las bacterias Gram positivas con capas gruesas.
En la Gram negativas, sus paredes son delgadas lo cual permite que se escape
el complejo violeta/yodo perdiendo la coloración (azul-violácea), caso contrario
con las Gram positivas las cuales poseen paredes más gruesas y estas impiden
escapar el complejo manteniendo la coloración (Azul/violeta).

VII.DISCUSION
(Linder 1995) nos dice que Los microorganismos del género Salmonella son
bacilos, Gram negativos, anaerobios facultativos, pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae.
(Popoff 1992) también nos confirma que Salmonella pertenece a la familia

Enterobacteriaceae. Los miembros de esta familia, son bacilos Gram negativos
de 2 a 3 x 0.4 a 0.6 micras de tamaño.

VIII.RECOMENDACIONES
• Es conveniente estandarizar los tiempos de tinción para cada laboratorio,

ya que la calidad y concentraciones de reactivos pueden variar bastante.
• Lo mas recomendable es realizar el gran de los cultivos en agares
enriquecidos y de colonias aisladas y en crecimiento.
• La muestra no debe ser excesiva para poder determinar las otras
características de la bacteria, como forma y agrupación.

IX.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Benson Harold. 1979 microbiological applications, a laboratory manual in general

microbiology. Third edition. Wm, C. Brown Company Publisher.
Dr. Jatin, M. 2011 medline plus información de la salud tinción de Gram [05 dic.
2014] pag. 2
Endo, S. 1904. Über ein Verfahren zum Nachweis der Typhusbacillen. Centr. f.
Bakt. 35:109-110.
Faamacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Sexta Edición pp 192, 1994
Joseph Md State. Dept Health. Procedures, 1960
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni
_02/56/cap304.htm#:~:text=Los%20colorantes%20b%C3%A1sicos%20s
on%20aquellos,es%20el%20ion%20cargado%20negativamente.&text=E
ntre%20los%20colorantes%20b%C3%A1sicos%20m%C3%A1s,y%20el
%20azul%20de%20metileno.
https://www.msdmanuals.com/es/hogar/infecciones/infecciones-bacterianas-
bacterias-gramnegativas/infecciones-por-
salmonella#:~:text=las%20bacterias%20Salmonella%20causan%20vari
os,tipos%20distintos%20de%20bacterias%20Salmonella.
https://www.webconsultas.com/salud-al-dia/salmonelosis/diagnostico-de-la-
salmonelosis

X.ANEXOS
CUESTIONARIO:
1. Explique el mecanismo químico de la tinción de Gram, refiriendo la

reacción entre los reactivos y los componentes de la pared celular
Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las Gram positivas. La razón es la menor cantidad
de mucopéptido de las paredes de las bacterias Gram negativas-esquema
Etanol
La diferenciación se hace añadiendo pequeñas cantidades de etanol a las
células teñidas con cristal violeta. El citoplasma de las células que han perdido
el cristal violeta se tiñe con otro colorante (safranina). La diferencia de color se
relaciona con el tipo de pared bacteriano: células de color violeta (bacterias de
pared Gram positivas) y células de color rosa (bacterias de pared Gram
negativa).
Diferencia de color
En realidad, la diferencia de color no es específica de la pared bacteriana: todas
las células sin pared (como las animales) pierden fácilmente el cristal violeta (se
verán de color rosa). Todas las células con pared gruesa (como las de hongos)
se verán de color violeta. La correlación entre el color y el tipo de pared solo tiene
sentido con células bacterianas (salvo excepciones).
Cristal violeta
El cristal violeta es básico (se une a componentes celulares de carga negativa).
Atraviesa la envuelta celular y se acumula en el citoplasma. Para facilitar la
diferenciación se mezcla lugol con cristal violeta: el complejo cristal-violeta-lugol
precipita. Así el lugol dificulta la salida del cristal violeta de ambos tipos de
células, pero es más fácil de extraerlo de las Gram negativas que de las Gram
positivas

Decoloración y safranina
Cuando se añade etanol a una mezcla de células Gram positivas y Gram
negativas teñidas con cristal violeta, las células Gram positivas quedan teñidas
de violeta: no puede atravesar la gruesa capa de mureína (pueden hacerlo si se
prolonga excesivamente el contacto con el alcohol). La pared de las bacterias
Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína más delgada, a través
de la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas células. Su citoplasma queda
incoloro y puede teñirse de color rosa con el colorante de contraste: la safranina
2. Investigue a qué se debe la afinidad de los colorantes básicos por

las bacterias, y a qué la de los ácidos.
La mayoría de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas lo

cual facilita su unión a los colorantes básicos, los cuales tienen iones cargados
positivamente. Dentro de los más comunes a usar tenemos a la sufranina, la
fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.
Por otra parte, algunas células microbianas poseen cargas positivas y se unen
fácilmente a colorantes ácidos, los cuales tienen iones cargados negativamente.
Estos, se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos.
Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
3. ¿Por qué los colorantes negativos no penetran a la bacteria?
Los colorantes negativos no penetran la célula de la bacteria debido a la

carga negativa en la pared celular ya que estas son ricas en ácidos nucleicos y
poseen carga negativa en forma de fosfatos, por lo tanto, poseen mayor afinidad
con los colorantes básicos.

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La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica

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3.3. Diferencias de bacterias Gram negativas y Gram positivas

Diferencias de bacterias Gram Positivas y Gram Negativas

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La red de mureína está muy desarrollada

En la tinción Gram, retienen la tinción Quedan coloradas

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3.6. Patogenia de la Salmonella

Su patogenia comienza con la ingestión del inóculo cuya acción y efecto es

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En concreto, se aconseja tomar las siguientes medidas preventivas para evitar

• En la elaboración de alimentos de consumo inmediato en los que figure el

Otras recomendaciones generales para evitar toxiinfecciones alimentarias por

Lavarse bien las manos después de ir al servicio y antes de elaborar alimentos.

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Cocinar bien los alimentos de origen animal, especialmente la carne y los

Respecto al agua de consumo, en aquellos países o lugares donde ésta no sea

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1. Colocaremos unas gotas de la muestra con salmonella en el portaobjeto.

2. Transcurrido el minuto. Escurrimos el exceso de colorante y lavamos con

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6. Inmediatamente quitaremos el exceso con agua destilada.

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