DIPLOMADO

 EN  DIAGNOSTICO  MOLECULAR    

EN  EL  LABORATORIO  CLINICO    

MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  

Biología  Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  1:  Estructura  y  función  de  los  ácidos  
nucleicos;  Organización  del  genoma  
procarionte  y  eucarionte.  

Dr.  Alejandro  Catalán    

alejandro.catalan@uantof.cl  
Departamento  de  Tecnología  Médica  
Facultad  de  Ciencias  de  la  Salud  
Universidad  de  Antofagasta    
 Descubrimiento  del  ADN    

•  Friedrich   Miescher,   en   1869,   aisló   e   idenMficó   a   parMr   de  

leucocitos   (en   tejido   linfoide),   una   sustancia   ácida   rica   en  
fósforo   purificada   desde   el   núcleo,   que   llamó   “nucleína”.  
Esta   molécula   es   las   que   posteriormente   serían   conocidas  
como  “ácidos  nucleicos”.    

•  Phoebus   Levene,   en   1919,   purificó   y   caracterizó  

químicamente   a   los   nucleóMdos   y   sus   componentes  
principales   (fosfato-­‐azúcar-­‐base),   a   parMr   de   aislados   de  
núcleo  de  levaduras.  Para  esto  hidrolizó  los  ácidos  nucleicos  
con   NaOH   (parMcularmente   el   ARN,   puesto   que   el   ADN   es  
resistente),   idenMficando   los   nucleosidos   de   ácido  
adenosinfosforico   (AMP),   ácido   guanosinfosforico   (GMP),  
ácido   ciMdinfosforico   (CMP),   y   ácido   uridinfosforico   (UMP).  
Además,   fue   el   primero   en   descubrir   que   el   carbohidrato  
que   forma   el   ARN   es   la   ribosa   y   el   que   forma   el   ADN   es   la  
desoxiribosa.  Propuso  la  estructura  de  polinucleoMdos.  
 
 ESTRUCTURA  DE  LOS  ACIDOS  NUCLEICOS    

1.  El  ADN  y  el  ARN  son  largos  polímeros    lineales  

2.  Esqueleto  de  azúcar  de  5  carbonos  y  fosfato  
alternados.  
3.  Unión  lateral  al  azúcar  de  una  base  nitrogenada.    
4.  Formados  por  monómeros  de  nucleóMdos    

Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    

 ¿  Cuál  es  el  carbohidrato  que  forma  parte  de  los  ácidos  
nucleicos?  

Pentosa:  carbohidrato  de  5  carbonos.    

Desoxiribosa   Ribosa  
   
ADN     ARN    

Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    

¿  Cuáles  son  las  bases  nitrogenadas  que  forman  parte  de  los  
ácidos  nucleicos?  

DNA:    
 
•   Adenina  
•   Guanina  
•   Citosina  
•   Timina  
 
 
 
RNA:  
 
•   Adenina  
•   Guanina  
•   Citosina  
•   Uracilo  

Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    

 NUCLEOTIDOS    

Pray,  L.  (2008)  Discovery  of  DNA  structure  and  funcMon:  Watson  and  Crick.  Nature  EducaMon  1(1):100  
 FORMACIÓN  DE  UN  NUCLEOTIDO    

Enlace  
Enlace   glicosidico  
fosfoester  

Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  gene.  7  Ed.    

Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    
Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  gene.  7  Ed.    
Las  reglas  de  Chargaff  y  el  apareamiento  de  bases  nitrogenadas    
Erwin   Chargaff,   1950,   se   propuso   comparar   diferentes  
especies   con   la   finalidad   de   determinar   si   existen   diferencias  
en  la  canMdad  de  ADN  entre  una  especie  y  otra.    
 
•  La   composición   de   nucléoMdos   del   ADN   no   varia   entre  
especies.    
•  En   casi   todos   los   ADN   sin   importar   el   organismo   de   donde  
fue   obtenido,   la   canMdad   de   Adenina   (A)   es   similar   a   la  
canMdad   de   Timina   (T),   y   la   canMdad   de   Guanina   (G)   es  
similar  a  la  canMdad  de  Citosina  (C).  
•  Así,  el  total  de  purinas  (A+G)  y  el  total  de  pirimidinas  (C+T)  
son  usualmente  iguales.      
 Estructura  de  doble  hélice  del  ADN  
Los estudios de cristalografía de rayos X realizados por Rosalind
Franklin and Maurice Wilkins, sumado a las reglas de Chargaff fueron
claves para el diseño de la estructura tridimensional del ADN.

