1

MÉTODOS
DE
SEPARACIÓ
N
QFB.EBC. DAVID GUSTAVO GARCÍA GUTIÉRREZ
 Generalidades
2

 Separar componentes de una muestra (mezcla)

 Previos a la determinación

 Análisis cualitativo y cuantitativo

 Cromatografía de gases

 Cromatografía de líquidos de alta eficacia

 Cromatografía de fluidos supercríticos

 Electroforesis
 Generalidades
3

 Métodos para el análisis química

 Selectividad
 Especificidad

 Separación del analito de posibles

interferencias
 Métodos clásicos
4

Hasta mediados del siglo XX

 Precipitación
 Destilación
 Extracción

En la actualidad
 Cromatografía
 Electroforesis
5

Introducción a las
separaciones
cromatográficas
 Definición
6

Método físico de separación en donde los

componentes a separar se distribuyen entre dos
fases, una que permanece estacionaria y otra la
atraviesa.
 Historia de la cromatografía
7

 Botánico Mikhail Tswett (Rusia), 1903.

 Cromatografía (chroma-graphein) = Escritura a
color
 Separo pigmentos de extracto de hojas verdes:
 Utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar.
 Una columna de vidrio
 Carbonato de calcio
 Utilizó como detector la simple observación.
 Historia de la cromatografía
8

 Finales de los 30 y principio de los 40 se desarrollo la

técnica.

 1952, Premio Nobel, por sus descubrimientos en este

campo a:
 A. J. P. Martin
 R. L. M. Synge

 Entre 1937 y 1972, doce premios Nobel

 Descripción general
9

Proceso de separación que involucra la interacción de

uno o más solutos y dos fases.

 Fase móvil:
Un gas, líquido o fluido supercrítico que pasa a través de
una fase estacionaria con la que es inmiscible.

 Fase estacionaria
Un sólido o líquido el cual no se mueve fijandose a una
columna o superficie solida.
 Descripción general
10

 La muestras se introduce en la fase móvil

 Es transportada a lo largo de la columna-fase solida
 Las especies de la muestra experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre ambas fases.
 Componentes fuertemente retenidos
 Componentes que se unen débilmente a la f. estacionaria
 A consecuencia de la distinta movilidad
 Los componentes se separan en bandas o zonas discretas
 Estas pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
 Clasificación
11

1. La forma en que se ponen en contacto las fases

 Cromatografía en columna
 Cromatografía en plano

2. Tipo de fases
 Cromatografía de líquidos
 Cromatografía de gases
 Cromatografía de fluidos supercríticos
 Clasificación por mecanismo de separación:
12

 C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad.

 C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.

 C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular.

 C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga

iónica.
 Clasificación por la fase móvil
13

 C. de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas:

 C. gas-liquido
 C. gas-sólido

 C. líquida: la fase móvil es un liquido y puede ser:

 C. liquido-liquido
 C. liquido-sólido
 C. de exclusión
 C. de intercambio iónico

Las sustancias que no pueden ser examinadas son las insolubles y aquellas
que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.
 Clasificación
14
 Teorías
15

El proceso cromatográfico - unión de fenómenos tales como:

 Hidrodinámica,

 Cinética,

 Termodinámica,

 Química de superficie

 Difusión.

Para explicar el comportamiento de los solutos en las columnas:

 Teoría de los Platos Teóricos (Martin & Synge).

 Teoría Cinética (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg &

Sjenitzer).
 Teoría Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).
 Cromatografía de elución en columna
16

 Se introduce en la columna la muestra (t0).

 La introducción de fase móvil hace que la muestra avance
 Tienen lugar el reparto entre la f. móvil y las porciones de f.
estacionaria (t1).
 Las adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de
soluto en una serie de continuas transferencias entre las fases
estacionaria y móvil.
 Cromatografía en columna
17

 La velocidad media a la que migra el soluto depende de

la fracción de tiempo que reside en la f. movil

 Las diferencias de velocidad hacen que se separen los

componentes de la mezcla (t2).

 El aislamiento de las especies se realiza haciendo pasar

suficiente fase móvil hasta que las bandas individuales
salen de ella (t3 y t4).
18
 Cromatografía en columna
19

 Análisis cualitativo
 Tiempo de retención
 Posición en la fase estacionaria tras el periodo de elución.
 No aporta mucha información químicas
 Buen método para evidenciar ausencia de compuestos.
 Información cuantitativa
 Comparación de altura o área del pico con patrones.
 Mediante el método de calibrado y patrones,
 El método del patrón interno, y
 El método de la normalización de las áreas.
 Cromatografía en columna
20

 Durante la elución ocurre la dilución del analito

 Se produce una importante dilución de los analitos (su

concentración disminuye) mientras están siendo
separados.

