UNIDAD DE TRABAJO 1: CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESOS QUE

SE REALIZAN EN LOS LABORATORIOS DE CITOGENÉTICA Y BIOLOGÍA

MOLECULAR

Índice

1.1 Introducción
1.2 Conceptos básicos
1.3 Requerimientos del laboratorio de biología molecular y citogenética
1.4 Organización y funciones del laboratorio de biología molecular.
Materiales y equipos básicos
1.5 Normas de manipulación del material estéril. Técnica aséptica
1.6 Seguridad en los laboratorios de citogenética y biología molecular
1.7 Uso eficiente de los recursos

1.1 Introducción
La biología molecular es una ciencia que estudia la estructura, composición,
función y relaciones de las moléculas celulares en los seres vivos. Las molécu-
las son grupos de átomos que se mantienen unidos por enlaces químicos, y
son consideradas como la unidad básica de la vida.

Esta ciencia enfoca su estudio en las macromoléculas como los ácidos nuclei-
cos y las proteínas, que realizan los procesos biológicos esenciales para el fun-
cionamiento de las células.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas que se encuentran en todas las cé-
lulas. Su función es almacenar información genética y sintetizar proteínas para
transmitir esta información o características genéticas de generación en gene-
ración. Estos son el ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonu-
cleico).

El ADN (ácido desoxirribonucleico), contiene información genética utilizada

para el desarrollo y funcionamiento de los organismos vivos y se encarga de

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transmitir la herencia genética. El ARN (ácido ribonucleico), es el ácido nuclei-
co encargado de transmitir la información genética a las proteínas.

El reconocimiento y estudio de los ácidos nucleicos es una valiosa

herramienta con fines biomédicos por dos motivos: en primer lugar porque
permite trazar la huella molecular de muchas patologías lo que es de vital
importancia para su pronóstico, diagnóstico y seguimiento. Por otro lado, hay
que entender que muchos de los tratamientos de las enfermedades se aplican
tanto por el conocimiento existente a nivel molecular de la etiología de las
enfermedades (p. ej. el cáncer) como por el hecho de que tales tratamientos
son diseñados gracias a las propias técnicas de biología molecular.
Hay que tener en cuenta que el entorno de trabajo donde se llevan a cabo
todos estos procedimientos es el laboratorio, aunque en el caso de la biología
molecular hay que entender que sus singularidades por la naturaleza del
material que se manipula son específicas.

1.2 Conceptos básicos

1.2.1 Historia de la biología molecular
El desarrollo de la biología molecular surgió, aproximadamente, a partir de
1930. Fue de suma importancia en el siglo XX porque permitió a los científicos
descubrir los ácidos nucleicos.

Diversos estudios y descripciones sobre la estructura del ADN y el material ge-

nético habían sido expuestos por científicos como Rosalind Elsie Franklin, Li-
nus Pauling y Maurice Wilkins.

Estos conocimientos sirvieron de apoyo para que en 1953 los biólogos James
Dewey Watson y Francis Crick, describieran la estructura molecular del ácido
desoxirribonucleico (ADN).

Watson y Crick presentaron un modelo tridimensional de doble hélice del ADN,

para exponer su importancia en la transferencia de información genética en los
seres vivos.

1.2.2 Estructura de los ácidos nucleicos

Con el término ADN o ácido desoxirribonucleico hacemos referencia a una ma-

cromolécula de naturaleza nuclear que posee la información genética que de-

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termina todas las características y el funcionamiento de un individuo. Se deno-
mina genoma al conjunto de material genético existente en un organismo.

Existen diferentes moléculas de ADN, las más importantes se denominan

formas B y adquieren una estructura estable de doble cadena
autoensamblada en forma de hélice. Está formada por la unión de unas
subunidades denominadas nucleótidos, formados por tres componentes:
- Un monosacárido del tipo pentosa (en ADN será la desoxirribosa, y en ARN
será la ribosa), unido al grupo fosfato mediante una unión de tipo éster
(enlace que se produce entre un grupo alcohol y un grupo carboxilo) en la
posición del Carbono 5 de la pentosa.
- A su vez, la pentosa se une a una base nitrogenada en la posición de su
Carbono 1. Las bases nitrogenadas de dos tipos, las purinas (son moléculas
con dos anillos cíclicos, son: adenina y guanina) y las pirimidinas (son
moléculas con un anillo cíclico, son: citosina, timina y uracilo).
Las bases nitrogenadas que forman parte del ADN son: Adenina (A), Guanina
(G), Citosina y Timina (T).Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN
son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina
es específica del ADN y el Uracilo es específico del ARN.

Por otro lado, se denomina nucleósido a la unión de la pentosa con la base

nitrogenada.
Los nucleótidos se enlazan  para formar polímeros: los ácidos nucleicos.
La cadena se va formando al unirse mediante enlace fosfodiéster los fosfatos
al C3' de otro nucleótido. Así la cadena tiene un extremo 5´y un extremo 3´.

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Por tanto, en la estructura primaria del ADN, en las hebras enfrentadas
Adenina se une con Timina mediante dos puentes hidrógeno, mientras que
Guanina se une con Citosina mediante tres puentes de hidrógeno. 

