DIPLOMADO

 EN  DIAGNOSTICO  MOLECULAR    

EN  EL  LABORATORIO  CLINICO    

MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  

Biología  Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  4:  Mecanismos  de  regulación  de  la  
expresión  génica    

Dr.  Alejandro  Catalán    

alejandro.catalan@uantof.cl  
Departamento  de  Tecnología  Médica  
Facultad  de  Ciencias  de  la  Salud  
Universidad  de  Antofagasta    
Etapas de la expresión genética en eucariontes y bacterias

2  
Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  5th  ediNon.New  York.  
Diferencias de las estructuras de unidad transcripcional
de eucariontes y procariontes
Policistronicos

Monocistronicos

3  
5’   3’  
Corriente   –1   +1  
Corriente  
arriba   abajo  

4  
5  
 Transcripción del ADN es mediada por la
ARN polimerasa

• ARN polimerasas catalizan la

formación de enlace fosfodiester
para unir los ribonucleótidos (ATP,
UTP, CTP, GTP) formando una
cadena lineal de ARN.
• Polimerización de ARN como en
el ADN es en sentido 5’ ->3’.
• A RN pols pueden iniciar la
síntesis de ARN sin necesidad de
partidor (Cebador).
• Tasa de error: 1 cada 10000 pb
(ADN pol 1/107)

6  
 Estructura  ARN  polimerasa  
Las  ARN  polimerasas  de  Eubacteria,  Archea  y  Eucariontes    presentan  similar  
estructura  y  función.  
 
Formadas  por  subunidades  β  y  β’,  dos  subunidades  α  y  una  subunidad  ω  

Core   (α   1   y   2,   β   y   β’):  
p r e s e n t a   a c N v i d a d  
cataliNca.    
Factor   sigma:   sin   un  
papel   en   la   elongación  
del   ARN.   Liberado   al  
inicio   de   la   sintesis   de  
ARN.    
Guía  a  la  ARN  polimerasa  
al   siNo   de   inicio   de   la  
transcripción.    

7  
8  
 Secuencias consenso cercanas al sitio de
iniciación de la transcripción

Secuencia  consenso:  secuencias  de  nucleóNdos  comunmente  encontradas  

9  
en  
un  siNo  específico  del  ADN  o  ARN.  
SECUENCIA  DE  INICIO  DE  LA  TRANSCRIPCION  DEL  
ADN  
Hebra  templado  para  
síntesis  del  ARN    

10  
11  
 REGION  PROMOTORA  DE  LA  TRANSCRIPCION  

PROCARIONTES  

-35 -10 inicio +1

------ ------- TTGCCA ------- TATAAT ---------------------ATG---

EUCARIONTES  

-80 -35 -25 inicio

--CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA--------ATG

Caja  TATA:  secuencia  de  ADN  que  corresponde  al  siNo  de  unión  
de  los  factores  de  transcripción  y  permite  la  iniciación  de  la  
transcripción.   12  
UNIDAD  TRANSCRIPCION  
PROCARIONTE.  

UNIDAD  TRANSCRIPCION  
EUCARIONTE.  

Secuencias    
“Enhancer”  

TFIID:  reconoce  secuencia  consenso  TATAAA  

TFIIB:  reconoce  secuencia  consenso  G/C  G/C  G/C  CGCC       13  
 Transcripción del ADN

ETAPAS:  
 
1) Inicio  de  la  transcripción  
 
2) Elongación  
 
3) Termino  

14  
 Transcripción del ADN

Iniciación

1.  La  ARN  polimerasa  se  une  a  

la  secuencia  promotora  en  la  
doble  hebra  de  ADN  
(Complejo  cerrado).  

2.  La  ARN  polimerasa  

denatura  la  doble  hebra  de  
ADN  cerca  del  siNo  de  inicio  
de  la  transcripción,  formando  
una  burbuja  de  transcripción  
(complejo  abierto)  

3.  La  ARN  polimerasa  cataliza  

la  unión  fosfodiester  de  dos  
ribonucleoNdos  (rNTPs)  
iniciales.  
15  
Elongación:
4. La ARN polimerasa avanza
en dirección 3’ a 5’ a través
de la hebra de ADN molde,
denaturando la doble hebra
de ADN y agregando
ribonucleotidos para generar
el ARN creciente en sentido
5’-3’.
Termino:
5. En el sitio de termino de la
transcripción, la ARN
polimerasa libera el ARN
completo y se separa del
ADN.