 El avance por la columna aumenta la distancia entre

las bandas

 Hay un ensanchamiento de ambas bandas

 Cromatografía de elución en columna
21
 Extracción liquido - liquido
22

 Es el reparto preferencial entre dos fases

inmiscibles: F ac y F org,

K = ________

nt = norg + nac

p+q=1
 Distribución binomial
23

# TUBO

Transfer. 0 1 2 3 4
0 1
1 p q
2 q2 2pq p2
3 q3 3pq2 3p2q p3
4 q4 4pq3 6p2q2 4p3q q4
 Ejemplo 1
24

1. Verificar la cantidad de cada soluto en el tubo 1

después de dos transferencias con coeficientes de
distribución:

 KA= 4

 K B= 1
 Ejemplo 2
25

Se considera para el inicio de una extracción múltiple 1

mmol de A y 1 mmol de B, después de 5 transferencias
se vacía el contenido de los tubos 0, 1, 2 en un frasco
así como el contenido 4 y 5 en otro.

 Calcule el contenido de A y B en cada uno de los frascos

 Equilibrios
26

3.12 12.5 18.75 12.5 3.12

3.12 12.5 18.75 12.5 3.12
 Terminología
27

Absorción:
 La retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia
que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma.

Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto.

Adsorción:
 Es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido,
quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial, esta retención superficial puede ser física o química.

C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.

C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.
 Terminología
28

Disolvente : Cualquier fase móvil.

Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.

Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.

Fase estacionaria:
 Material que permanece dentro de la columna cromatográfica

durante la cromatografía y que retiene algún componente de la

muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o
un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.
 Terminología
29

Fase móvil:
 Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa

como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna

cromatográfica y la fase estacionaria.

Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio.

Soporte:
 El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la

fase estacionaria líquida en su sitio.

Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

 Parámetros cromatograficos
30

 Pico de aire

 Línea base

 Altura de pico (h)

 Anchura del pico w (4)

 Área del pico

 Terminología
31

Cromatograma:
 Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentración del
soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido)
se obtiene una serie de picos que representan un grafico denominado cromatograma.

 Grafico útil para el análisis cualitativo y/o cuantitativo.

 La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la
muestra
 Las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada
componente.
 Terminología
32

Tiempo de retención:
 Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la
muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza
el detector;
 Es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna;
 Es el tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico,

 Se representa con el símbolo tR.

 Volumen y tiempo de retención
33

 Volumen de retención, VR: Volumen de fase móvil

requerida para eluir un soluto de la columna

 Tiempo de retención, tR: Tiempo requerido para cada

componente para recorrer toda la columna.
 Volumen y tiempo de retención
34

VR = tR · flujo

tRb
tRa
señal

A B
 Terminología
35

Tiempo muerto tM:

 Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance

el detector;

 Es el tiempo de migración de la especie no retenida;

 Es el tiempo necesario para que, por termino medio, una

molécula de la fase móvil pase a través de la columna
 Terminología
36
 Terminología
37

 La velocidad lineal promedio de migración del soluto es:

 Terminología
38

Velocidad lineal promedio u del movimiento de las

moléculas de la fase móvil es:
Plato teórico
 Sistema “ESTATICO” en equilibrio

 Cada especie presenta un equilibrio entre la fase

móvil y la fase estacionaria

A fase movil  A fase estacionaria

 Terminología
40

Constante de distribución:
 Los equilibrios de distribución suponen la transferencia de una analito entre las
fases.

A móvil ⇔ A estacionaria
 La constante de equilibrio para este proceso se denomina:
 Constante de distribución
 Razón de distribución o
 Coeficiente de distribución
 Mide la distribución del analito entre la fase estacionaria y la fase móvil.

 CS es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria (mol/L)

 CM es la concentración molar en la fase móvil (mol/L)
 Coeficiente de reparto
41

Concentracion del soluto en la fase estacionaria

K
Concentracion del soluto en la fase movil

 K es independiente de la concentración. Puede

afectarse por factores como la temperatura.

Cuando K se incrementa el soluto tarda más

tiempo en pasar a través del sistema
 Factores que influyen en la separación
42

 Valores de K suficientemente diferentes.