¡El ADN tiene estructura helicoidal!, con una periodicidad a 3.4

nm y 0.34 nm de distancia entre pares de bases. R. E. Franklin
sugiere que el eje ribosa-fosfato está hacia fuera y las bases
hacia dentro.
Igualmente sugiere que se trata de una doble hélice y no triple.

Foto  51  
Modelo  tridimensional  del  ADN  de  Watson  y  Crick  (1953)  
El  modelo  propuesto:    
 
•  El   ADN   Mene   una   estructura   de   doble   hebra   en   hélice,  
con   las   dos   hebras   conectadas   por   enlaces   de  
hidrógeno.   La   base   nitrogenada   A   siempre   se   aparea  
con   T,   y   C   siempre   se   aparea   con   G,   lo   que   es  
consistente   con   las   reglas   de   Chargaff.   Las   bases   están  
dispuestas  hacia  el  interior  de  la  estructura.  
•  Muchas  dobles  hélices  de  ADN  Menen  giro  a  la  derecha  
(mano   derecha),   que   es   con   el   pulgar   de   su   mano  
derecha   apuntando   hacia   arriba   y   los   dedos   cerrado  
hacia   el   pulgar.   El   pulgar   representa   el   eje   de   la   hélice   y  
los  dedos  el  esqueleto  de  azúcar  y  fosfato.      
•  La   doble   hélice   del   ADN   es   anMparalela,   donde   el  
extremo  5’  de  una  hebra  se  parea  con  el  extremo  3’  de  
su  hebra  complementaria  (y  viceversa).    
Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    
Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  gene.  7  Ed.    
Pray,  L.  (2008)  Discovery  of  DNA  structure  and  funcMon:  Watson  and  Crick.  Nature  EducaMon  1(1):100  
 Variación  en  el  apareamiento  de  bases  de  Hoogsteen    
Las   bases   nitrogenadas   pueden   aparearse   entre   si   (A-­‐T   y   G-­‐C)   mediante  
una   geometría   diferente   (por   rotación   de   las   purinas)   a   la   descrita   por  
Watson   y   Crick,   formando   un   patrón   diferente   en   los   enlaces   hidrógeno,  
donde   G-­‐C   podría   presentar   dos   enlaces   de   hidrógeno   en   vez   de   los  
tradicionales  3  enlaces  de  hidrógeno.  Esto  afectará  la  forma  de  la  hélice  de  
ADN.    

Travers  and  Muskhelishvili.  DNA  structure  and  funcMon.  2015.  FEBS  journal.282:2279-­‐2295.  
 Diferentes  conformaciones  del  ADN  de  doble  hebra  

La  geometría  y  dimensiones  de  la  doble  hélice  de  ADN  pueden  

variar.    
Es  así  como  la  conformación  más  común  en  células  vivientes  
(mostrada  en  el  modelo  de  Watson  y  Crick),  corresponde  a  la  
forma  B-­‐DNA.    
 
Otras  conformaciones:    
 
A-­‐DNA:   Una   forma   más   corta   y   más   ancha   que   se   ha  
encontrado  en  muestras  deshidratadas  de  ADN  y  rara  vez  en  
circunstancias  fisiológicas  normales.  
 
Z-­‐   DNA:   Corresponde   a   una   conformación   del   ADN   con   giro  
hacia  la  izquierda.  Es  una  forma  transitoria  del  ADN  que  solo  
existe   ocasionalmente   en   respuesta   a   ciertos   Mpos   de  
acMvidad  biológica.  Se  sugiere  que  cumple  un  papel  biológico  
importante  en  la  protección  contra  enfermedades  virales.    
 
Pray,  L.  (2008)  Discovery  of  DNA  structure  and  funcMon:  Watson  and  Crick.  Nature  EducaMon  1(1):100  
Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  gene.  7  Ed.    
 Estructuras  alterna>vas  del  ADN  
•  Burbujas   en   la   doble   hélice:   como   las   burbujas   que   se   forman   durante   el   proceso   de  
replicación  del  ADN.  

•  Estructuras   cruciformes:   Pueden   formarse   por   complementariedad   de   repeMciones  

inverMdas   (palíndromos)   de   segmentos   de   polipurinas   o   polipirimidinas.   También   se  
puede  observar  durante  la  recombinación  (estructuras  Holliday).    

