UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
FACULTAD DE QUIMICA, INGENIERIA QUIMICA E INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL
Laboratorio de microbiología

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUIMICOS SOBRE LOS

MICROORGANISMOS Y PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

Autores: Acuña Nieto Hugo, Chugden Renzo, Chuquihuaccha Cayampi Aldo, Flores Vidal
Esmeralda, Prado Monago Jhonn, Vázquez Huerta Jesús Enrique, Yovera Silva Gustavo

RESUMEN

En esta práctica hemos visto la acción de agentes físicos y químicos sobre los
microorganismos como la Escherichia coli y Staphylococcus aureus ,los agentes físicos que se
analizaron fueron la temperatura , presión osmótica y los agentes químicos fueron el pH , los
desinfectantes y antisépticos .

En el efecto de La temperatura, la muerte térmica de los microorganismos estudiados

tratados a 40° C y 65° C durante diferentes intervalos de tiempo nos dio como resultado el
número de microorganismos supervivientes resistentes al tratamiento térmico. Con los
resultados obtenidos hallamos el Tiempo de Reducción decimal o valor D en ambas
temperaturas mediante la ecuación:

x
Dt=
N°
log ⁡( )
Nx

Dt: Tiempo en minutos

x: Minutos a temperatura especifica

No: n° de células iniciales

Nx: n° de células finales

En la presión osmótica se utilizaron concentraciones de 5 , 10, 20 y 40 % de NaCl donde se

comprobó que el crecimiento microbiano se afecta a mayores concentraciones debido a proceso
de crenación que sufren las células.
Con respecto al efecto químico de pH se utilizaron concentraciones de iones hidronio (pH)
de 3,5,7,9 ,11 ; vimos en los resultados que el crecimiento óptimo para la proliferación de la
E.Coli está en un medio con pH neutro .

Al someter los microorganismos a agentes desinfectantes como lejía ,cresol y pinesol ; este
último resultó ser el bactericida más eficiente . Con respecto a los antisépticos como alcohol ,
agua oxigenada , merthiolate y jabon protex ,este último mostró un menor crecimiento
bacteriano que muestra su efectividad.

ASTRACT:

In this practice we have seen the action of physical and chemical agents on microorganisms
such as Escherichia coli and Staphylococcus aureus, the physical agents that were analyzed
were temperature, osmotic pressure and chemical agents were pH, disinfectants and antiseptics.

In the effect of temperature, the thermal death of the microorganisms studied treated at 40 ° C
and 65 ° C for different time intervals resulted in the number of surviving microorganisms
resistant to heat treatment. With the obtained results we find the Time of Decimal Reduction or
value D in both temperatures by means of the equation:

x
Dt=
N°
log ⁡( )
Nx

Dt: Time in minutes

x: Minutes at specific temperature

No: number of initial cells

 Nx: number of final cells

In the osmotic pressure concentrations of 5, 10, 20 and 40% of NaCl were used where it was
proved that the microbial growth is affected at higher concentrations due to the crenation
process that the cells undergo.

With respect to the chemical effect of pH hydronium ions (pH) concentrations of 3,5,7,9, 11
were used; We saw in the results that the optimal growth for the proliferation of E. coli is in a
medium with neutral pH.

By submitting the microorganisms to disinfecting agents such as bleach, cresol and pinesol; the
latter proved to be the most efficient bactericide. With regard to antiseptics such as alcohol,
oxygenated water, merthiolate and soap protex, the latter showed a lower bacterial growth that
shows its effectiveness.
INTRODUCCIÓN

Los microorganismos están presentes en todos los lugares de la Tierra que sean capaces de
mantener la vida. Estos hábitats incluyen lugares que nos son familiares, como el suelo, el agua,
los animales o las plantas, así como prácticamente cualquier estructura hecha por el hombre. La
esterilidad (es decir, la ausencia de formas vivas) es muy poco común en una muestra natural de
cualquier tipo. Desde el punto de vista humano, algunos ambientes ocupados por los
microorganismos podrían considerarse como demasiado limitados para contener vida. Aunque
algunos de estos ambientes pueden suponer también un desafío para el desarrollo de los
microorganismos, los ambientes extremos están a menudo colonizados por la vida microbiana.
(Brock 2009)

Las actividades de los microorganismos se ven afectadas de modo muy importante por las
condiciones químicas y físicas del medio. A este respecto se pueden considerar muchos factores
ambientales, pero hay cuatro factores que juegan un papel destacado en el control del
crecimiento microbiano: la temperatura, el pH, la disponibilidad de agua, y el oxígeno. Otros
factores también pueden afectar potencialmente al crecimiento, como la presión y la radiación.
Estos factores ambientales más especializados serán considerados más adelante en este libro
cuando se analicen hábitats microbianos en los que tienen un papel importante (Brock 2009).