La estructura secundaria del ADN fue propuesta por Watson y Crick, y la

llamaron el modelo de doble hélice de ADN.
Este modelo está formado por dos hebras de nucleótidos. Estas dos hebras se
sitúan de forma antiparalela, es decir una orientada en sentido 5' → 3' y la otra
de 3' → 5'. Las dos están paralelas , formando puentes de hidrógeno entre las
bases nitrogenadas enfrentadas.
Cuando en una hebra encontramos Adenina en la otra hallamos Tiamina.
Cuando en una hebra encontramos Guanina, en la otra hallamos Citosina.
Estas bases enfrentadas son las que constituyen los puentes de hidrógeno.
Adenina forma dos puentes de hidrógeno con Timina. Guanina forma tres
puentes de hidrógeno con la Citosina.

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Las dos hebras están enrolladas en torno a un eje imaginario, que gira en
sentido contrario a las agujas de un reloj. Las vueltas de estas hélices se
estabilizan mediante los puentes de hidrógeno. Una vuelta de hebra contiene
aproxima- damente 10 pares de bases o 10 nucleótidos.
Esta estructura permite que las hebras que se formen por duplicación de ADN
sean copia complementaria de cada una de las hebras existentes.

La estructura terciaria hace referencia a la superhélice con el DNA enrollado:

el ADN se organiza dentro del interior celular, en el caso de las células
eucariotas en su núcleo empaquetándose sobre sí mismo, de tal manera que
si sumamos la longitud del DNA de una sola célula comprobaremos que mide
alrededor de 1,5m de longitud y el diámetro del núcleo es de 10nm. Este hecho
nos indica que el DNA tiene que estar muy compactado dentro del núcleo. Esto
se consigue mediante un proceso conocido como enrollamiento.

Este proceso da lugar a la estructura cuaternaria, donde se forman los

cromosomas que aparecen en determinados estadios del ciclo celular. En
todas nuestras células disponemos de 23 pares de cromosomas (22 pares de
autosomas y un par de cromosomas sexuales), provenientes la mitad de la
madre y la otra mitad del padre.

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El proceso por el cual el ADN se autoperpetúa, es decir, produce copias de sí
mismo para transferir de generación en generación se denomina replicación.
La información contenida en esa secuencia de nucleótidos del ADN se
denominan genes, cuya codificación y lectura dará lugar a la producción de
una proteína mediante una serie de procesos que dará lugar de forma
intermedia a la síntesis del otro ácido nucleico, es decir, el ARN (ácido
ribonucleico), en este caso compuesto por una única molécula lineal de
nucleótidos que incluyen bases del tipo purina (adenina y uracilo) y pirimidina
(citosina y guanina). Este proceso de biosíntesis se denomina transcripción.
A partir del ARN y siguiendo un código específico (código genético) basado en
la secuencia ordenada de tripletes de nucleótidos denominado codón, se
sintetizará la cadena de aminoácidos que constituye las proteínas, siendo este
proceso conocido como traducción.
La traducción se realiza en los ribosomas del citoplasma de las células, con la
aportación fundamental del ARN mensajero o ARNm. Este proceso comprende
tres etapas: iniciación, elongación y finalización de la síntesis.
La traducción del mensaje genético a proteínas se puede realizar gracias a
este “diccionario” llamado código genético. Aunque hay 20 aminoácidos
distintos que codificar, sólo se disponen de 4 bases nitrogenadas distintas para
hacerlo. Por tanto, hará falta más de una base nitrogenada para codificar cada
aminoácido. 
Hay que tener en cuenta que el número de codones posibles es 64:

• 61 codones codifican aminoácidos (siendo además uno de ellos el co-

dón de inicio, AUG, y que codifica el aminoácido metionina).

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 • 3 codones que no codifican ningún aminoácido, pero son señales
de parada (UAA, UAG, y UGA).

El código genético tiene una serie de características:

- Es universal, pues lo utilizan casi todos los seres vivos conocidos. Solo
existen algunas excepciones en algunas bacterias.
- No es ambiguo , pues cada triplete tiene su propio significado.
- Todos los tripletes tiene sentido, bien codifican un aminoácido o bien indican
terminación de la lectura.
- Está degenerado, pues hay varios tripletes para un mismo aminoácido, es
decir, hay codones sinónimos.
- Carece de solapamiento, es decir los tripletes no comparten bases
nitrogenadas.
- Es unidireccional, pues los tripletes se leen en el sentido 5’ - 3’.

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A la relación existente entre estas macromoléculas (los ácidos nucleicos) y los
procesos que tienen lugar sobre ellas se denomina Dogma central de la
biología molecular.

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1.3 Requerimientos del laboratorio de biología molecular y citogenética

Teniendo en cuenta las consideraciones generales del uso y manejo de las

instalaciones de un laboratorio, en el caso concreto de aquellos destinados a la
citogenética y los cultivos celulares, hay que subrayar tres tipos de
requerimientos especiales:
a) Requerimientos de tipo físico.
b) Requerimientos de organización
c) Requerimientos de materiales y equipos.