•  Estructuras  en  bucle  deslizado  (slipped  loop)  

•  H-­‐DNA:   Estructura   formada   por   tres   hebras   de   hélice.   Puede   formarse     por   la   unión   de  
repeMciones   inverMdas   de   fragmentos   de   polipurinas/polipirimodinas   al   interactuar   con  
una  hebra  monocatenaria  de  ADN.  Papel  durante  la  regulación  de  la  expresión  génica.    

•  G-­‐cuádruples:    En  hebras  con  regiones  ricas  en  G.  Las  cuatro  hebras  se  conectan  a  través  
de   guaninas   por   apareamiento   Mpo   Hoogsteen,   formando   una   estructura   altamente  
estable.   Se   puede   encontrar   en   regiones   promotoras   de   genes   y   en   los   telómeros.  
Tendrían  una  función  como  elementos  reguladores.    

•  i-­‐mo>f  (i-­‐tetraplex):  En  hebras  con  regiones  ricas  en  C.  Cuatro  hebras  de  ADN  se  unen  a  
través  de  intercalación  de  pares  de  bases  de  citosina-­‐citosina.  Dos  dúplex  paralelos  (doble  
hebra)  con  la  secuencia  d(TCCCCC),  que  se  combinan  en  una  manera  anMparalela  en  el  i-­‐
moMf.   pH   celular   bajo   favorece   la   formación   de   i-­‐moMf,   como   por   ejemplo   en   células  
cancerígenas.  Posibilidad  de  formación  durante  transcripción  y  replicación.  
Apareamiento  
Hoogsteen  

G G
triple   G G

single  
 Estructura  del  ARN    

El  ácido  ribonucleico  (ARN)  posee  una  estructura  de  cadena  

polinucleóMdos   similar   a   la   del   ADN,   sin   embargo   su  
estructura  difiere  del  ADN  en  tres  aspectos  principales:  
 
1)  El  esqueleto  del  polinucleóMdo  está  formado  por  Ribosa  
en  vez  de  la  2’-­‐desoxiribosa.    

2)  El  ARN  conMene  a  la  pirimidina  Uracilo  en  vez  de  Timina.  
El  uracilo  Mene  la  misma  estructura  en  anillo  único  que  la  
Timina,   pero   carece   del   grupo   meMlo   (CH3-­‐).   Se   puede  
decir  que  la  Timina  en  un  uracilo  meMlado  en  posición  5’.    

3)  El  ARN  es  una  única  cadena  de  polinucleó>dos.  

 
 
El   ARN   no   cumple   función   de   almacenaje   del   material  
genéMco,   por   lo   que   no   sirve   de   templado   para   su   propia  
replicación.    
Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  gene.  7  Ed.    
 FUNCIONES  DEL  ARN:  
 
•  Molécula   intermediaria:   El   ARN   mensajero     (mRNA)   actúa  
como   molécula   intermediaria   entre   en   gen   presente   en   el  
ADN  y  la  maquinaria  proteica  de  síntesis  de  proteínas.  
 
•  Molécula   adaptadora:   El   ARN   de   transferencia   (tRNA),   actúa  
como   un   adaptador   entre   los   codones   del   mRNA   y   los  
aminoácidos.    
 
•  Molécula   estructural:   Como   componente   del   los   ribosomas  
(RNA  ribosomal).  
 
•  M o l é c u l a   r e g u l a t o r i a :   P o r   u n i ó n   m e d i a n t e  
complementariedad   de   bases   de   pequeños   ARN   (ej:  
microRNAs)   que   permiten   la   interferencia   en   la   traducción,  
inhibiendo  la  expresión  de  proteínas.    

•  Molécula  con   ac>vidad   enzimá>ca:   Algunos   ARN   ribosomales  

actúan   como   enzimas   (Ribozimas)   en   reacciones   de   nivel  
celular.  EJ:  RNAsa  P  
ORGANIZACIÓN  GENOMICA  
GENOMA:   Corresponde   al   complemento   total   de   genes   en   una  
célula  (eucarionte  y  procarionte)  o  virus.    
 
El  principal  elemento  genómico  en  procariontes  y  eucariontes  es  
el  cromosoma.    
 
Otros  elementos  génicos:  
 
•  Genoma  viral    
•  Plásmidos  
•  Genoma  de  organelos    
•  Elementos  transponibles  
 
Un   mpico   cromosoma   procarionte   (bacteria)   corresponde   a   un  
ADN   circular   simple,   conteniendo   todos   los   genes   encontrados  
en  el  interior  de  la  célula.    
En   términos   generales   los   procariontes   presentan   un  
cromosoma,   mientras   que   los   eucariontes   presentan   múl>ples  
cromosomas.  
 Humano:   cromosoma   conformado   por  
molécula   de   ADN   lineal.   23   moléculas   de  
ADN   lineal   en   el   rango   de   50   millones   a   260  
millones  de  pares  de  bases  (pb)  cada  una.  