La vida microbiana florece en ambientes de elevada temperatura, incluso en el agua hirviendo.

Por encima de 65 °C solo viven formas procariotas, pero en esas condiciones existe una enorme
diversidad de microorganismos pertenecientes a Bacteria y Archaea (Brock 2009).

El Staphylococcus aureus es un microorganismo del reino de los protistas, ampliamente

distribuido en el ambiente, coloniza al hombre y animales. Casi toda persona presenta algún tipo
de infección por S. aureus durante su vida, que varía en gravedad desde intoxicación alimentaria
o infecciones cutáneas menores hasta infecciones graves potencialmente mortales (Jawetz
2002).

Durante la transformación de los alimentos, hay que evitar el uso de materias primas que
puedan ser contaminadas con S. aureus (aunque se elimine la bacteria por tratamiento térmico,
las enterotoxinas pueden estar presentes y su eliminación es muy difícil). Los fabricantes de
alimentos envasados deben someter a sus productos a una temperatura elevada durante un
periodo de tiempo determinado para garantizar que no se formen las enterotoxinas
estafilocócicas. El tratamiento principal de inactivación de Staphylococcus aureus consiste en
aplicar calor por encima de 45 ºC, pero si las toxinas ya se han formado previamente, la
destrucción de las células viables de la bacteria no inactiva la actividad biológica de las
enterotoxinas estafilocócicas formadas. Asimismo, es necesario mantener la cadena de frío
durante el transporte, almacenamiento y distribución de los alimentos crudos susceptibles de ser
contaminados con Staphylococcus(DTU-Microbiological contaminants in food in the European
Union in 2004-2009 ).

La Salmonella typhi es una bacteria que se transmite por medio de alimentos o agua
contaminados con materia fecal y orina de personas portadoras. Es resistente a bajas
temperaturas lo que le permite transmitirse a través de alimentos conservados a bajas
temperaturas.

MATERIALES Y MÉTODOS

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

I) En el proceso del efecto de la temperatura se usaron distintos materiales los cuales incluyen
Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Para el procedimiento de esta práctica se utilizó dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S.
aureus crecidos en Caldo Nutritivo que se sometieron a 40° C y 65° C, Cada 0, 40, 80 y 100
minutos se cogió 1 ml de cada uno los tubos que contienen las cepas microbianas en ambas
temperaturas y se sembró por el método de difusión en el medio de cultivo Agar Nutritivo para
luego realizar diluciones seriadas.

Posteriormente rotulamos correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa

microbiana e incubamos a 28° C por 48 horas en posición invertida. Realizamos el recuento de
microorganismos en cada uno de los tratamientos y anotamos los resultados. Con los resultados
obtenidos elaboramos la curva de supervivencia de microorganismos en papel milimetrado
comparando el tiempo de exposición (eje X) y las UFC/ml (eje Y) para cada una de las
temperaturas evaluadas por microorganismos evaluado y hallamos el tiempo de Reducción
decimal o valor D en ambas temperaturas utilizando la siguiente fórmula:

II) En el proceso de la acción de la presión osmótica se usaron distintos materiales los cuales
incluyen Cepas de Escherichia coli de 24 horas de edad crecida en caldo nutritivo, 4 Placas con
concentraciones crecientes de NaCl al 5%, 10%, 20% y 40% en medio base Agar Nutritivo, 1
placa con Agar Nutritivo, Asa de siembra, Encendedor

Para el procedimiento de esta práctica tomamos placas con diferentes concentraciones de NaCl,
sembramos la cepa de E. coli por el método del estriado. Repetimos el paso anterior utilizando
una placa con Agar Nutritivo que contiene concentración normal de NaCl, rotulamos las placas
Petri con la cepa microbiana utilizada.

Posteriormente incubamos a 28°C por 48Hrs. Luego comparamos el crecimiento microbiano

entre las placas que contienen las diferentes concentraciones de NaCl y la placa con Agar
Nutritivo que contiene concentración normal de NaCl. Finalmente realizamos la interpretación y
discusión de resultados.

ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

I) Para el proceso del efecto de la concentración de iones hidrógeno (pH) en los

microorganismos usamos distintos materiales los cuales incluyen cultivos de 24 horas de edad
de Escherichia coli, y tubos con caldo nutritivo estéril previamente ajustados con HCl 1.0N y
NaOH 1.0N a valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0 (1 de cada una).

Para el procedimiento de esta práctica comenzamos inoculando con una azada el cultivo de E.
coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con distintos valores de pH. Luego incubamos a
28° C y anotamos las observaciones en términos de la cantidad de crecimiento al segundo y
cuarto día. Finalmente anotamos los resultados utilizando la tabla dada y realizamos la
interpretación y discusión de resultados.

II) Para el proceso de la acción de los desinfectantes y antisépticos usamos distintos materiales
los cuales incluyen Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, medio de cultivo: Agar
nutritivo, desinfectantes: Lejía al 10%, cresol al 5%, pinesol, antisépticos: Alcohol al 70%,
agua oxigenada, merthiolate, jabón medicado (Protex), Discos de papel filtro, pinzas y plumón
indeleble.

PROCEDIMIENTO

Agentes desinfectantes

1. Dividimos la placa de Agar Nutritivo en 3 mitades utilizando plumón indeleble.

2. A partir de un cultivo de 24 horas de edad de la cepa de E. coli transferimos con un asa de

kohle el inóculo necesario y lo sembramos sobre la superficie de cada parte de la placa de Agar
Nutritivo.

3. Utilizando una pinza estéril colocamos un disco de papel filtro de 1.5 cm de diámetro
embebido en la solución del desinfectante.

4. Realizamos el mismo procedimiento para la cepa microbiana de S. aureus

5. Finalmente incubamos las placas a 28°C por 48 horas en posición invertida.

Agentes Antisépticos

1. Dividimos la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.

2. Realizamos el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las
cepas de E. coli y S. aureus.

3. Incubamos a 28° C por 48 horas y anotamos las observaciones en términos de la cantidad de

crecimiento. Empleamos la siguiente escala:

+ = Poco crecimiento

++ = Regular Crecimiento

+++ = Crecimiento moderado

++++ = Abundante crecimiento

4. Anotamos los resultados utilizando el esquema dado en la práctica, finalmente realizamos la

interpretación y discusión de resultados.

ACCIÓN DE AGENTES FÍSISCOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

(ACCIÓN DE LA TEMPERATURA):

TABLA N°1. RESULTADOS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

TEMPERATURA TIEMPO (MINUTOS) CRECIMIENTO

MICROBIANO (UFC/mL)
Escherichia coli
0 3,88x1010
65°C 40 8,6x109
80 -
100 -

x 30 min
Dt= = =45,85 min
Hallando el Dt: N0 3,88¿ 1010
log
( ) (
Nx
log
8,6∗109 )
El Dt resultó 45,85min, esto nos indica que fue necesario aquel tiempo para reducir el 90% de
microorganismos de una población a la temperatura de 65°C. En la Tabla N°1 se puede observar
que hay más bacterias en el menor tiempo, en cambio hay menos bacterias en el mayor tiempo.
Todo esto, nos indica que la temperatura afecta en el crecimiento microbiano de los
microorganismos, además, hay que tener en cuenta que las células jóvenes no son muy
resistentes a condiciones adversas (en este caso, la temperatura).

Otro aspecto importante que debemos tomar en cuenta es, que la Escherichia coli es un
mesófilo típico, y sus temperaturas cardinales están claramente definidas. La temperatura
óptima para la mayoría de sus cepas está cerca de 39°C, la máxima es 48°C y la mínima, 8°C.
Es por eso, que el crecimiento microbiano ha disminuido, porque la Escherichia coli no puede
adaptarse al 100% a la temperatura de 65°C ya que su máximo es 48°C.

(ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA):

A B C D

FIGURA N°1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE NaCl SOBRE EL CRECIMIENTO

MICROBIANO.

En la placa que contenía 5% de NaCl, se puede observar que hubo desarrollo de colonias de la
especie Escherichia coli. Aquella concentración no afectó mucho en el crecimiento microbiano
(Ver Figura N°1.A).

En la placa que contenía 10% de NaCl, se puede observar que bajó un poco el desarrollo de
colonias de la especie Escherichia coli. Aquella concentración de NaCl afectó un poco en el
crecimiento microbiano (Ver figura N°1.B).

