I.

Estructura y características básicas del material genético

Los ácidos nucleicos fueron descubiertos en 1869 por Miescher, que consiguió precipitar una
sustancia rica en fósforo, que denominó nucleína ya que procedía de los núcleos de las
células, a partir del pus recogido de vendas en un hospital. Esta sustancia fue posteriormente
denominada ácido nucleico y más tarde ácido desoxirribonucleico (DNA).

En la década de 1920 se elucidó la composición química del DNA, estableciéndose que

contenía cuatro bases nitrogenadas: dos bases púricas (adenina y guanina) y dos
pirimidínicas (timina y citosina), un azúcar (desoxirribosa) y ácido fosfórico. La unión de una
base nitrogenada y la desoxirribosa origina un nucleósido, mientras que los nucleótidos
contienen un nucleósido y una o más moléculas de ácido fosfórico (Figura 1.1). Si en la
composición del ácido nucleico el azúcar es ribosa y en lugar de timina hay uracilo (otra base
pirimidínica), se habla de ácido ribonucleico (RNA).

Figura 1.1

1A, Estructura de las bases púricas y pirimidínicas; 1B, los azúcares ribosa y desoxirribosa;
1C, nucleótido monofosfato de adenosina (nótese la numeración 5'-3')

En esta primera mitad del siglo XX se sucedieron los descubrimientos relacionados con los
ácidos nucleicos, demostrándose que eran los portadores de la información genética.

En 1953 Watson y Crick publican su conocido trabajo en Nature

(http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf) en el que proponen la estructura de
doble hélice para el DNA, con dos hebras antiparalelas (Figura 1.2), apareándose la adenina
con la timina mediante dos enlaces de puentes de hidrógeno y la guanina con la citosina
mediante tres enlaces de puentes de hidrógeno (Figura 1.3); esto implica que las dos hebras
de la hélice son complementarias en cuanto a su composición en bases nitrogenadas.

Figura 1.2

Estructura de la doble hélice de DNA, mostrando la orientación de cada hebra. El eje interno
tiene un radio de 10Å; cada giro de la hélice recorre 34Å, que suponen 10 bases nitrogenadas
(el espacio entre cada base es de 3,4Å)

Figura 1.3

Enlaces entre los pares de bases A-T y G-C

El ácido ribonucleico (RNA) sin embargo, además de las diferencias en composición ya

comentadas, suele tener una única cadena, que puede enrollarse sobre sí misma para formar
estructuras en forma de horquilla.
El DNA es el portador de la información genética. El flujo de la información genética va del
DNA al RNA y finalmente a las proteínas, aunque hay algunas excepciones a esta norma
(algunos virus RNA, por ejemplo). La información del DNA está contenida en genes, que son
entidades físicas que dan lugar a un polipéptido. Esta información se transcribe a RNA
mensajero (RNAm), que es una copia complementaria del gen. La secuencia de nucleótidos
del RNAm se transforma en secuencia de aminoácidos en el proceso de traducción, en el que
también interviene otro tipo de RNA, denominado de transferencia (RNAt). Un tercer tipo de
RNA (RNA ribosómico, RNAr) también interviene en la traducción, como integrante de la
estructura de los ribosomas. Los RNAt y RNAr también están codificados en el DNA.

El código genético fue descifrado en la década de 1960 por varios investigadores (Khorana y
Nirenberg entre otros; en este apartado fue esencial la aportación de Severo Ochoa). Cada
aminoácido está codificado por un grupo de tres bases (triplete), si bien este código está
degenerado, ya que la mayor parte de los aminoácidos están codificados por más de un
triplete.

El DNA se replica mediante la acción de DNA polimerasas, enzimas que catalizan la adición
de nucleótidos a una estructura molecular inicial. La replicación comienza en un punto, en el
que se abre la doble hélice y, en el proceso de réplica, se copian las dos cadenas. Las DNA
polimerasas van añadiendo nucleótidos en dirección 5'-3' (la dirección se indica de acuerdo a
la numeración de los átomos de carbono del azúcar, como se observa en la figura 1.1 C), pero
para comenzar necesitan que exista un grupo hidroxilo libre en 3'; por ello es necesario que
exista un iniciador. Este proceso de replicación es semiconservativo, ya que en cada nueva
doble hélice hay una hebra de nueva síntesis y otra vieja, procedente del DNA que se copia
(Figura 1.4). Además de poseer actividad polimerasa, las DNA polimerasas también presentan
actividad exonucleasa 3'-5', que permite comprobar y corregir los errores que se produzcan
durante la replicación.

Figura 1.4
Replicación de una molécula de DNA para dar lugar a 2 nuevas moléculas. La mitad de las
cadenas proceden de la molécula original

Aunque los DNAs de todos los organismos son similares en estructura y composición, en las
células eucariotas el DNA se localiza en los cromosomas, pero en las células procariotas
(bacterias) se encuentra como un único círculo situado en una región denominada nucleoide,
aunque es común denominarlo cromosoma bacteriano. Además de este nucleoide, existen
otros DNAs bacterianos, como son los plásmidos, pequeñas moléculas circulares de DNA que
existen de forma independiente. Estos plásmidos contienen genes que pueden ser
importantes para las bacterias. Entre los distintos tipos de plásmidos existentes, destacan los
plásmidos R, que contienen genes que confieren resistencia a antibióticos, y los plásmidos de
virulencia, que incrementan la virulencia de algunas bacterias al conferirles capacidad de
producir toxinas o de resistir a las defensas de la célula huésped. Algunos plásmidos son
conjugativos, es decir que son capaces de transferirse de una célula a otra. Además, en este
proceso de conjugación, también se pueden movilizar genes cromosómicos.