1.3.1 Requerimientos de tipo físico

Los laboratorios de citogenética y cultivos celulares deben de ser instalaciones
de acceso muy restringido, y por lo tanto muy separados físicamente de otras
zonas.
La aparición de las cabinas de flujo laminar redujo notablemente las
necesidades de aislamiento, ya que su uso permite aumentar de forma notable
el gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al
interior de las cabinas de flujo donde se van a manipular los cultivos.
Las necesidades de asepsia dependen del tipo de materiales que se van a
procesar en el laboratorio, lo que da lugar a dos tipos de contención y áreas
de trabajo:
- Laboratorio de cultivo de tejidos en general. Para la manipulación de cultivos
no patógenos se instalará preferentemente en una sala aislada a la cual se le

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suministrará aire filtrado mediante equipos de filtración y un regulador de
temperatura, lo que provoca un aumento de la presión atmosférica en el interior
del laboratorio (15-20mmg de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al
área limpia.
- Laboratorio de cultivos con patógenos, que supone un nivel de contaminación
superior. Esto implica filtrar el aire que sale de la sala y por lo tanto que ese
aire saldrá estéril.
1.3.2 Requerimientos de organización
Es muy importante la formación y reciclaje del personal que trabaja en este
ámbito puesto que las técnicas se van actualizando periódicamente.
Se ha de trabajar con procedimientos normalizados de trabajo (PNT), siendo
deseable que los laboratorios tengan implantado algún sistema de gestión de
la calidad que asegure el cumplimiento de unas normas y requerimientos
operacionales en todos los procesos que se llevan a cabo en el laboratorio
principalmente a nivel productivo y de gestión de recursos.
1.3.3. Requerimiento de materiales y equipos.
El material que se emplea en un laboratorio de estas características es amplio
y diverso. No obstante, posteriormente vamos a mencionar algunos de los
materiales y equipos más significativos.

1.4 Organización y funciones del laboratorio de biología molecular.

Materiales y equipo básico
Para un correcto diseño de un laboratorio de estas características, deberemos
tener en cuenta tres variables: las instalaciones, el equipamiento y el personal.
En cuanto a las instalaciones, hay que decir que el laboratorio de biología
molecular requiere de tres espacios separados.
El primero de ellos se utiliza como técnica de pretratamiento. Aquí se realiza
la manipulación de las muestras y la extracción de los ácidos nucleicos. Este
espacio puede estar compartido con otras zonas de otro laboratorio.
El segundo es una zona limpia y separada del resto del laboratorio. Es aquí
donde se prepara y se realiza la amplificación y las técnicas de PCR (Reacción
en Cadena de la Polimerasa) .
El tercer espacio es una zona oscura en donde se realizan las electroforesis y
la lectura de geles.

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Es importante destacar la importancia del flujo unidireccional de trabajo desde
el área más limpia hacia la más sucia ya que de esta manera puede realizar un
control efectivo de la contaminación.
En cuanto al personal, debe ser el adecuado y necesario para la realización, la
interpretación y puesta al día de las técnicas de biología molecular, teniendo en
cuenta que el personal encargado de realizar los ensayos PCR debe estar
capacitado en el correcto uso de los reactivos, los equipos y de todo aquello
que esté relacionado con la técnica.
En lo que respecta al equipamiento básico, y en lo que al material se refiere,
hay que señalar que presenta muchas similitudes al de otros laboratorios, ya
que parte de los instrumentos y equipos que se necesitan forman parte de los
laboratorios que realizan otras técnicas.
De entre otros equipos, podemos mencionar los siguientes:

Campanas, vitrinas o cabinas de bioseguridad biológica (CSB) de flujo laminar

Su función es mantener el área de trabajo donde se manipulan las células
libres de contaminantes. Hablamos por lo tanto de medidas de protección en el
foco.
Los fines de estas cabinas son:
-Proteger al operario de agentes patógenos o contaminantes desarrollados en
el interior de la cabina.
-Proteger el cultivo de patógenos o contaminantes externos e internos.
-Proteger el medioambiente de patógenos o contaminantes desarrollados en el
interior de la cabina.

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Estas cámaras van provistas de un tipo de filtro denominado HEPA (Hig-
Efficency Particulate Air) o filtro de partículas aéreas de gran eficiencia, que
se caracteriza porque retiene el 99,97% de las partículas de hasta 0,2 µm de
diámetro y el 99,99% de las partículas de un tamaño mayor. Dicho filtro puede
estar situado en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal).
Las partículas de aerosol de menos de 5 μm de diámetro y las pequeñas
gotículas de 5 a 100 μm no son visibles a simple vista y se generan en
cualquier actividad que transmite energía a un material líquido.
Estas partículas se pueden formar al agitar, verter, remover, pipetear, sembrar
en placas, en una homogenización o en la agitación vertical.
Estos filtros retienen todos los agentes infecciosos conocidos y garantizan que
el aire que sale de la cámara se encuentra exento de microorganismos.
En cuanto al tipo de protección que ofrecen las CSB se diferencian tres clases:
• CSBI: Son cámaras de diseño sencillo en las que el aire del laboratorio
entra por la abertura delantera y sale de la cámara por un conducto de
extracción en el que se encuentra el filtro. Proporcionan protección personal y
ambiental y se utilizan también para el trabajo con radioisótopos y sustancias
químicas tóxicas volátiles.
• CSBII: Además de protección personal y ambiental estas cámaras
protegen los materiales de la superficie de trabajo ya que el aire que llega a
dicha superficie ha pasado por un filtro HEPA. Pueden utilizarse con
microorganismos de riesgo 4 siempre que se utilicen trajes presurizados.
Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir las diferentes
necesidades han permitido hablar de tres subtipos:
-Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es
recirculado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se
previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal.
-Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se
recirculariza sólo el 30% del aire en cada ciclo, eliminándose el 70% de aire
restante.
-Tipo 100% exhaustivo. Es una cabina que el 100% del aire de cada ciclo es
eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes
peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios
de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y que
elimine el aire posiblemente contaminado.