En cambio, en las placas que tenían concentraciones de 20% y 40% de NaCl, no se observa
ninguna colonia de la especie Escherichia coli. Aquellas concentraciones afectaron mucho en el
crecimiento microbiano (Ver figura N°1.C) por lo que hubo crenación de las células por la alta
presión osmótica del medio, que hizo que de la célula salga agua y ocasionara que la membrana
citoplasmática y el protoplasma se contraigan hacia el centro de la célula.

CONCLUSIONES:

(ACCIÓN DE LA TEMPERATURA Y PRESIÓN OSMÓTICA)

La temperatura de 65°C afectó en el crecimiento microbiano de la Escherichia coli, ya que esta
especie es un mesófilo típico que puede desarrollarse hasta una temperatura máxima de 48°C, es
por ello que el crecimiento microbiano ha disminuido.

A mayor tiempo de la acción de la temperatura sobre la Escherichia coli, menor será el

crecimiento microbiano, e inversamente.

La concentración de NaCl afectó al crecimiento microbiano de la especie Escherichia coli. A

menor concentración de NaCl sobre las colonias, menor será el efecto en el crecimiento
microbiano, e inversamente.

La alta presión osmótica del medio hace que el agua salga de la célula hasta establecer un
equilibrio, luego sucede la crenación.

ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE MICROORGANISMOS

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

(EFECTO DEL PH EN LOS MICROORGANISMOS):

TABLA N°2. EFECTO DEL PH EN LOS MICROORGANISMOS:

PH=3 PH=5 PH=7 PH=9 PH=11

Escherichia coli - ++ +++ + +

Figura N°2. Efecto del PH en los microorganismos según la turbidez que presenta cada muestra

Con el PH=3 (ácido), la Escherichia coli no pudo desarrollarse completamente ya que no es su

PH óptimo, por lo que en la figura N°2 se observa que el primer tubo de ensayo (comenzando
desde la izquierda) no presenta turbidez.

Con el PH=5 (ácido), tubo regular crecimiento por la turbidez que presenta en el tubo de
ensayo.
Con el PH=7 (PH óptimo), hubo crecimiento moderado (Ver Tabla N°2) de la Escherichia coli,
esto se puede observar en la turbidez del tubo de ensayo que es mayor su turbidez que el
anterior.

Con el PH=9 y PH=11 (PH alcalino), hubo poco crecimiento por la poca turbidez que presenta
los dos últimos tubos de ensayo. Resultó así por posibles errores al inocular la especie en el tubo
de ensayo, porque en la realidad, en un medio básico, la Escherichia coli puede desarrollarse
normalmente siempre en cuando no sea exagerado el grado de basicidad.

(ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS):

Figura N°3. Lejía y Pinesol formando halos de inhibición. Figura N°4. Merthiolato formó halos de inhibición.

En la lejía y el Pinesol se observa halos de inhibición en donde no se produce crecimiento

bacteriano, además se puede observar que la lejía tiene una gran potencia antibiótica frente al
germen o muestra cultivada.

En los antisépticos, solo en el Merthiolato se formó un halo, mientras que en los demás no se
formó un halo, por lo que son bacteriostáticos (jabón, alcohol y peróxido de hidrógeno).

CONCLUSIONES:

(EFECTO DEL PH EN LOS MICROORGANISMOS Y ACCIÓN DE LOS

DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS)

La Escherichia coli no se desarrolló en un medio ácido (PH=3) ya que tiene un PH adecuado

para desarrollarse.

El PH afectó en el desarrollo o crecimiento microbiano de la Escherichia coli cuando estuvo

incubado en una temperatura de 28°C.

El PH óptimo para el desarrollo de la Escherichia coli fue 7, por lo que hubo mayor turbidez en
el tubo de ensayo.
La lejía tuvo un gran poder desinfectante frente al crecimiento microbiano.

El Merthiolato actuó como bactericida, mientras que el alcohol, peróxido de hidrógeno, jabón
actuaron como bacteriostático (inhibición del crecimiento microbiano).

CUESTIONARIO

1. De los microorganismos estudiados ¿qué estructuras bacterianas le confieren resistencia

térmica? ¿Por qué?

- Enzimas termoresistentes

- Interior molecular hidrófobo

- Ribosomas termoresistentes

- Membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos muy fuertes.

2. ¿Cuál es el rango de temperatura en el cuál los microorganismos crecen y se multiplican

rápidamente y en función de esto cuál sería la temperatura recomendada para la conservación de
los alimentos? ¿Por qué?