Secuencias    
de  Termino:            TAA  (UAA)      
                                         TAG  (UAG)  
                                                       TGA  (UGA)   16  
17  
 TRANSCRIPCION  EN  EUCARIONTES  
•  Comienza  la  transcripción  de  un  ADN  cuando  una  ARN  polimerasa  se  
encuentra  a  20  o  30  nucleó>dos  después  de  la  secuencia  TATA.  
 
•  Cuando   el   transcrito   ha   alcanzado   30   nucleó>dos   de   largo,   en   su  
extremo  5’  es  colocado  una  guanosina  unido  a  un  grupo  trifosfato  que  
además  es  me>lado  (7’  me>l  guanosina).    
 
•  La  ARN  polimerasa  se  mueve  a  lo  largo  del  ADN  transcribiendo  tanto  
exones  como  intrones.  Hasta  que  se  transcribe  la  secuencia  AAUAAA,  
después   de   cerca   de   20   nucléo>dos   de   esta   secuencia,   el   transcrito   es  
cortado.  
 
•  Una  enzima  (poli  A  Polimerasa;  PAP)  adiciona  una  secuencia  de  150  a  
200  adeninas  (poli  A)  en  el  extremo  3’  de  la  hebra  del  ARN  naciente.    
 
•  El   transcrito   es   procesado   y   son   cortados   los   intrones,   probablemente  
con   la   ayuda   de   otras   snRNPs;   y   nuevamente   U1   ARN   se   une   a   una  
secuencia   complementaria   (que   incluye   GU)   en   el   comienzo   del  
intron,  también  en  este  proceso  par>cipan  otras  6  moléculas  de  ARN  
(denominadas  U2,U3,...U7)    
 
18  
19  
 PROCESAMIENTO  DEL  ARN  MENSAJERO  
En   Eucariontes   los   transcritos   primarios   (pre-­‐ARNm)   generados  
durante   la   transcripción   deben   ser   procesados   en   el   núcleo   para  
formar   el   ARN   mensajero   que   será   exportado   al   citoplasma   donde  
ocurre  la  traducción.  

•   I)  Formación  de  casquete  5’.  

 
•   II)  Corte/poliadenilación  3’.  
 
•   III)  Corte  y  empalme  de  
ARN.  
20  
 I.  FORMACIÓN  DEL  CAPUCHON  5’.  

•    Capuchón   5’:     una   molécula   de   7-­‐me>l  

guanosina   protege   al   ARNm   de   la  
degradación   enzimáNca   y   contribuye   a   su  
desplazamiento  hacia  el  citoplasma.  
 
Enlace  5’-­‐5’  
El   capuchón   5’   es   añadido   a   la   molécula   trifosfato  
de  ARNm  nacientes  producidas  por  la  ARN  
polimerasa   II   cuando   alcanzan   una  
longitud  de  25-­‐30  nucleóNdos.  
 
Proceso   catalizado   por   una   enzima  
dimérica  formadora  del  casquete,  la  cual  
se  asocia  al  dominio  carboxilo  terminal  de  
la  ARN  polimerasa  II.  

21  
 II.  CORTE/POLIADENILACIÓN  3’.  

• Cola   de   poli   (A):   La   enzima   poli   Secuencias consenso en la poliadenilación

(A)   polimerasa   (PAP)   agrega   en   el   de pre-ARNm.
extremo   3’   una   serie   de   residuos  
de  ácido  adenilico  (nucleóNdos  de  
adenina).  
 
La   poliadenilación   es   un   proceso  
c o n s e r t a d o   e n t r e   c o r t e   y  
poliadenilación.    
 