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• CSBIII: Son cámaras también denominadas cámaras de guantes que se
utilizan para trabajar con agentes del grupo de riesgo 4. Todos los orificios de
la cámara se encuentran sellados, el aire de entrada pasa por un filtro HEPA y
el de salida pasa por dos. El acceso a la cámara se hace a través de guantes
de goma gruesa y el material entra a la superficie de trabajo a través de una
caja de paso que puede esterilizarse y que va también equipada con salida de
aire provista de filtro.
El correcto uso de estos equipos depende de la correcta calibración del
instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire
en el sistema y del flujo que debe ser vertical.

Incubadores de C02
Son básicamente estufas de cultivo que deben mantener la temperatura
controlada, además poseen un sistema de inyección de C02 que normalmente
contiene el 4% y el 7%, además de un sistema de control de humedad
ambiente.
Es muy importante controlar la estabilidad de la temperatura, ya que las células
suelen resistir bien a bajas temperaturas, pero son muy sensibles a aumentos
por encima de la temperatura del animal de origen. Para homogeneizar la
temperatura interna, los incubadores posen un dispositivo de recirculación de
aire que garantiza la homogeneidad de la temperatura en el interior de la
cámara.
El propósito del CO2 es fundamentalmente la regulación del pH en el medio
de cultivo de células eucariotas, donde el tampón bicarbonato es el de uso más
extendido.
Los incubadores se componen de bombona de C02, circuito general, bandeja
de agua, sistema de inyección de agua estéril, recirculación de aire y filtros
HEPA.

Baños termostáticos
Todos los medios de cultivo y los líquidos que entren en contacto con las
células deben estar ajustados a la temperatura óptima de crecimiento de las
células.

Microscopio de contraste de fases invertido

La estructura del microscopio es invertida en comparación al microscopio
convencional ya que la fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el

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revólver y los objetivos por debajo de ella. El microscopio de contraste de fases
es utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una
preparación previa y para monitorear actividades (crecimiento,
comportamiento).
Este tipo de microscopios son muy necesarios puesto que en células vivas no
se pueden usar agentes de tinción porque se degradarían, y se opta por
condensadores y objetivos de contraste de fases y también prismas de
contraste de interferencia diferencial de Nomarski (técnica de microscopía que
emplea filtros polarizantes y prismas para producir imágenes con
tridimensionalidad).

Centrífugas
Necesarias para poder hacer una precipitación de células en el fondo del tubo
y poder eliminar el sobrenadante y resuspender las células en el medio
deseado.

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Otros utensilios y aparatos de interés
Podemos mencionar otros equipos indispensables en el laboratorio como son
los termocicladores, sistema de electroforesis, lectura digital o fotográfica de
los geles, placa térmica para realizar hibridaciones, contadores de células
electrónicas, equipos de purificación de agua, balanzas, pH-metro,
pipeteadores automáticos, micropipetas, frigoríficos, etc.
Material fungible
En este grupo se incluyen los frascos de cultivo, las placas, las pipetas de
cristal, los tubos estériles de 15 y 50 ml, los tubos de microcentrífuga, puntas
de pipeta….
Hay que tener en cuenta que para mantener el flujo unidireccional de trabajo
y evitar retroceder desde áreas sucias a áreas limpias, cada una de las áreas
debe contar con recursos exclusivos tales como agua libre de nucleasas,
centrífugas, vórtex, refrigeradores o congeladores, micropipetas etc. Se
incluyen además elementos adicionales como ordenadores.
Por otro lado, hay que decir que se deberían mantener cantidades suficientes
de guantes y batas en cada área, de forma que su uso sea exclusivo en cada
una de ellas y se disminuya al mínimo el riesgo de contaminación.

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1.5 Normas de manipulación del material estéril. Técnica aséptica
Las condiciones de higiene en un laboratorio son fundamentales tanto desde
un punto de vista preventivo como operacional. El hecho de aplicar prácticas
que aseguren unas condiciones de asepsia en los laboratorios de citogenética
y de biología molecular es imprescindible, y afectan fundamentalmente a
aspectos relativos a la indumentaria, uso de equipos de protección individual y
buenas prácticas de trabajo.
Vamos a resaltar los aspectos generales son los más relevantes, aunque
conviene recordar que cada laboratorio debe tener identificados las
consideraciones especiales de su entorno.

Elemento Descripción
Indumentaria Indispensable el uso de la bata. Está prohibido el uso
de calzado abierto.
EPIS Imprescindible el uso de guantes.
Las gafas deben reservarse para manipular sustancias
caústicas, o para abrir autoclaves en algunas
condiciones de manipulación microbiológica o en
circunstancias en las que se puedan producir
descargas de aerosoles o salpicaduras.

