DIPLOMADO

 EN  DIAGNOSTICO  MOLECULAR    

EN  EL  LABORATORIO  CLINICO    

MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  

Biología  Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  3:  Replicación  del  ADN,  mutaciones  y  
mecanismos  de  reparación  del  ADN.  

Dr.  Alejandro  Catalán    

alejandro.catalan@uantof.cl  
Departamento  de  Tecnología  Médica  
Facultad  de  Ciencias  de  la  Salud  
Universidad  de  Antofagasta    
 Replicación  del  ADN    

Proceso    mediante  el  cual  la  información  contenida  en  una  

hebra   de   ADN   es   duplicada   y   transmi>da   a   una   nueva  
generación.    

Aspectos  claves  de  la  replicación:  

 
1.  La  replicación  de  las  dos  hebras  de  ADN  molde  en  todos  
los  organismos  es  semiconserva>va.  
2.  El   inicio   de   la   replicación   en   secuencias   específicas  
conocidas  como  inicio  (Si>o  Ori).  
3.  El   movimiento   de   la   horquilla   de   replicación   es  
bidireccional.  
4.  La   dirección   de   la   replicación   ocurre   siempre   en   el  
sen>do  5’  –  3’.  
5.  La   replicación   ocurre   de   forma   semidiscon>nuada,   una  
hebra  conQnua  y  otra  disconQnua.  
 La replicación del ADN es Semi-Conservativa
•  Conserva>va:  
Las   dos   hebras   hijas   forman   una   nueva   molécula   de   ADN   de   doble  
hebra.  
•  Semiconserva>va:  
Las   hebras   parenterales   se   encuentran   separadas   y   cada   una   forma  
una  molécula  dúplex  con  una  hebra  hija.    
2014  Nature  Educa>on  Adapted  from  Pierce,  Benjamin.  Gene>cs:  A  Conceptual  Approach,  2nd  ed.  
Experimento  
de  Meselson  y  
Stahl  

(Meselson  and  Stahl,  1958.  P.N.A.S;  44:  671-­‐682)  

La  ADN  Polimerasa  es  la  enzima  encargada  de  la  replicación  del  ADN    
Arthur  Kornberg  (1956),  descubre  la  ADN  polimerasa.    
La  ADN  polimerasa  requiere:  
 
•  Templado  (ADN  doble  hebra)  
•  DesoxinucleóQdos  trifosfatos  (dNTPs)  
•  Cofactor  (Mg+2)  
•  ParQdor  (primer)    
 
 

La   ADN   polimerasa   solo   incorpora  

nucleóQdos  en  el  extremo  3’  de  la  hebra  en  
síntesis.  El  OH  3’  es  entregado  por  el  ulQmo  
nucleóQdo  del  parQdor.      
 
La  dirección  de  síntesis  de  la  nueva  hebra  es  
siempre  en  sen>do  5’-­‐3’  
 La  replicación  del  ADN  es  Semi-­‐discon>nua  
OK,  el  ADN  se  replica  de  forma  semiconservaQva  y  uQliza  una  ADN  
polimerasa  para  la  síntesis  de  la  nueva  hebra.  
 
Sin  embargo,  ¿la  replicación  de  ambas  hebras  del  ADN  ocurre  de  la  
misma  manera???  

Replicación  conQnua  de  ambas  hebras.      

¿Es  correcta  esta  figura  sobre  el  mecanismo  de  replicación  
del  ADN?  
Experimento  de  
Okazaki.    

Fragmentos   Fragmentos  
pequeños   grandes  

Okasaki  et  al.,  1968.    PNAS;  59  

(2):  598-­‐605  
Fragmentos   cortos   de   ADN   serian   sinteQzados   en   el   senQdo   5’-­‐3’   solo   en  
Qempos   cortos,   y   luego   aparecen   fragmentos   largos,   lo   que   demuestra   que  
una   hebra   forma   solo   fragmentos   largos   (conQnuos)   mientras   que   la   otra  
forma   fragmentos   cortos   que   luego   son   unidos   por   enlaces   fosfodiester  
(disconQnuo)  
 Hebra  líder    (conQnua)  

Horquilla  de  replicación    

Hebra  retardada  (disconQnua)  

Reiji  Okazaki  (1960)  

La  replicación  del  ADN  se  inicia  desde  un  siQo  denominado  Si>o  de  origen  (Ori)  