 Tener el suficiente # de equilibrios

 Eficiencia en la columna:
 tR mas cortos
 Picos mas angostos
Coeficiente de reparto
L
v tR t0 nsolutoM
  f
u L tR nsolutoT
t0

 f es la fracción de tiempo que el soluto pasa en la fase

móvil.
Puesto que las fases estacionaria y móvil, tienen
volúmenes conocidos; Ve, Vm. A partir de esto, se
puede calcular el coeficiente de partición.
 Coeficiente de reparto
44

 C M VM 
v  u 
 C M VM  C E VE 
 Dividiendo entre: CMVM

 
 1 
v  u 
1  C E V E 
 C M V M 
Coeficiente de reparto
 Como:  
K
C solutoE  1 
C solutoM v  u 
1  K V E 
 VM 

VM  u 
K   1
VE  v 
 Coeficiente de reparto

VM  u 
K    1
VE  v 

 Cuando se incrementa:
VE: Se incrementa la retención.
VM: Disminuye la retención.
Coeficiente de reparto

VM  u 
K    1
VE  v 

 VE y VM, pueden alterarse cambiando el diámetro y la

longitud de la columna
 u y v, puede modificarse al variar el flujo.
 Factor de capacidad
48

 La razón de la cantidad de soluto en la fase

estacionaria y la cantidad en la fase móvil.

 Es característico de un compuesto especifico en

una composición de fase móvil a una temperatura y
en un tipo de columna
 Factor de capacidad
49

nE
k 
nM
 Terminología
50

Factor de retención o factor de capacidad:

 Describe la velocidad de migración de los solutos en la columna. Para una especie
A, el factor de capacidad k’A se define como:

 k’A es el coeficiente de distribución de la especie A,

 VS es el volumen de la fase estacionaria y
 VM es el volumen de la fase móvil.
 Terminología
51

Factor de retención o factor de capacidad:

 Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relación con el tiempo
transcurrido en f. móvil.

 Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, dividido entre
el tiempo de elución de una banda no retenida (k’=0)

 La relación establece cuantos volúmenes muertos (o tm) se necesitan para

alcanzar a Vol. de retención (o tr)

 Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elución es tan rápida que
es difícil determinar con exactitud los tiempos de retención.
 Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retención son
excesivamente largos.
 Factor de capacidad

VE  1 
k  K
VM v  u 
1  k  
 
 1 
v  u 
1  K VE 
 VM  L L
u v
t0 tR
Factor de capacidad

L L  1 
  
tR t0 1  k

tR  t0
k
t0
 Magnitudes corregidas
54

 Tiempo de retención ajustado

t B
señal

t A
tB 
t
tA k  R
t0

t0

0.0
tiempo
1  k ' 3
 Factor de selectividad
55

 Medida de separación relativa entre dos picos

 Medida de la interacción relativa de los solutos con

la fase estacionaria
 Terminología
56

Factor de selectividad:
 El factor de selectividad α de una columna para dos especies:

 KB es el coef. de distribución para la especie mas retenida

 KA es el coeficiente para la menos retenida

 Depende de la naturaleza de la fase estacionaria y móvil, y

 La temperatura de operación de la columna
Factor de selectividad
 Se puede evaluar la selectividad en base a los
tiempos de retención para cada soluto.
t RA  t 0

k 
t0 t RA  t 0 t RA
  A
 
K t RB  t 0

B t RB  t 0 t 
RB

t0

1  2
 Terminología
58

Resolución cromatográfica:
 La resolución cromatográfica RS de una columna es una medida
cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.

 WA y WB son la anchura de los picos A y B.

 Si R > 1.5 la separación de los componentes es completa
 La resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el
número de platos. Una consecuencia negativa es el incremento del tiempo
requerido para la separación.
Resolución
60
 Terminología
61

Eficiencia en cromatografía
 La eficiencia se define en base a dos términos

 1º La altura del plato H

 2º El número de platos N.

 La eficacia de la columna a mayor número de platos, y

 A menor altura de plato.
 Las eficacias en términos de número de platos varían de cientos a miles,
y

 Número de plato teórico
62

 En extracción con disolvente, un plato es representado por

cada equilibrio (extracción).
 En una destilación fraccionada, un plato es representado
por cada destilación.
 En una columna cromatografíca se puede aplicar el
concepto de plato teórico (cada evento de separación
realizado).
 Se puede estimar el número de platos teóricos en la
columna basado en los tiempos de retención y ancho de las
señales de cada compuesto.
 Altura equivalente a un plato teórico
63

 Longitud de columna en que se lleva a cabo una separación.

L
H
N
 Equilibrios
64
 Terminología
65

Número de platos N:
 Terminología
66

 Las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana,

 Definir eficacia de una columna en términos de varianza por unidad de longitud.

 La curva es gaussiana, y la ubicación de L -1σ y L +1σ se indica mediante líneas

verticales discontinuas.
 Número de plato teórico
67

 Método de las tangentes.

2
 tR 
N  16  
 W tan 
 Número de plato teórico
68
 Resolución
70
71
 Teoría de la separación
 Como se lleva a cabo la separación.
 Como son las señales analíticas.