Casi  todos  los  ARNm  conNenen  la  
secuencia   consenso   AAUAAA   de  
10-­‐35  nucleóNdos.  
Además   se   requiere   de   una  
segunda   secuencia   consenso   rica  
en   U   o   rica   en   GU   dentro   de   los  
50  nucleóNdos  del  siNo  de  corte  
Secuencias   consenso   conocidas  
como  señales  poli  A.   22  
 Reconocimiento  de  secuencias  consenso  y  corte  
1.  Formación  complejo  inestable  
entre  CPSF  y  la  señal  poli  (A)  
AAUAAA  en  dirección  5’.  
 
2.      CStF  se  une  al  complejo  CPSF-­‐RNA  
e  interactúa  con  la  secuencia  G/U.  
 
3.      Unión  de  poli  (A)  polimerasa  (PAP)  
al  complejo.  
 
4.      Corte  secuencia  G/U.  

CPSF:  Factor  de  especificidad  

de  corte  y  poliadenilación  

CStF:  Factor  esNmulante  de  corte  

CFI/II:  Factor  de  corte  

23  
 Poliadenilación  en  extremo  3’  (poli  A)  

•    La   PAP   adiciona   los   primeros  

12   residuos   de  Adenina,   la   cual  
se  lleva  a  cabo  con  lenNtud.  

•    Adición   rápida   de   otros  

200-­‐250   residuos   de   A,   la   cual  
requiere   la   unión   de   proteínas  
d e   u n i ó n   a   p o l i   ( A ) ,  
esNmulando   la   polimerización  
d e   r e s i d u o s   d e   a d e n i n a  
(poliadenilación  rápida)  

24  
 III.  CORTE  Y  EMPALME  DEL  ARNm  (SPLICING)  

Corte   interno   de   las   regiones  

intronicas,  seguido  por  la  ligación  de  
los  exones  codificadores.  
 
 
El   ARNm   funcional   producido   luego  
d e l   p r o c e s a m i e n t o   d e l   A R N  
mensajero   primario   manNene   las  
regiones   no   codificantes   de   cada  
extremo,   denominadas   regiones   no  
traducidas   5’   y   3’   (untranslated  
regions,  UTR).  
 
El   corte   y   empalme   se   lleva   a   cabo  
p o r   d o s   r e a c c i o n e s   d e  
transesterificación.  

25  
Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  5th  ediNon.New  York.  
 Si>os  de  corte  y  empalme  en  el  pre-­‐ARNm.  

Adenosina  (A)  invariable  en  

el  punto  de  ramificación.  

Secuencias  consenso  5’  GU  y  3’  AG  

26  
5  RNA  nucleares  pequeños  (snRNA)  ricos  en  Uracilo  (U),  parNcipan  en  el  corte  y  
empalme  de  los  pre-­‐mRNA.  

U1  y  U2  se  unen  

snRNA:  U1,  U2,  U4,  U5  y  U6.   al  pre-­‐ARNm.  
 
•    presentan  una  longitud  de  entre  
107  y  210  nucleóNdos.    
  Complejo  U1/U2/
• Se   asocian   con   6   a   10   parqculas   pre-­‐ARNm  se  une  al  
de   ribonucleoproteínas   nucleares   complejo  U4/U6/U5  
formando  el  
pequeñas  (snRNP)  en  el  núcleo  de  
empalmosoma.  
las  células  eucariontes.  

•    Los   cinco   snRNA/snRNP   se   unen  

al   pre-­‐ARNm   para   formar   el  
complejo   de   ribonucleoproteínas   Se  libera  U1  y  U4,  
dejando  el  
d e n o m i n a d o   e m p a l m o s o m a   empalmosoma  
(splicesome).   catalíNcamente  
acNvo  

27  
Empalmosoma  catalíNco  
media  la  primera  
transesterificación    (enlace  2’,
5’  fosfodiester).  

La  segunda  reacción  de  

transesterificación    liga  los  dos  
exones  en  un  enlace  3’,5’  
fosfodiester  y  libera  el  intrón  
asociado  a  las  snRNP.  