Horquilla  de  
replicación  

Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  5th  ediQon.  New  York.  
Si>o   ori:   región   del   ADN   templado   rico   en   residuos   de   AT,   desde  
donde  da  inicio  la  replicación  del  ADN.    
 La  replicación  del  ADN  es  BIDIRECCIONAL    

La  burbuja  de  replicación  

presenta  dos  horquillas  de  
replicación,  que  avanzan  en  
senQdos  opuestos    

Molecular  Biology  of  the  Cell.  4th  ediQon.  Alberts  B,  Johnson  A,  Lewis  J,  et  al.  New  York:  Garland  Science;  2002.  
MAQUINARIA  PROTEICA  DE  LA  REPLICACIÓN     ADN  Polimerasa  de  hebra  guía  
ADN  Polimerasa  de  hebra  
retardada  
ADN  Primasa  
Proteínas  de  unión  al  ssDNA  
ADN  helicasa  
Proteínas  accesorias  a  Pol.  

Alberts,  B.  DNA  replicaQon  and  recombinaQon.  Nature.  2003;  421:  431-­‐435  
 ADN  POLIMERASA  
•   La  ADN  polimerasa  es  la  encargada  de  la  replicación  del  ADN.  
•    Requiere   de   una   hebra   de   ADN   o   ARN   preexistente   como   molde,   denominada  
Cebador  (par>dor  o  primer).  
•   La  ADN  polimerasa  adiciona  deoxinucleóQdos  al  grupo  hidroxilo  libre  del  extremo  
3’  de  un  cebador.  Dirección  5’-­‐  3’.  
•   La  síntesis  genera  una  hebra  guía  y  una  hebra  rezagada.  

Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  5th  ediQon.New  York.  
ADN  Polimerasas  Bacterianas  
ADN  Polimerasas  eucariontes  
Molecular  Biology  of  the  Cell.  4th  ediQon.  Alberts  B,  Johnson  A,  Lewis  J,  et  al.  New  York:  Garland  Science;  2002.  
Mecanismo de acción de la ADN polimerasa

Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  7th  ediQon.New  York.  
 PROCESO  DE  REPLICACIÓN  DEL  ADN  

Etapas:  
 
1)   Iniciación  y  desenrrollamiento  del  ADN  
 
2)   Síntesis  del  primer  o  par>dor  
 
3)   Elongación  
 
 REPLICACION  ADN:  INICIACION  y  DESENROLLAMIENTO  
Replicación   inicia   en   los  
siQos   de   origen   de   la  
r e p l i c a c i ó n   ( o r i ) .  
Reconocidos   por   proteína  
i n i c i a d o r a s   ( A d n A   e n  
b a c t e r i a s ,   O R C   e n  
e u c a r i o n t e s ) ,   g a Q l l a  
desenrrolamiento  de  ADN  

Complejo   Helicasa   se  
encarga   de   denaturar   la  
doble   hebra   de   ADN   y  
formar   la   burbuja   de  
replicación.  
Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  7th  ediQon.New  York.  
 Modelo  Replicon    

ORC:  Origin  
recogniQon  
complex)    

Proteínas   iniciadoras   reconocen   el   origen   de   la   replicación   para   ensamblar   el   complejo   de  

pre-­‐iniciación  requerido  para  desenrollar  el  ADN  y  permiQr  la  unión  de  las  ADN  helicasas.    
Iniciadores   eucariontes   se   encuentran   pre-­‐ensamblado   en   un   Complejo   de   Reconocimiento  
de  Origen  hexamerico  (ORC).    
En  procariontes  parQcipan  iniciadores  únicos  (Arquea:  Orc1/Cdc6;  bacteria:  DnaA)  se  unen  al  
siQo  de  reconocimiento  y  luego  se  ensamblan  en  complejos  en  el  ADN.  
Luego  las  ADN  helicasas  (Mcm  o  DnaB)  son  reclutadas  al  siQo  de  origen  y  se  unen  a  una  de  las  
hebras  de  ADN     Leonard  and  Méchali.  Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol.  2013;  5:a010116  
 •  Proteínas  de  iniciación  DnaA  
reconocen  el  siQo  de  origen  oriC.  
•  DnaA  uQliza  ATP  para  
desestabilizar    las  repeQciones  
ricas  en  AT  del  siQo  de  origen.      
•  Helicasa  DnaB  (homohexámero)  
en  forma  de  anillo  rodea  el  ADN  
de  la  hebra  retardada.    
•  Dos  DnaB  se  ensamblan  en  la  
región  del  oriC  desenrollado  por  la  
DnaA.  