Prácticas Hay que lavarse las manos antes, después y con cierta
higiénicas frecuencia durante el trabajo con los cultivos celulares.
personales Se emplearán antisépticos jabonosos y soluciones
antisépticas hidroalcohólicas.
Ante las heridas, es preciso vigilarlas, ya que puede ser
una puerta de entrada a la infección. Deben cubrirse
con materiales resistentes: tiritas, dediles, etc
No debe llevarse el pelo suelto, ya que puede dar lugar
a un incendio al pasar cerca del mechero, ser aspirado
por algún aparato o provocar la caída de frascos o
matraces.

Entorno de No se debe salir del laboratorio con ropa de trabajo,

trabajo guantes, etc
El acceso será restringido, sobre todo en determinadas
áreas del laboratorio.

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 Prácticas Identificar adecuadamente el contenedor, bien sea de
operacionales cultivos, medios, aditivos, etc. así como su tapa. Hay
en el manejo que hacerlo de forma segura.
del material y
aparataje -La identificación no debe conllevar a confusión:
marcamos la tapa y el lateral de la base en
determinados lugares, que, tras la manipulación, no
conlleven pérdidas de sistema de identificación.
-Rotular, marcar todo el material y los tubos que
utilicemos con fecha de apertura, composición etc.
-Evitar el pipeteo repetido de un stock de una solución.
Esto puede conllevarnos a una posible pérdida de
esterilidad. La forma más adecuada es sacar una
alícuota a una botella con menor volumen y de esta
última llevar a cabo el pipeteo reiterado.
-Hacer que los recipientes que contienen medios,
cultivos o aditivos permanezcan abiertos el menor
tiempo posible.
-Rechazar un material si no estamos seguros de que
se cumple las condiciones de esterilidad.
-No pipetear con la boca. Usar pipetas automáticas.
-Si utilizamos un baño para atemperar botellas, medios
etc. hay que tener la precaución de secarlas
cuidadosamente antes de usarlas.
-No abrir un recipiente que muestre signos de posible
contaminación en un ambiente cercano a medios de
cultivos o aditivos. En todo caso, se podrán lejos de
dicho ambiente, tomar muestras para la comprobación
de dicha contaminación. Indudablemente esto se
realizará cuando dicho recipiente no pueda ser
sustituido por uno no contaminado.
-En la esterilización de los materiales y reactivos se
tendrá en cuenta aplicar el calor húmedo con
autoclaves a 121ºC y presión de 1,5 bar para
materiales metálicos,vidrios y equipos de filtración,
calor seco en hornos de 200º durante tres horas para
esterilizar vidrios, y filtrar líquidos con equipos con
membrana de nitrocelulosa y acetato de celulosa con
un tamaño de poro menor a 0,22 micras.

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Elemento Descripción
La El laboratorio debe estar limpio y ordenado
organización La organización y la distribución del laboratorio deben ser las
adecuadas para facilitar el trabajo y la seguridad.
Se deben disponer de equipos de protección individual según el
nivel de seguridad.
Los elementos de emergencia (duchas, lavaojos, mantas
ignífugas, etc) debe ser visibles, estar identificados y libres para
su uso inmediato.
Informar a los nuevos usuarios del proceso de acogida sobre las
normas de trabajo, los equipos, plan de seguridad, etc
Usuarios Seguir las buenas pautas de protección individual (uso de EPIS,
pelo recogido, no llevar puesto objetos personales como anillos,
aseo de manos al entrar y salir del laboratorio, evitar usar lentes
de contacto).
No guardar alimentos y bebidas en los frigoríficos y
congeladores del laboratorio.
Está prohibido comer, beber, fumar y aplicarse productos
cosméticos.
Está prohibida la entrada al laboratorio a toda persona no
autorizada y sin la ropa adecuada.
No salir del laboratorio con la ropa de trabajo.

Materiales y Utilizar solamente los productos y materiales que se encuentren

productos en perfecto estado.
Etiquetar adecuadamente los reactivos y disoluciones
preparadas.
Medir la cantidad necesaria de cada reactivo.
Recoger los productos y materiales al finalizar su uso.
Equipos, uso Revisar periódicamente las instalaciones del laboratorio.
ymantenimien Mantener limpieza, calibración y mantenimiento de los equipos.
to

La técnica aséptica
La barrera esencial en contra de la contaminación en el laboratorio de cultivos
celulares es la aplicación de las técnicas asépticas recogidas en un código de
buenas prácticas de laboratorio (BPL). Por otro lado, debemos hablar de la
idoneidad del material empleado como es el caso de las pipetas y de las
puntas que ha de ser estéril.

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Se ha de garantizar un entorno de trabajo que asegure el trabajo aséptico, lo
cual se puede conseguir mediante:
- El uso de las cabinas de flujo laminar.
- El empleo de entorno de la llama del mechero Bunsen.
- En el caso de entornos en donde no se puede utilizar la cabina de flujo
laminar se puede emular condiciones de ambiente estéril mediante el
uso de soluciones de descontaminación con hipoclorito sódico y la llama
de los mecheros Bunsen.