28  
El procesamiento alternativo (splicing alternativo)
da origen a diferentes proteínas.
Las  unidades  de  transcripción  complejas  producen  combinaciones  
alternaNvas  de  exones  expresados  a  parNr  de  una  región  de  ADN  
genómico.  

29  
30  
 EDICIÓN  DEL  ARN.  
Procesamiento  del  pre-­‐ARNm  en  el  cual  se  altera  la  secuencia  de  un  pre-­‐ARNm.  
De   esta   forma,   la   secuencia   del   ARN   maduro   difiere   de   los   exones   que   lo  
codifican  en  el  ADN  correspondiente.  
 
El  proceso  de  edición  de  ARN  altera  las  secuencias  del  pre-­‐ARNm.  
Ampliamente  difundida  en  mitocondrias  de  protozoos,  plantas  y  mamiferos,  así  
como  en  los  cloroplastos,  no  asi  en  procariontes  y  levaduras.  

31  
 TIPOS  DE  EDICION  DEL  ARN  

A)  Modificación  de  Bases  

(Deaminasa)  

A  a  I;  mecanismo  presente  

doble  hebra,  virus,  genes  
humanos.  
 
C  a  U,  U  a  C.  presente  en  
cloroplastos,  mitocondria  de  
plantas  y  genes  humanos.  

32  
32  
B)  Inserción/delección.  
 
Inserción/delección  de  U.  Presente  en  protozoos  
kinetoplasNdeos.  
 
Inserción/delección  mono/di  nucleó>dos.  
Presente  en  Fusarium  (hongos)  
 
Reemplazo  de  nucleó>dos.  Presente  en  tRNAs  de  
Acanthamoeba  (protozoos)  

33  
 REGULACION  DE  LA  EXPRESION  GENICA  

34  
Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  5th  ediNon.New  York.  
CONTROL  TRANSCRIPCIONAL    

Operador  

Regiones  cis,  son  secuencias  de  alrededor  de  4-­‐20  nucleóNdos  de  longitud.  
Algunos  son  repeNciones  inverNdas.     35  
En  procariontes  los  elementos  reguladores  cis,  se  encuentran  cercanos  
a   los   genes   y   en   la   vecindad   del   promotor.   En   eucariontes   los  
elementos  reguladores  cis  se  encuentran  localizados  cientos  de  bases  
de   los   genes   y   el   promotor.   También   Nene   secuencias   reguladoras  
próximas.    
Distantes:   enhancers   y   silencers.   Que   esNmulan   o   reprimen   la  
expresión.  

36  
• PROMOTOR:  Secuencia  de  ADN  que  determina  el  siNo  de  iniciación  de  la  transcripción.  

• OPERADOR:  Secuencia  de  ADN  corta  a  la  cual  se  une  una  proteína  que  controla  la  transcripción  
de  un  gen.  

• OPERON:  Grupo  de  genes  estructurales  transcritos  juntos    que  dan  origen  a  un  único  ARNm  
maduro.  

lacI  

Operon  Lac:  tres  genes  para  el  metabolismo  de  la  lactosa.  LacZ  (beta  
galactosidasa),  LacY  (lactosa  permeasa);  LacA  (Nogalactosido  
transaceNlasa).  Gen  LacI,  expresa  el  represor  lac.    
37  
38  
 INDUCCION:  (Operon  lac)  

• INDUCTOR:  Molecula  que  al  estar  presente  esNmula  la  

transcripción  de  un  gen.   39  
39  
REPRESION:  (Operon  arginina)  

REPRESOR:  Factor  de   un  co-­‐represor  se  une  a  un  represor  de  tal  
transcripción  de   manera  de  que  apaga  la  transcripción  
función  inhibitoria.   (expresión  de  la  enzima).  Es  un  Ej  de  control  
negaNvo.   40  
ACTIVACION:  (Operon  maltosa)  

• ACTIVADOR:  Proteína  de  unión  al  ADN  que  se  une  a  la  ARN  Polimerasa  
para  acNvar  la  transcripción  del  gen  asociado.  
41  
41  
CONTROL  EPIGENETICO  DE  
LA  EXPRESION  GENICA  
1)  Modificación  de  histonas  

2)  MeNlación  del  ADN  

3)  Silenciamiento  génico  

por  ARN  anNsenNdos  y  
microARN.  