•  En  eucarionte.  Complejo  
reconocimiento  de  origen  (ORC)  
reconoce  el  siQo  de  origen.    
•  Helicasas  MCM  (mantenimiento  
minicromosoma),  es  un  
heterohexámero  formado  por  seis  
MCM.    
•  Cdc6  es  requerido  para  la  
asociación  de  MCM  al  siQo  de  
origen.  
Davey  and  O’Donnell.  Current  Opinion  in  Chemical  Biology.  2000;  4:581-­‐586  
REPLICACIÓN  DEL  ADN:  SINTESIS  PRIMER  Y  ELONGACION.  
La   replicación   se   inicia   una   vez  
q u e   l a   A D N   p o l i m e r a s a  
reconoce   al   ParQdor   y   adiciona  
los   desoxinucleoQdos   (dNTPs)  
de  forma  bidireccional.    

U n a   d e   l a s   h e b r a s  
corresponde   a   la   hebra   guía  
que   se   sinteQza   en   un   senQdo,  
mientras   que   la   otra   es   una  
hebra   retardada   que   se  
sinteQza  en  senQdo  opuesto.  
Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  
7th  ediQon.New  York.  
 En  la  hebra  guía  el  factor  de  
replicación  C  (RFC)  se  une  al  
A D N   y   p e r m i t e   e l  
reclutamiento   y   unión   del  
anillo   del   anugeno   nuclear  
de   proliferación   celular  
(PCNA;   ProliferaQng   Cell  
Nuclear   Factor)   al   parQdor  
y   de   la   ADN   pol   ε   para  
iniciar  la  síntesis  conQnua.    

En  la  hebra  retardada,  la  ADN  Pol  α  (Primasa)  sinteQza  el  parQdor.  Se  manQene  unida  al  ADN  gracias  a  las  
proteínas  de  unión  al  ADN  de  hebra  simple  (RPA;  ReplicaQon  Protein  A).  RFC  desplaza  a  la  ADN  Pol  α  en  
la  hebra  retardada  al  compeQr  con  esta  por  la  unión  a  RPA,  y  así  se  libera  Pol  α  del  ADN,  generando  el  
cambio  desde  el  modo  “primer”  al  modo  “elongación”.  El  parQdor  iniciador  es  extendido  por  el  complejo  
PCNA/DNA  pol  δ  para  formar  los  fragmentos  de  Okazaki.    
Balakrishnan  and  Bambara.  Cold  Spring  Harb  Perspect  Biol.  2013;  5:a010173  
Davey  and  O’Donnell.  Current  Opinion  in  
Chemical  Biology.  2000;  4:581-­‐586  
 Síntesis  hebra  guía  es  copiada  
de  forma  con>nua.  

Síntesis  hebra  retardada,  es  copiada  

discon>nuamente,   uQlizando   varios  
p a r Q d o r e s ,   f o r m a n d o   l o s  
fragmentos   de   Okazaki.   Aunque   la  
síntesis   es   en   senQdo   contrario,   la  
hebra   es   sinteQzada   en   senQdo  
5’-­‐3’.  

Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  
7th  ediQon.New  York.  
 En   la   medida   que   progresa   la  
r e p l i c a c i ó n   d e   l a   h e b r a  
retardada,   el   ARN   del   parQdor  
del  primer  fragmento  de  Okazaki  
es  reemplazado  por  ADN.  

Los   diferentes   fragmentos   de  

Okazaki   son   ligados   entre   ellos  
por  la  ADN  Ligasa.  

Lodish  H,  Berk  A,  Zipursky  SL,  et  al.  Molecular  Cell  Biology.  7th  ediQon.New  York.  
 MUTACIONES    

Una  mutación  es  un  cambio  permanente  en  la  

secuencia  del  ADN.  
 
Tipos  de  mutaciones:    
 
1).  SusQtución  de  bases  
 
2)  Delecciones    
 
3)  Inserciones  
Sus>tuciones  de  bases:    
 
Corresponde   a   la   susQtución   de   una   única   base   y   también  
conocidas  como  mutaciones  puntuales.  Son  las  mutaciones    más  
comunes  y  existen  de  dos  Qpos:    
 
•  Transición:   Ocurre   cuando   una   purina   es   susQtuida   por   otra  
purina   o   cuando   una   pirimidina   es   susQtuida   por   otra  
pirimidina.    
 