EL rango de crecimiento de la mayoría de microorganismos patógenos es de 25-40oC , La

temperatura recomendad para la conservación de alimentos es entre 4 a 7oC debido a que en
estas temperaturas las bacterias patógenas cesan la actividad metabólica y entran en estado de
inactividad, por lo tanto dejan de reproducirse .

3. ¿Qué cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en posibles
productos frescos a temperatura ambiente?

- Evitar el exceso de agua intracelular ya que con los nutrientes de los productos frescos se crea
un ambiente propicio para la actividad de células patógenas.

- Lo mejor sería conservarlos en un lugar fresco y seco para prolongar su duración y evitar el
contacto con la mayoría de microorganismos del ambiente

4. ¿Qué ejemplos de aplicación están basados en la fisiología de la presión osmótica?

- Por ejemplo el uso de conservas de alimentos en almíbar para frutas, por osmosis las células
perderán su agua que ira al medio extracelular, abundante en azúcar, o cual las dejara
deshidratadas .las células vegetales tienen resistencia a la plasmólisis debido a que la pared
celular evita que la membrana celular se rompa, pero los demás microorganismos no cuentan
con esto así que por perdida de agua se producirá crenación, dando más tiempo de vida útil a la
conserva.
- También sería el caso con las conservas como pescado salado o cecina , Ya que agregando sal
a la carne se producirá que el agua del medio intracelular se vaya al medio extracelular y las
células patógenas morirán por crenación .

5. ¿Cuál es la razón de usar alcohol de 70°?

Debido a que el restante 30% que es agua ayuda a el alcohol etílico a atravesar la membrana
celular , una vez allí el alcohol etílico inhibirá muchas reacciones como la glucolisis , además de
que romperá la membrana celular ,En cambio el alcohol de 96o no cuenta con esta facilidad
para atravesar la membrana celular , por lo tanto no es muy usado como antiséptico .

6. En un proceso productivo de derivados de frutas, ¿Cuál sería el agente contaminante

principal? ¿Cuál sería su agente químico de control? ¿Qué función cumpliría este agente?
Proponga un ejemplo.

Usando como ejemplo la preparación de duraznos en almíbar, el agente contaminante principal

seria el mismo medio ambiente, ya que allí se encuentran la mayoría de bacterias, además que
en el agua se transportan otras bacterias y por evaporación pueden llegar al fruto.

Como control, luego de pasar por el proceso de lavado y pelado se usaría sorbato de potasio o
benzoato de sodio para contrarrestar a los posibles mohos o levaduras.

7. Explique el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo microbiano.

Los desinfectantes se usan para destruir microorganismos o inhibir, estos se usan en superficies
sin vida ya que suelen ser muy potentes y pueden ser tóxicos o irritantes en los seres vivos,
usualmente se usan agentes oxidantes como el cloro o el hipoclorito de sodio, ya que estos se
unen a las proteínas y forman cloraminas, Asi destruyen la célula por oxidación.

En el caso de los antisépticos se usan en seres vivos para evitar la proliferación de

microorganismos indeseados en caso de cortes o heridas , aquí se usan otros productos tales
como el peróxido de hidrogeno , que actúa como antiséptico ya que este mata a las célula
procariotas solamente debido a que no poseen peroxisoma y no tienen resistencia al peróxido de
hidrogeno, las células del cuerpo so eucariotas y poseen peroxisoma Asi que son resistentes al
peróxido de hidrogeno y no sufren ningún daño.

8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas

indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad metabólica.
¿Por qué?

- Serian principalmente los alimentos ricos en azucares y carbohidratos además si poseen

abundante agua intracelular serían más susceptibles a la fermentación de microorganismos, Ej. :
fresas , tomates , moras , etc...
Defina:

Desinfectante

Se refiere al producto que se utiliza para matar o inactivar microorganismos patógenos en

superficies inertes.

Antiséptico

Son sustancias que se aplican en tejido vivo para reducir la posibilidad de infección por
microorganismos patógenos. Se dividen en bactericida y bacteriostático

Bactericida

Son antisépticos con la capacidad de destruir microbios.

Bacteriostático

Son antisépticos que previenen o inhiben el crecimiento de los microorganismos

Plasmólisis

Es un fenómeno que se produce cuando las condiciones del medio extracelular son
hipertónicas , lo que causa perdida de agua en la célula , al perder el agua la membrana celular y
la pared celular se separan esta separación puede ser reversible dependiendo del medio
extracelular.