Modificaciones   de   la   histonas   afectan  

la  acNvidad  de  las  proteínas  asociadas  
a   la   cromaNna   y   factores   de  
t r a n s c r i p c i ó n   a u m e n t a n d o   o  
disminuyendo  la  expresión  génica  
M o d i fi c a c i o n e s :   m e N l a c i ó n ,  
fosforilación,   ubiquiNnación,   y  
aceNlación  

42  
ARN  de  interferencia    

•  Mecanismo  de  regulación  génica  post-­‐transcripcional.  

 
•  Contempla  el  silenciamiento  de  la  expresión  de  un  gen,  
mediante   la   degradación   del   ARN   mensajero   y/o   el  
arresto  de  la  traducción  de  un  gen.    
 
•  El   silenciamiento   es   inducido   por   pequeños   ARN   de  
doble   hebra   (dhARN)   en   una   forma   secuencia  
específica.    
 
•  Todas  las  vías  de  silenciamiento  de  ARN  están  asociadas  
con  pequeños  ARNs  de  alrededor  de  20-­‐30  nucleóNdos  
de   longitud   que   funcionan   como   factores   específicos  
para   la   inacNvación   de   secuencias   homólogas   en   una  
amplia  variedad  de  organismos.  
  43  43  
Funciones  del  ARN  interferencia:    
 
•  Procesos   de   ARNi,   incluyen   mecanismos   que  
silencian  genes  endógenos  y  mecanismos  que  evitan  
la   expresión   de   ARNm   de   virus   y   transposones  
(elementos   genéNcos   móviles)   de   parásitos   y  
patógenos  celulares.    
 
•  Regulación  del  desarrollo  de  células  germinaNvas  
 
•  Mecanismo   ancestral   de   inmunidad   contra   virus   (en  
plantas)  
 
•  Formación   de   heterocromaNna   en   levaduras   y  
plantas.    

44  
 MECANISMO  SILENCIAMIENTO  MEDIANTE  PEQUEÑOS  ARN  
REGULADORES.  
1)  Un  largo  ARN  de  doble  hebra  expresado  endógenamente  o  introducido  
externamente  a  la  célula,  es  procesado  a  pequeños  ARN  de  doble  hebra  
por  acción  de  la  ribonucleasa  III  (Rnasa  III)  conocida  como  Dicer.    

2)  Los   ARN   pequeños   de   doble   hebra,   son   abiertos   por   una   helicasa,  
generando  dos  ARN  de  hebra  simple,  donde  una  de  ellas  es  introducida  
en   un   complejo   proteico   conocido   como   el   Complejo   de   Silenciamiento  
Inducido  por  ARN  (RISC;  RNA-­‐Induced  Silencing  Complex)    

3)  Este   complejo   busca   en   el   transcriptoma   (ARNm)   y   encuentra  

potenciales   blancos.   La   hebra   simple   de   ARN   cargada   en   el   complejo  
RISC,   es   conocida   como   la   hebra   guía,   la   cual   dirige   a   una   endonucleasa  
presente   en   RISC   (conocida   como   “Slicer”   o   proteínas   de   la   familia  
Argonauta   8-­‐11)   para   cortar   el   ARN   mensajero   que   conNene   la  
secuencia   homóloga   al   microARN   o   siARN.   La   hebra   guía   es   la   que  
determina   la   especificidad   de   secuencia   de   la   respuesta   de   ARN  
interferencia.     45  
Clases  de  pequeños  ARN  reguladores  

46  
1)  Pequeños  ARN  de  interferencia  (Short  Interfering  RNAs;  siRNA)  

RISC:  RNA-­‐Induced  
Silencing  Complex    

TRBP:  TAR  RNA  binding  

protein  

47  
2)  microRNAs  (miRNAs)  

48  
3)  PIWI-­‐Interac>ng  RNAs  (piRNAs).  

49  
50  
MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  Biología  
Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  4:  Mecanismos  de  regulación  de  la  
expresión  génica