•  Transversión:   Cuando   una   purina   es   susQtuida   por   una  
pirimidina  o  una  pirimidina  reemplaza  a  una  purina.    
Dependiendo  si  la  mutación  puntual  afecta  a  una  secuencia  
que  conQene  un  gen:    
 
•  Silente  
•  Mal  senQdo  
•  Sin  senQdo  
Delecciones:  
Produce   un   cambio   en   la   fase   de   lectura,   resultando   en   la  
pérdida  de  una  o  más  pares  de  bases  en  el  DNA.  Por  lo  tanto,  
el  producto  de  la  traducción  es  una  proteína  no  funcional.    
 
Inserciones:    
Es  la  suma  de  un  par  de  bases  que  puede  llevar  a  un  cambio  
en   la   fase   de   lectura   dependiendo   del   número   de   bases  
insertadas.    
Loeb  L.A.  Nature  Reviews  Cancer  11,  450-­‐457.  2011  
 MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN

MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN

•  Existen  en  procariontes  y  eucariontes.  
 
•  Las   células   han   evolucionado   para     generar   mecanismos   de  
detección  y  reparación  de  varios  Qpos  de  daño  que  puedan  
ocurrir  en  el  ADN.  
 
•  Estos  mecanismos  están  localizados  durante  el  ciclo  celular,  
cuando   la   replicación   del   ADN   se   lleva   a   cabo   (Fase   S).  
Denominados   mecanismos   de   Checkpoint.   Aseguran   que   la  
célula   se   encuentre   intacta   antes   de   conQnuar   con   el   ciclo  
celular.    
 
•  Cuando   estos   mecanismos   de   checkpoint   fallan,   ocurren  
alteraciones  del  ADN,  ya  sea  por  falla  durante  la  replicación  
o  daño  externo.  

•  En  estos  casos  parQcipan  los  mecanismos  de  reparación  del  

ADN.  
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN
En  células  eucariontes,  se  conocen  5  mecanismos  de  
reparación  del  ADN:  

1)  Reparación  durante  la  replicación  del  ADN,  acQvidad  

proofreading  de  las  ADN  polimerasas.    

2)  Reparación  de  mal  apareamiento  de  bases  (Mismatch  

repair  ;  MMR)  
 
3)        Reparación  por  escisión  de  nucleó>dos  (NucleoQde  
Excision  Repair;  NER)  
 
4)      Reparación  por  escisión  de  bases  (Base  NucleoQde  Repair;  
BER)  
 
5)  Reparación  de  Roturas  de  la  Doble  Hebra.  
•  Unión  terminal  no  Homologa  (NHEJ)  
•  Recombinación  Homologa  (HR)  
MECANISMO  DE  REPARACION  DE  MAL  APAREAMIENTO  DE  BASES  
(MMR)  

Errores   comeQdos   durante   la   replicación   son  

corregidos   inmediatamente   por   la   ADN   polimerasa,  
gracias   a   su   acQvidad   “proofreading”   (acQvidad   de  
exonucleasa).    
 
La   ADN   polimerasa   reconoce   estos   errores   y  
reemplaza  el  nucleóQdo  incorrecto  por  uno  correcto,  
de  tal  manera  que  la  replicación  puede  conQnuar.    
 
El  mecanismo  proofreading  resuelve  cerca  del  99%  de  
los  errores  durante  la  replicación.    
Incorrecto apareamiento de nucleótidos causa deformidad en la
estructura secundaria del ADN
 Corrección de mal incorporación de bases.

Actividad
exonucleasa
3’-5’
(proofreading)

Figure  5.13  Proofreading  by  DNA  polymerase  

Proofreading: corrección de prueba

Cooper  GM.  The  Cell:  A  Molecular  Approach.  2nd  ediQon.  
MECANISMO  DE  REPARACION  DE  MAL  APAREAMIENTO  DE  
BASES  (MMR)  

Si la reparación del mal apareamiento de bases no es

corregido durante la replicación, entonces el
mecanismo de Mal Apareamiento de Bases;
Mismatch Repair (MMR), es el encargado de
solucionarlo. Proceso altamente conservado en
procariontes y eucariontes.

Pasos:

1)  Reconocimiento de mal apareamiento de bases.

2)  Corte de la región de ADN que contiene el error.