Genoma  nuclear:  
aprox  3200  
millones  de  pares  
de  bases  de  ADN  
 

G e n o m a  
mitocondrial:   ADN  
circular   aprox   16569  
n u c l e ó M d o s   c o n  
múlMples  copias.    
Brown  TA.  Genomes.  2nd  ediMon.  Oxford:  Wiley-­‐Liss;  2002.  
Kb=  1000  pb  
Mb=  1  millón  de  pares  de  bases  
Gb=  mil  millones  de  pares  de  bases    
La  longitud  de  los  genomas  de  diferentes  individuos  es  dis>nta…

Estas   diferencias   se   deben   a   que   los   genomas   de   cada  

individuo,   presentan   polimorfismos   de   nucleóMdo   único   (Single  
NucleoMde   Polymorphism;   SNPs),   un   individuo   puede  
presentar  un  nucleóMdo  (ej:  A)  mientras  que  otro  uno  diferente  
(Ej:  G).    
 
Sobre   1,4   millones   de   SNPs   han   sido   idenMficados,   y   en   un  
promedio  de  1  cada  2  kb  de  secuencia  (SNP  Group,  2001)    

En   promedio   cada   2   kb   también   conMenen   secuencias  

microsatelites   (también   llamadas   Short   Tandem   Repeat   o  
STR).  Corresponden  a  una  serie  de  repeMciones  de  nucleóMdos  
(ej:  CACACACA).  Algunos  de  estas  secuencias  están  presentes  
en  genes  y  no  Menen  mayor  impacto  en  su  función…  
 
Los  SNP  o  STR  generan  variaciones  entre  individuos.    
 Diferentes  clases  de  genomas    

Simple  lineal   Múl>ple  lineal   Circular  simple   Múl>ple  circular   Mixto  (lineal  +  
circular)  

Genomas  de  
ADN  
ADN  hebra   Algunos  virus   Virus  de  ADN   Algunos  virus   -­‐-­‐   -­‐-­‐  
simple  (ss)   hebra  simple  
segmentado  
ADN  hebra  doble   Algunos  virus;   Virus  de  doble   Mitocondria;   Virus   Muy  pocas  
(ds)   algunas  bacterias   hebra   cloroplastos;   mulMparMculas;   bacterias,  Ej:  
Ej:  Borrelia   segmentados;   muchas  bacterias   algunas  bacterias   Agrobacterium  
núcleo   y  arqueas   tumefaciens  
eucariontes  
Genomas  de  
ARN  
ARN  hebra   Algunos  virus   Virus  ARN  hebra   Muy  pocos  virus   -­‐-­‐   -­‐-­‐  
simple     simple  
segmentado  
ARN  hebra  doble   Muy  pocos  virus   Virus  ARN  doble   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  
hebra  
segmentado  
Brock.  Biology  of  Microorganisms.  13th  ed  
El  cromosoma  de  E.  coli  es  un  ADN  circular  simple.    
Terminología  del  Genoma  
Kb/Mb  -­‐  Un  kilobase  (Kb)  es  
1000  pares  de  bases  de  
ADN,  mientras  que  una  
megabase  (Mb)  es  
1.000.000  de  pares  de  
bases.  
 
Cromosoma  circular:  El  ADN  
se  arregla  en  un  circulo  que  
es  cerrado  y  sobrenrollado  
negaMvamente,  que  permite    
la  naturaleza  compacta  de  
4.639.221  pb   muchos  genomas  
bacterianos.  
 
Cromosoma  lineal:  Es  un  
cromosoma  no  cerrado,  que  
Mene  repeMciones  inverMdos  
en  los  extremos,  similar  a  los  
telomeros  en  cromosomas  
eucarióMca.  
Griswold,  A.  (2008)  Genome  packaging  in  prokaryotes:  the  circular  chromosome  of  E.  coli.  Nature  
Educa>on  1(1):57  
 El  ADN  del  genoma  humano  tendría  una  distancia  de  unos  5000  km    

Figure  1.13  The  immense  length  of  the  human  genome  

Brown  TA.  Genomes.  2nd  ediMon.  Oxford:  Wiley-­‐Liss;  2002.  

Longitud  de  
cromosoma  de  E.  coli  
es  de  alrededor  de  1  
mm  de  longitud,  lo  
que  es  700  veces  más  
grande  que  el  tamaño  
de  la  célula.  
 