1.6 Seguridad en los laboratorios de citogenética y biología molecular

Conceptos
La seguridad en un laboratorio está relaciona con la manera de proceder,
evitando la contaminación de las muestras, reactivos, medioambiente y las
personas que se encuentran y fuera del laboratorio.
Para ello se han de establecer ambientes seguros, que son aquellos en los
que el riesgo está eliminado o limitado a un nivel aceptable.
Entendemos como peligro al riesgo que exista para que se produzca un daño
para la salud, los materiales y el medioambiente.
La medida preventiva se entiende como aquel conjunto de acciones que
pueden aplicarse para evitar eliminar un riesgo. Las normas generales y
específicas de trabajo en el laboratorio y los procedimientos normalizados de
trabajo (PNT) son medidas preventivas para evitar riesgos.
La contención la entendemos como los procedimientos que hacen seguro el
manejo del material de riesgo en el laboratorio.
Riesgos biológicos
Según establece el RD 664/1997 de 12 de mayo, sobre la protección de los
trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes
biológicos durante el trabajo, estos riesgos son los siguientes:

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Niveles de bioseguridad
Según la evaluación de riesgos y de la muestra utilizada, las instalaciones, los
equipos y los procedimientos utilizados, podemos clasificar los laboratorios en
cuatro niveles de seguridad.

Tipo de Laboratorio básico. Nivel de bioseguridad 1

laboratorio
Descripción Para docencia e investigación. Las directrices son:
-Se manejan cepas de microorganismos que no son
generadoras de enfermedades en adultos sanos.
-Los trabajos se realizan en la mesa y estante con superficies
resistentes a bases, ácidos, disolventes, etc.
-Se usan principalmente EPIS (guantes, gafas y bata).
-Puede haber una campana de extracción de gases para uso
de sustancias volátiles.
-Uso de dispositivos de pipeteo con pipetas automáticas.
-Iluminación adecuada.
-Sistema de seguridad como duchas y lavaojos.
-Es necesaria la formación continua del personal.
-El responsable del laboratorio elaborará un manual de
seguridad entendible por todo el mundo.
-Se seguirá un procedimiento especial de limpieza y
descontaminación en caso de que se produzcan derrames de
líquidos contaminados.
-Se registrarán los accidentes y exposiciones reales a
materiales y muestras infecciosas.

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Tipo de Laboratorio básico. Nivel de bioseguridad 2
laboratorio
Descripción Para docencia, investigación y diagnóstico clínico.
Además de las directrices que se contemplan para los
laboratorios de nivel 1, incluimos:

-Se ha de incluir pictogramas de riesgo biológico.

-Se procede al uso de equipos de seguridad como cabinas
CSB.
-Es conveniente el control del flujo del aire hacia el interior y
un sistema de ventilación controlada.
-Se dispondrá de un autoclave con medio de
descontaminación y esterilización del material contaminado.
-Se instalarán ventanas equipadas con rejillas que impidan el
paso de insectos. Será necesario un plan de lucha contra
este tipo de plagas.

Tipo de Laboratorio de contención. Nivel de bioseguridad 3

laboratorio
Descripción Para docencia, investigación y diagnóstico clínico, aunque es
necesario registrar y controlar por parte de las autoridades
sanitarias las medidas de protección personal, a la
comunidad y al medioambiente.
Además de las directrices que se contemplan para los
laboratorios de nivel 1 y 2, incluimos:

-Se controla el flujo de aire con gradiente de presión negativa

y un flujo de aire hacia el interior.
-Se utilizan cabinas de seguridad biológica de clase I y II en
todas las actividades y manipulaciones de laboratorio.
-Existe una sala que puede precintarse para ser
descontaminada.
-Hay una entrada con doble puerta de laboratorio.
-Está diseñado para trabajar con microorganismos del grupo
3.
-Se indicará en la puerta de entrada el símbolo de
advertencia de peligro biológico con el nivel de bioseguridad,
el nombre del responsable de laboratorio y las condiciones
especiales de entrada.

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 -Se emplea ropa especial: batas sin abertura delantera y de
dos piezas, monos, gorros y si es necesario, protección para
el calzado.
-Puede ser necesario el uso de protección respiratoria en
ciertas operaciones (trabajo con animales infectados con
agentes patógenos).
-Se instalarán ventanas cerradas herméticamente y con
cristales de resistencia a rotura.
Puede evacuarse o recircularse el aire interior a través de
filtros HEPA.
-Se protegerán las bombas de vacío con sifones y filtros.
-Se necesitan accesorios de contención en las centrífugas,
como cubetas de seguridad o rotores de contención.
-Se necesitan sistemas de ventilación y evacuación con filtros
HEPA si se usan células infectadas en los separadores de
células.
-Se instalará un lavabo con grifo que puede accionarse sin
utilizar manos.

Tipo de Laboratorio de contención. Nivel de bioseguridad 4

laboratorio
Descripción Unidades que manejan patógenos peligrosos por lo que
están sometidos a un control por parte de las
administraciones sanitarias.
Además de las directrices que se contemplan para los
laboratorios de nivel 1, 2 y 3, incluimos:

-Se utilizan cabinas de seguridad tipo III.

-Se realizará el aislamiento del laboratorio respecto al tráfico
de personas.
-Se procederá al tratamiento de los efluentes y a la
eliminación especial de los residuos.
-Se instalará un autoclave de doble puerta.
-Se procederá a la vigilancia de la seguridad del personal
mediante un sistema de televisión con circuito cerrado.
-Se aplicará la regla del trabajo realizado por dos personas,
donde se trabaja siempre por parejas en el laboratorio, más
aún cuando el trabajo se realice con ropa especial de nivel 4.
-Es necesario un cambio completo de ropa y calzado al entrar
y salir al laboratorio.
-El personal debe recibir formación sobre los procedimientos
de evacuación de emergencia en caso de accidente o si
existe una posibilidad de sufrir lesiones.