3)  Reparación del ADN por una ADN Polimerasa de

reparación
REPARACION  DE  MAL  APAREAMIENTO  DE  BASES  (MMR)  
MutS  (mutator   Formación  complejo  
S)  reconoce   de  corte  
error  en  el  ADN   (heteroduplex  MutS-­‐
MutL-­‐DNA)  
Intercambio de
MutH por UvrD
(helicasa,
desenrrolla el
ADN) MutH mantiene
unido al
complejo, dobla
el ADN.
Reconoce sitio
complejo  MutS-­‐ consenso GATC
DNA  (complejo   y corta el ADN
reconocimiento),  
permite  el  
reclutamiento  de  
MutL  
Exonucleasas
degradan el ADN
Reparación  
daño  ADN  
causado  por  
UV  

Hoeijmakers. N Engl J Med. 2009; 361: 1475-85

DAÑO  DEL  ADN  CAUSADO  POR  RADIACIÓN  UV  
A) Formación de dímeros de ciclobutano-pirimidina por
radiación UV.
Dímero
Timina-
Timina

Dímero
Timina-
Citosina

Clancy,  S.  (2008)  DNA  damage  &  repair:  mechanisms  for  maintaining  DNA  integrity.  Nature  Educa>on  1(1):
103  
B) Formación de fotoproductos 6-4 pirimidona.

Fotoproductos 6-4 pirimidona son uniones covalentes entre

dos pirimidinas. Radicación UV causa distorsión del ADN
(dobleces o torceduras) impidiendo la transcripción y la
replicación

Nature  EducaQon.  Adapted  from  Pierce,  Benjamin.  GeneQcs:  A  Conceptual  Approach,  2nd  ed.  
 REPARACION DEL DAÑO DEL ADN CAUSADO POR
RADIACION UV
A)  REPARACION  POR  ESCISION  DE  NUCLEOTIDOS  (NER).  

En  eucariontes  el  mecanismo  involucra  un  complejo  de  al  menos  18  
proteínas.  
En  procariontes,  el  mecanismo  involucra  solo  a  tres  proteínas  (UvrA,  
UvrB,  y  UvrC).  
 
Pasos:  
 
1)  Detección  del  daño  al  ADN.  
 
2)  Corte  de  la  sección  del  ADN  que  incluye  y  rodea  al  error.  
 
3)  Relleno  de  los  espacios  por  parte  de  una  ADN  polimerasa  
(eucariontes:  ADN  pol  β;  procariontes:  ADN  pol  I).  
 
4)  Sellado  del  nuevo  ADN  sinteQzado  y  el  viejo  ADN  por  una  ADN  
ligasa.    
 Reparación  
daño  ADN  
causado  por  
ROS  

Hoeijmakers. N Engl J Med. 2009; 361: 1475-85

 MECANISMO  DE  REPARACION  POR  ESCISION  DE  BASES  
(BER)  

Mecanismo   predominante   en   la   reparación   de   daño   al   ADN  

por   causa   de   daño   oxida>vo   causado   por   radicales   libres   y  
especies   reacQvas   del   oxígeno   (ROS)   (O2-­‐,   H2O2,   ŸOH-­‐),  
producidas  durante  el  metabolismo  celular.    
 
•  ParQcipan   las   ADN   glicosilasas,   las   cuales   remueven   las  
bases   dañadas,   al   romper   el   enlace   N-­‐glicosidico   entre   la  
base  nitrogenada  y  el  esqueleto  desoxiribosa-­‐fosfato.    

•  La   base   es   reQrada,   dejando   un   siQo   apurinico/

apirimidinico  o  siQo  AP  (SiQo  abasico),  el  cual  es  reQrado  de  
la  hebra  de  ADN  por  una  endonucleasa  AP.    
 
•  La   base   faltante   es   agregada   por   una   ADN   polimerasa  
especializada   en   reparación   (ADN   pol   β)   y   sellada   por   una  
ADN  ligasa.    
Reparación
rotura de
doble hebra
ADN

Hoeijmakers. N Engl J Med. 2009; 361: 1475-85

Reparación de roturas de la doble hebra de ADN, las
cuales son causadas por radiación ionizante, como los
rayos gamma y los rayos X.

A) Unión terminal no homologa (NHEJ).

Una enzima denominada ADN ligasa tipo IV, reconoce
las piezas colgantes de ADN adyacente a la rotura y
la rellena en los extremos.

B) Reparación por recombinación homologa

(HRR)

Se utiliza un cromosoma homologo como templado

para la reparación. Utiliza las cromátidas hermanas no
dañadas.
MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  Biología  
Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  3:  Replicación  del  ADN,  mutaciones  y  
mecanismos  de  reparación  del  ADN.