Primera Unidad Enzimología y Metabolismo Energético

INTRODUCCION.
Los equivalentes reductores: átomos de hidrógeno o electrones, provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo
de Krebs y otros metabolitos; son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Este
sistema se localiza en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física entre sus componentes y su
integración en la membrana; es conocido también como cadena transportadora de electrones, enfatizando que las oxidaciones
reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones.

Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores más usados se clasifican en
tres grupos según el sitio donde actúen en la cadena respiratoria.

Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y
ubiquinona; destacándose la rotenona, la piericidina, el amital, los esteroides, los detergentes, algunos anestésicos volátiles como
halotano. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les denomina inhibidores del complejo I. Un segundo
grupo de sustancias denominado inhibidores del complejo III, actúan bloqueando la transferencia de electrones entre los
citocromos b y c; ejemplos de este grupo son la antimicina, hidroxiquinolina N-óxido, el BAL y barbiturato de sódio. Un grupo de
inhibidores actúa sobre el Hemo a3 del citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno, comprenden el cianuro, el
monóxido de carbono, el azida, etc. A estos se les denomina inhibidores del complejo IV.

Para determinar la permeabilidad de la cadena de oxidorreducción al paso o no de electrones, se utilizan sustancias indicadoras
artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen; así por ejemplo el 2-6 diclorofenolindofenol y el azul de metileno
son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado, que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. Como hay flujo de
electrones en la cadena, ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ.

Si al administrar un inhibidor de la cadena, éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore), quiere decir que
dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la coenzima Q, inclusive de la cadena (región que incluye el complejo
I), pero si el indicador se decolora, entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en algún sitio posterior a la CoQ
inclusive.

La p-fenilendiamina, es otro indicador que actúa como sustrato; es decir que es capaz de ceder electrones. Cuando se oxida
(cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). En la cadena REDOX, el citocromo C actuará como primer aceptor de
electrones que provienen de la p-fenilendiamina. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo
C y el oxígeno, es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Si se administra un inhibidor que impide el
flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena, la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). Si el
inhibidor no impide la oxidación del indicador, entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo
o de la cadena. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción
del 2-6 diclorofenolindofenol, entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la
CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al complejo III de la cadena).

FINALIDAD.
▪ Demostrar que los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio, actúan en las regiones cercanas al complejo I,
complejo III y complejo IV, respectivamente, mediante el uso de indicadores conocidos como 2 – 6 diclorofenolindofenol y p
– fenilendiamina.

COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE.

▪ Comprende como se demuestra la distribución intracelular de las enzimas de oxidorreducción, al identificar los cambios de
coloración de los indicadores redox: 2-6 diclorofenolidofenol y p-fenilendiamina.

MATERIAL Y EQUIPO.
▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas, placa petri.
▪ Material biológico: hígado de rata. Fracción mitocondrial 10%
▪ Reactivos:
• Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4
• Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
• Solución de p-fenilendiamina 1%
• Solución de Malato de sodio 0.1M
• Solución de Rotenona 0.1M
• Solución de Barbiturato de sodio 0.1M
• Solución de Azida de sodio
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PROCEDIMIENTO y RESULTADOS.
1) Rotule previamente los tubos de ensayo y prepare el sistema agregando lo que se indica en el siguiente cuadro:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V VI
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 1.2 1.5 1.0 0.5 0.5 0.5
2-6 diclorofenolindofenol 0.02% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Malato 0.1M -- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Rotenona 0.1M -- -- -- 0.5 -- --
Barbiturato de sodio 0.1 M -- -- -- -- 0.5 --
Azida de sodio -- -- -- -- -- 0.5
Homogenizado Mitocondrial 10% 0.5 -- 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).

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2) Rotule un segundo grupo de tubos de ensayo y prepare el sistema agregando lo que se indica:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
I II III IV V
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 2.0 1.5 1.0 1.0 1.0
Azida de sodio -- -- 0.5 -- --
Barbiturato de sodio 0.1M -- -- -- 0.5 --
Rotenona 0.1M -- -- -- -- 0.5
p-fenilendiamina 1% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Homogenizado de mitocondrias 10% -- 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente.
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO.

1) Explique bioquímicamente lo observado en los pasos 1 y 2.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
2) Mediante un mapa mental, identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus
principales características.
3) Grafique en una cadena de óxido reducción biológica, la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento.
4) Grafique los Complejos I, III y IV y esquematice la acción del halotano sobre la cadena respiratoria.
5) Confeccione una lista con 5 ejemplos de situaciones clínicas relacionadas con la inhibición de la cadena respiratoria,
identificando el lugar de la inhibición.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 7ma Edición, Editorial Omega, España, 2018.
3) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007.