Los métodos de cromatografía en capa fina y de

electroforesis son adecuados para determinar la

cantidad absoluta y relativa de los diferentes
aminoácidos en una muestra (análisis cualitativo); sin
embargo, para los análisis cuantitativos es necesaria
la cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC).

 Electroforesis. Se trata de un proceso en que

algunas biomoléculas con carga (como proteínas,
polinucleótidos, biopolímeros) se separan a partir
de su distinta velocidad de migración en un
campo eléctrico. Por lo general, los aminoácidos
no se presentan en forma aislada; de modo que
es necesario separarlos antes de poder
cuantificarlos. Entre las técnicas de separación,
se mencionan a continuación las de
 A continuación se muestran las pruebas o ensayos empleados para la
identificación de compuestos y grupos funcionales en esta investigación.
Cada una de ellas se realizó según procedimientos descritos, y utilizando los
patrones correspondientes /10/. ™
Prueba Ninhidrina ™
Prueba Sulfato de amonio ™ Prueba Biuret ™ Prueba Coagulación ™
Prueba Xantoproteica ™ Prueba grupos Azufrados (SH) ™ Prueba
Sakaguchi ™ Prueba Hopkins-Cole ™ Prueba Millon.
Prueba de la Ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno) Todas aquellas
sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre,
reaccionan con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de
un color violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos
poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas
soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica,
aparentemente debido a una oxidación y reducción intermolecular de la
ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos porina e
hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color
rojo que pasa rápidamente a amarillo /10/.
 Prueba de Biuret
Es una prueba general para polipéptidos y proteínas, ya que sirve para
reconocer las uniones peptídicas. La positividad se manifiesta por la
aparición de una coloración violeta, debido a la formación de un complejo de
coordinación entre los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones
peptídicas.

Reacción de la prueba de Biuret CO NH2 Cu NH2 CO OH OH NH HN CO

NH2 K K 2H N OC OH OH

La prueba de electroforesis de proteínas séricas (SPEP, por

sus siglas en inglés) mide proteínas específicas en la sangre
para ayudar a identificar algunas enfermedades. Las proteínas
son sustancias formadas por componentes básicos más
pequeños llamados aminoácidos . Las proteínas tienen una
carga eléctrica positiva o negativa, y se mueven en un líquido
cuando se colocan en un campo eléctrico. La electroforesis de
proteínas séricas usa un campo eléctrico para separar las
proteínas en el suero sanguíneo en grupos de tamaño, forma
y carga similares.
 Prueba Xantoproteica Es una reacción que reconoce los aminoácidos
que poseen el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina, triptófano). Las
proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la
reacción. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o
verde debido a la formación de nitrocompuestos

Ninhidrina ™ cuál es su contenido, en que se basan, para qué sirven

es un poderoso agente reactivo común como hidrato de carbono
estable del C central porque esta forma no tiene el efecto desestabilizador de
los centros adyacentes de carbonilo parciales positivos Sirve para visualizar
las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis,
también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de
aminoácidos.
Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4
y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético
que por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la
formación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco y gas
carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molécula
de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina, condensa a través del
amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o púrpura de
Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina,
hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. Presenta su máximo de
absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminoácidos reseñados
anteriormente. Incorporar 2 ml de ninhidrina 0,2% en etanol 95%

La electroforesis es una técnica que

emplean los cientificos en el laboratorio
utilizada para separar el ADN, el ARN, o
moléculas o proteínas en base a su
tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una
corriente eléctrica para mover las
moléculas y que se separen a través de un
gel. Los poros del gel actúan como un
colador, permitiendo que las moléculas
más pequeñas se muevan más rápido que
las grandes. Las condiciones utilizadas
durante la electroforesis se pueden ajustar
para separar moléculas en el rango de
tamaño que se desee.
 Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico
para el estudio de las proteínas son los siguientes: 1. Turbidimetría y
nefelometría 2. Inmunodifusión 3. Electroforesis 4. Inmunoelectroforesis 5.
Inmunoelectroforesis en cohete 6. Inmunofijación 7. Cromatografía
1.- TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Cuando un haz de luz choca
con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa, parte de la luz
se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz depende de: la
longitud de onda de la luz (?), del tamaño de la partícula y del índice de
refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea. La dispersión
de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. En ambas
técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta,
se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión
con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.
La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de
una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro
(detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele
utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución
de la luz transmitida) ej. determinación de proteínas totales en suero, LCR u
orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
1.2. La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz
emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como
instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que
oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones más
diluidas. Aspectos prácticos: · Tanto en los reactivos como en el suero
pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada ej.
lipoproteínas, quilomicrones También puede interferir la suciedad. · La
intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las proteínas
suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta (? < 300nm) y los
cromógenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a ?
que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. Muy frecuentemente, para
cuantificar proteínas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con
dichas proteínas de la muestra, en este caso se habla de
inmunoturbidimetría e inmunonefelometría. Para enteder estas técnicas
necesitamos tener claro unos conceptos previos: · Antígenos (Ag):
sustancias, generalmente de gran tamaño, capaces de estimular el sistema
inmunológico de un animal y originar una respuesta dirigida específicamente
contra él. 4 · Epítopo o determinante antigénico: lugar del a