22
Se emplean procedimientos de contención primaria:

-Las cabinas de seguridad biológica de clase III se localizarán

preferentemente en una sala aislada dentro del laboratorio.
-Será necesario atravesar dos puertas antes de entrar en la
sala.
-Es necesaria una ducha personal con vestuarios.
-Los utensilios y los materiales que entren en la sala lo harán
después de pasar por un autoclave o una cámara de
fumigación de doble puerta.
-Se pueden usar trajes especiales de seguridad que son de
una pieza, con presión positiva, suministro de aire flitrado con
filtros HEPA y pueden tener respirador autónomo.
-Tiene que haber una ducha de descontaminación de trajes
antes de abandonar la zona de contención.

El acceso estará controlado de la siguiente manera:

-El personal entrará al laboratorio a través de las zonas de
vestuario y descontaminación.
-La entrada y la salida del personal se realizará a través de
cámaras de cierre hermético.
-Se dispondrá de acceso con entrada de cierre hermético
para muestras, materiales y animales.
Se dispondrá de un sistema de ventilación controlada:
-Debe mantenerse la presión negativa en el laboratorio. En
aire de entrada y de salida debe pasar por filtros HEPA.
Será necesaria la descontaminación de todos los efluentes
(líquidos residuales) antes de su eliminación definitiva. Se
empleará calor y se corregirá el pH antes de evacuarlos.

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Principales tipos de Equipos de Protección (EPI) individual empleados en un
laboratorio

Trabajo con cabinas de seguridad biológica (CSB)

Existen una serie de pautas específicas para el manejo de las cabinas con
seguridad biológica (CSB) que se deben conocer:
1. Introducir solamente el material necesario para trabajar.
2. Trabajar con mecheros Bunsen si es necesario, siempre en lugares
dentro de la cabina donde no se modifique el flujo laminar y se puedan
producir turbulencias.
3. Usar tubos con tapón de rosca y no con tapones de algodón porque
pueden desprenderse fibras.
4. Realizar movimientos lentos en el interior de las cabinas para no producir
turbulencias.
5. Trabajar entre 5 cm y 10 cm de la superficie de trabajo porque es la zona
mejor descontaminada.
6. Seguir el protocolo de trabajo:
a) Poner en funcionamiento la cabina entre 15 y 30 minutos antes del
trabajo y conectar la luz UV.
b) Desinfectar con alcohol isopropílico al 70% la superficie de trabajo.
c) Cargar la cabina con el material necesario para trabajar, previamente
descontaminado con alcohol 70% y esperar de 2 a 3 minutos antes
de empezar a trabajar para descontaminar el material.
d) Empezar a trabajar en la cabina.

24
 e) Al acabar el trabajo, desinfectar la cabina con alcohol al 70% y dejar
15 minutos la cabina en funcionamiento antes de apagarla o volver a
usarla y conectar la luz UV.

Trabajo con cultivos celulares

Los cultivos celulares en general no suponen un riesgo para la salud del
operador, aunque pueden provocar inflamaciones locales en caso de
inoculación. Esto puede deberse a una contaminación accidental como
consecuencia de hábitos incorrectos en la manipulación de los tejidos y células
de origen del cultivo o por el uso de reactivos, materiales y ambiente
contaminado. Los agentes contaminantes pueden ser diversos: bacterias,
hongos, virus, priones…
Para evitar la aparición de estas contaminaciones, existen una serie de
recomendaciones que se han de seguir:

1. Trabajar con buenas prácticas microbiológicas.

2. Tratar todos los cultivos como potencialmente infecciosos.
3. Trabajar siempre dentro de una cabina de seguridad tipo II.
4. Manipular los cultivos celulares de origen humano o de primates con un
nivel de bioseguridad tipo 2.
5. Trabajar siempre con material estéril y sólo abrir dentro de una cabina de
seguridad biológica.
6. Obtener líneas celulares de organismos oficiales (colecciones de
entidades reconocidas como la Americana de cultivos tipo, Europea de
cultivos celulares o la Española de cultivos tipo).
7. Comprobar si la línea celular tiene un comportamiento diferente.
8. Incorporar la autentificación de las líneas celulares en la práctica diaria.
9. Implantar programas de vigilancia de la salud del personal.

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Algunas de las operaciones básicas de los laboratorios de citogenética y las
medidas preventivas más habituales son:

Trabajo en el laboratorio de biología molecular

Para el trabajo seguro en el contexto específico de los laboratorios de biología
molecular existen algunas pautas específicas que conviene destacar:
1. Usar una bata distinta a la de uso normal.
2. Realizar cambios frecuentes de guantes.
3. Separar las zonas de trabajo para evitar contaminaciones cruzadas.
4. Emplear zonas de trabajo separadas para la preparación del material, la
extracción de ácidos nucleicos, amplificación y electroforesis.
5. Evitar la acción de nucleasas que degraden ADN y ARN de la muestra,
de modo que habrá que someter a las soluciones y el material al
autoclave de forma correcta.
6. No almacenar soluciones que hayan pasado por el autoclave con
material no estéril.
7. Trabajar en zonas limpias o en campana con las soluciones que
contengan ácidos nucleicos o enzimas. Estas han de mantenerse
siempre en hielo fuera de la nevera.