72
 Factor de Asimetría
AF = 1 Pico simétrico
AF = b / a AF > 1 Pico coleado
AF < 1 Pico cabeceado

a b
73 10%
 Factor de asimetría
74

Cs

CM
 Asimetría de la banda
75

 Si k’ es mayor a concentraciones mas bajas de soluto

 La zona de baja concentración del pico eluye mas lentamente.
 Por lo tanto la señal del pico será “coleada”
 Combinación equivocada de muestra y empaque de columna

 El tipo inverso de asimetría se conoce como “cabeceado”

 k` es mayor a concentraciones mas altas de soluto.
 Solución :
 Disminuir el tamaño de la muestra hasta que las bandas sean simétricas y
tR constantes.
 Resolución
76

 Ecuación fundamental de la resolución

1
1    1  k    L  2

R    
4     1 k   H

1    1  k  
  N 2
1
R  
4     1 k 

Donde k’ es un promedio entre k’ 2 y k’ 1

si k’ 2  k’ 1, entonces k’ = k’2
 Eficiencia de la columna
77

 Empleo de columnas mas largas incrementamos N

 Trabajar con condiciones optimas de flujo y temp.

 k incrementa disminuyendo la temperatura

 Alfa se aumenta:
 Sustituyendo la fase estacionaria.
 Variables cinéticas
78

Variable Símbol Unidade

o s

Vel. Lineal de la fase móvil u cm/s

Coeficiente de difusión en la fase móvil Dm cm2/s

Coeficiente de difusión en la fase estacionaria Ds cm2/s

Factor de retención k’ -

Diámetro de la partícula de relleno dp cm

 Variables cinéticas
79

 Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

H = mm

v = cm/s
 Variables cinéticas
80

 Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)

 Velocidades lineales menores en líquidos.

 Las separaciones cromatograficas en gases son en menor tiempo

 Las alturas de plato son por lo menos un orden de magnitud menor en

líquidos.

 Columnas
 En líquidos 25 a 50 cm (caída de presión)
 En gases 50 m o más
 Teoría Cinética
81

J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer:

Dinámica de la separación.

Ecuación de van Deemter

B B
H  A   Cu  A    CS  CM  u
u u
 Difusión de Eddy
82

• Termino del camino libre

• Difusión en remolino

• Difusión parasita

B
H  A  Cu
u
 Difusión parásita
83

H =Ncm
A  2d p
l: Constante del empaque dada por la calidad del relleno
dp: diametro de la partícula

v
 Difusión longitudinal
84

B
H  A  Cu
u
 Difusión longitudinal
85

H =Ncm g: Cte. del empaque, factor de obstrucción.

Columnas rellenas = 0.6
Columnas capilares = 1

DM: Difusión de soluto en la f. móvil

Velocidad de migración por gradiente

A
B/v
v

B  2D M
 Resistencia a la transferencia de masa
86

B
H  A   Cu
u
 Transferencia de masa
87

HN
= cm
df: Grosor de la fase estacionaria.

DE: Coef. de difusión del soluto en la fase estacionaria

Cv

A
B/v
v
 8 k d 2
f

C   
  1  k   D E 
2
 Efecto global
88

H =N
cm
B
H  A   Cu
u
Global

H óptimo Cu
A
B/u
vv = cm/s
Vel. lineal
óptima
 Teoría Cinética
89

J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer:

Dinámica de la separación

2 D M  8 k d  2

H  2 d p   u
f

  1  k   D E 
2
u
 Análisis cualitativo y cuantitativo
90

 Cualitativo
 Parámetros de retención
 Detectores selectivos
 EM, FTIR, RMN, UV

 Cuantitativo
 Altura de pico
 Área de pico

Buena resolución
Respuesta en el rango de linealidad del detector
 Análisis cualitativo y cuantitativo
91

 Análisis cuantitativo

 ¿ Altura de pico o área de pico?

 El área debe utilizarse para picos con colas pronunciadas

 Ambos son imprecisos, con un volumen de inyección
irreproducible.
 La altura de pico puede usarse si el ancho del pico de los
compuestos es el mismo para estándares y muestra.
 Análisis cuantitativo
92

 Normalización de áreas

 Normalización de áreas con factores de respuesta

 Estándar externo

 Estándar interno
 Análisis cuantitativo
93

 Normalización de área o altura de pico

 Limitación: todos los componentes deben eluir.

A1
x%   100
A1  A2  A3  An
 Análisis cuantitativo
94

 Normalización de área con factor de respuesta

conc
F 
area

F1 A1
x%   100
F1 A1  F2 A2  F3 A3  Fn An