Brock.  Biology  of  Microorganisms.  13th  ed  

 ¿Como  es  posible  empaquetar  todo  el  ADN  en  un  espacio  tan  pequeño?      

Superenrrollamiento  

Clase  I:  Hacen  un  quiebre  en  la  hebra  simple  de  ADN  que  permite  la  
rotación  de  una  hebra  de  la  doble  hebra  de  ADN  alrededor  de  la  
otra.  Cada  rotación  agrega  o  remueve  un  único  
Brock.  Biology  of  Microorganisms.  13th  ed   superenrrollamiento.  
ADN  girasas  o  topoisomerasas  clase  II    

Clase   II.   Producen   quiebre   en   ambas   hebras   de   ADN,   pasando   la  

doble  hebra  a  través  del  quiebre  y  lo  une.  Cada  operación  adiciona  o  
remueve  dos  superenrollamientos  
Brock.  Biology  of  Microorganisms.  13th  ed  
Buckingham  and  Law.  Molecular  DiagnosMcs:  fundamentals,  methods,  and  clinical  applicaMons;  2007.  
 Empaquetamiento  del  ADN  en  eucariontes    
•  Existen  diferentes  niveles  de  empaquetamiento  en  los  cromosomas  eucariontes,  con  cada  
uno  de  los  niveles  contribuyendo  a  la  compactación  del  ADN.    
 
•  Para  el  ADN  ligeramente  compactado  basta  con  los  primeros  niveles,  mientras  que  para  
ADN   altamente   compactado   es   necesario   llegar   a   los   úlMmos   niveles   de  
empaquetamiento.    
 
•  Cada   nivel   involucra   un   específico   set   de   proteínas   que   se   asocian   con   el   ADN   con   la  
finalidad  de  compactarlo.  
 
En  el  primer  nivel,  se  encuentran  las  proteínas  del  Core  de  Histonas  (H3,  H4,  H2B,  H2A).  H3  y  
H4  forman  tetrámeros  que  se  unen  al  ADN  (147  pb),  para  que  luego  se  unan  los  2  dímeros  de  
H2A  y  H2B  y  así  formar  el  Nucleosoma.    
 
Posteriormente  la  Histona  H1  interactúa  con  el  ADN  entre  los  nucleosomas  (20  pb)  apretando  
y  acercando  aún  mas  a  los  diferentes  nucleosomas.    
 
Los  nucleosomas  empaquetados  pueden  formar  arreglos  mayores  conocidos  como  fibras  de  
30  nm.  A  este  nivel  el  ADN  es  menos  accesible  a  las  enzimas  como  las  ADN  polimerasas.    
 
El  empaquetamiento  conMnua  con  la  formación  de  loops  de  40-­‐90  kb  que  se  manMenen  
unidas  gracias  a  la  ayuda  de  proteínas  nucleares  de  andamiaje  (nuclear  scaffolds),  como  las  
topoisomerasas  clase  II.  
Strachan  y  Read.  Human  molecular  geneMcs.  4  ed.    
Cromosoma:  formado  por  la  cromaMna  
•  EucromaMna:  Menos  empaquetada  y  conMene   Forma  de  los  cromosomas  
genes  que  se  están  transcribiendo  
•  HeterocromaMna:  Zonas  densamente   Brazo  
empaquetadas,  ricas  en  secuencias  repeMMvas  y   corto  (p)  
que  no  se  transcriben.  Se  incluyen  las  secuencias  
cortas  altamente  repeMdas  conocidas  como  ADN  
satélite.    
Brazo  largo  
Metacéntricos:   El   centrómero   (q)  
se   encuentra   en   la   mitad   del  
cromosoma   y   los   dos   brazos  
presentan  igual  longitud.  
Submetacéntricos:   La   longitud  
de   uno   de   sus   brazos   es   mayor  
a   la   del   otro   (brazo   largo   y  
brazo  corto).  
Acrocéntricos:   Uno   de   los  
brazos   es   muy   corto   (p)   y   el  
otro  largo  (q).  
Telocéntricos:  El  centrómero  se  
localiza   en   un   extremo,   de   tal  
forma   que   sólo   se   observa   un  
brazo  del  cromosoma.  
MODULO  1:  Conceptos  básicos  en  Biología  
Molecular  y  Gené>ca    
 
Clase  1:  Estructura  y  función  de  los  ácidos  
nucleicos;  Organización  del  genoma  
procarionte  y  eucarionte.