26
 8. Almacenar los reactivos como cebadores de ADN, nucleótidos o enzimas
en un congelador expresamente diseñado para ello.
9. Mantener en hielo fuera de la nevera el mínimo tiempo posible las
enzimas de restricción y las polimerasas termoestables, debido a que se
inactivan a temperatura ambiente.
10. Realizar controles positivos y negativos en cada ensayo para
asegurar la veracidad de los resultados.

Algunas de las operaciones básicas de los laboratorios de biologías molecular

y las medidas preventivas más habituales son:

Gestión de residuos en el laboratorio

En cualquier actividad profesional se generan residuos. En el caso de los
laboratorios por su peligrosidad y naturaleza destacan los de tipo químico y
biológico. Sean de la naturaleza que sean, deben ser gestionados
convenientemente, lo cual implica una correcta y segura manipulación,
almacenamiento, transporte y eliminación.
Existe un marco legal europeo, español y autonómico que hay que tener en
cuenta a la hora de la consideración de este tipo de sustancias producidas, y
que tienen en la Ley 22/2011 de Residuos y suelos contaminados y en el
Decreto 109/2015 de Gestión de residuos sanitarios de Extremadura, las
normas principales de referencia.

27
Entre otras cuestiones, en el citado marco legislativo, se insta a los laboratorios
a la disposición de un plan o programa de gestión de residuos.
Los puntos importantes que recoge el Plan de Gestión de Residuos en el
laboratorio son los siguientes:
1. Identificar al responsable.
2. Identificación/inventario de los residuos generados.

28
 3. Reducción de residuos.
4. Almacén y recogida.
5. Medida de seguridad.
6. Actuación en caso de accidentes.
7. Formación continua del personal.

En cuanto a la manipulación de los residuos hemos de seguir algunas

recomendaciones generales como:
1. Evitar el contacto con los residuos mediante equipos de protección
individual adecuado.
2. En caso de no conocer las características del residuo, manipular siempre
como peligroso.
3. Informar de forma adecuada y actualizada sobre la peligrosidad de las
sustancias que se manipulan.
4. Manejar la información suficiente para realizar el trabajo de manera
segura.
5. Disponer de formación en buenas prácticas de trabajo.
6. No mezclar nunca residuos sólidos con líquidos.
7. No eliminar por el desagüe o tirar a la basura ningún residuo químico
peligroso.
8. Si tenemos un residuo de origen desconocido, contactar con la empresa
de recogida para informarse del protocolo a seguir.
9. Actuar con responsabilidad en el protocolo de gestión de residuos.
10. Considerar los residuos biosanitarios especiales no citotóxicos
como asimilables a los urbanos si se someten a esterilización en
autoclave.

En cuanto al uso y la manipulación de envases, se deberán seguir estas

recomendaciones:
1. No llenar envases más del 90% de su capacidad.
2. Utilizar envases según especificaciones técnicas de cada residuo.
3. Todos los envases deben tener escrito CEE para estar homologados.

29
 4. Solamente abrir el envase para añadir el residuo correspondiente.
5. Evitar el apilamiento de envases.
6. Situar los envases y los contenedores en un lugar donde se facilite su
acceso.
7. Se prohíbe el almacenamiento de residuos de más de seis meses.

1. 7 Uso eficiente de los recursos.

En un laboratorio el manejo eficiente de los recursos es un factor fundamental
por diversos motivos. Solemos tener en cuenta aquellos criterios de tipo
económico, que ya de por sí suponen una mejora notable en el desarrollo de
las operaciones, pero hay otros factores a tener en cuenta que están implícitos
en la mejor eficiencia (relación de recursos consumidos/resultados), eficacia
(grado de logro alcanzado respecto al objetivo en condiciones ideales),
efectividad (es la eficacia pero en condiciones habituales de trabajo) y
utilidad ( grado en que una prueba diagnóstico mejora de la calidad de vida de
los pacientes).
Es por esto que la utilización adecuada de las pruebas de laboratorio trata de
reducir al mínimo el uso de los recursos del laboratorio, proporcionando
beneficios al paciente ya que la información que se puede obtener es útil para
la decisión clínica sobre el paciente.
La forma que tenemos para comparar varias pruebas de laboratorio son las
curvas ROC (Receiver Operating Characteristic Curves) en español,
característica operativa relativa.
Este método evalúa gráficamente la capacidad discriminante de una prueba.
También sirve para evaluar diferentes pruebas que pueden usarse para un
mismo diagnóstico mediante la comparación de las áreas bajo la curva. A
mayor área mejor prueba diagnóstica obtendremos.

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Según la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular
(SEQC), el laboratorio clínico del futuro necesitará profesionales con mayor
formación en métodos de evidencia científica, gestión e informática, capaces
de integrase y liderar equipos multidisciplinarios.
El modelo de laboratorio compartimentado e independiente, donde la
información se producía de manera aislada en áreas de bioquímica,
inmunología, microbiología y hematología, dará lugar a un laboratorio sin
fronteras experto en conocimiento y clave en toma de decisiones.

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