Dentro del cromosoma de la bacteria (y también de las células eucariotas) hay fragmentos de
DNA que tienen la capacidad de variar su posición en el genoma, en el fenómeno conocido
como transposición. Hay varios tipos de elementos transponibles: secuencias de inserción,
transposones, algunos tipos especiales de virus. Sus características fundamentales son la
presencia de secuencias terminales repetidas e invertidas (por ejemplo: ACCG- secuencia de
inserción -CGGT) y la presencia de genes que codifican una transposasa, enzima implicada
en la transposición.

El avance en el conocimiento de los plásmidos permitió en 1973 a Cohen y Boyer construir el

primer plásmido recombinante (con genes procedentes de distintos orígenes) capaz de
replicarse en un huésped bacteriano, dando lugar al nacimiento de la ingeniería genética,
mediante la cual es posible la transferencia artificial de información genética entre organismos.

II. Fundamento de las técnicas genéticas aplicadas a la identificación y detección de

bacterias y virus en alimentos y aguas

II.1. Hibridación

II.1.1. El proceso de hibridación

Desde los primeros estudios con DNA, se supo que se podían cambiar sus propiedades
físicas mediante el empleo de calor o modificando el pH. Durante el calentamiento de una
solución de DNA, cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del DNA (Tm, melting
point, es la temperatura a la que la mitad del DNA presente está desnaturalizado; esta
temperatura varía para los DNAs de los diferentes organismos, dependiendo sobre todo del
contenido en pares guanina-citosina, G-C, que confieren mayor estabilidad), las hebras se
separan produciéndose la desnaturalización. Este proceso es reversible y las hebras
individuales de DNA pueden volver a asociarse cuando se restablecen las condiciones de
temperatura (Figura 1.5A). Si en una solución tenemos DNAs de distintas procedencias que
tengan regiones complementarias, también se pueden reasociar las distintas hebras dando
lugar a moléculas híbridas (hibridación; Figura 1.5B).
Figura 1.5

5A, Desnaturalización y renaturalización por calentamiento/enfriamiento

de una molécula de DNA

5B, Mezcla de dos soluciones conteniendo DNA desnaturalizado

para dar lugar a moléculas híbridas de DNA

II.1.2. Sondas de hibridación

Con los conocimientos que existen de los genomas de los organismos, cada vez es más
sencillo generar pequeños fragmentos de DNA (oligonucleótidos) que sean complementarios
de regiones que nos interesan, por ejemplo de genes específicos de una especie bacteriana.
De esta forma, si en una muestra problema se produce la hibridación entre el oligonucleótido y
el DNA presente en la muestra, se puede concluir que la bacteria de interés estaba presente
en esa muestra. A estos fragmentos de DNA se les denomina sondas.

II.1.3. Factores de los que depende el proceso de hibridación

Los factores que más influyen en el proceso de hibridación son la temperatura, el pH y la

concentración de cationes. La modificación de estos parámetros condiciona la fidelidad con la
que se produce la hibridación (en inglés se denomina stringency, traducido en ocasiones
como "“astringencia”"), es decir, el número de pares de bases erróneos que puede tolerar un
híbrido. Si se emplean soluciones con baja concentración salina o la reacción se lleva a cabo
a temperatura elevada, es poco probable que se forme un híbrido estable (hibridación de gran
fidelidad o de "high stringency"). Estas condiciones se usan para evitar la aparición de falsos
resultados positivos.
Por el contrario, las soluciones con alta concentración salina o las bajas temperaturas
permiten la formación de híbridos imperfectos (algunos pares de bases no están
correctamente emparejados). Estas condiciones de baja fidelidad (“low stringency”) se usan
para detectar secuencias relacionadas con la de la sonda, aunque no sean perfectamente
complementarias (por ejemplo, para géneros de bacterias o para detectar genes relacionados
con algún gen ya caracterizado).

II.1.4. Detección de la hibridación (i): marcadores

Para poder observar si la sonda es híbrida o no con el DNA problema, es necesario "marcar"
la sonda de forma que pueda dar una señal medible. Los primeros marcadores empleados
eran isótopos radiactivos, normalmente P32. De esta forma, se podían detectar los híbridos
mediante la exposición de películas fotográficas; sin embargo, las sondas marcadas con P32
tienen poca vida útil, ya que este isótopo tiene una vida media de 14 días, y además obliga al
manejo de material radiactivo.

Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas, como puede
ser el uso de enzimas (peroxidasa o fosfatasa, que llevan a cabo una reacción detectable),
marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra
molécula) o moléculas quimioluminiscentes (que producen luz y puede excitar una película
fotográfica).

La molécula marcadora se puede incorporar a la sonda mediante distintas técnicas:

• Unión al azar ("random priming"). Consiste en copiar un fragmento de DNA utilizando una
DNA polimerasa y añadiendo a la reacción algunos nucleótidos marcados; se incorpora un
nucleótido marcado cada 20-25 bases.

• Marcado por relleno ("nick translation"). Se realizan cortes enzimáticos ("nicks") en el DNA y
después se reparan con una DNA polimerasa utilizando nucleótidos marcados.

• Marcado en 3'. Se añade un único nucleótido marcado en el extremo 3' empleando una
transferasa terminal.

• Marcado extendido en 3' ("3' tailing"). Similar a la técnica anterior, pero se añade una cadena
sencilla de 10-50 bases en el extremo 3'.

• Marcado en 5'. Se pueden marcar las sondas en el extremo 5' durante su síntesis química.

• Marcado de RNA. Se usan una RNA polimerasa y nucleótidos marcados para que se
transcriba un fragmento de DNA, dando