Crecimiento y Cultivo vegetal Técnicas de Laboratorio

Trabajo Práctico de Laboratorio N°1

Preparación de medios de cultivo

Objeto de la experiencia
Preparación de medio de cultivo específico para células vegetales indiferenciadas y
raíces transformadas. Se utilizará la formulación propuesta por Murashige y Skoog, Plant
Physiol. 1962, 15, 473-497.

Procedimiento

1. Preparación de soluciones stock de almacenamiento

1.1. Solución stock de macronutrientes
Pesar
NH4NO3 16,5 g
KNO3 19 g
CaCl2.2H2O 4,4 g
MgSO4.7H2O 3,7 g
KH2PO4 1,7 g

Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 100X.

1.2. Solución stock de micronutrientes

Pesar
KI 166 mg
H3BO3 1240 mg
MnSO4.4H2O 4460 mg
ZnSO4.7H2O 1720 mg
NaMO4.2H2O 50 mg
CuSO4.5H2O 5 mg
CoCl2.6H2O 5 mg

Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 5X.

1.3. Solución stock de hierro

Pesar
FeSO4.7H2O 5560 mg
Na2EDTA 7400 mg

Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 1000 mL. De esta manera se obtiene una
solución 5X.

1.4. Solución stock de vitaminas

Pesar
Ácido nicotínico 100 mg
Piridoxina.HCl 100 mg
Tiamina.HCl 100 mg
Glicina 400 mg
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Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 200 mL. De esta manera se obtiene una
solución 1X.

1.5. Solución stock de vitaminas (MSRT -Medio de cultivo para Raíces Transformadas)
Pesar

Piridoxina 10 mg
Nicotinamida 20 mg
Tiamina 10 mg
Ac. Fólico 5 mg
Cianocobalamina (Vit B12) 0,015 mg

(Nota: Se prepara una solución con 1,5 mg/ml y se colocan 0,01 ml los cuales contienen 0,015
mg )

Riboflavina 5 mg
Biotina 10 mg
Colina 10 mg
Pantotenato de calcio 10 mg

Disolver en H2O destilada y llevar a volumen de 10 mL. De esta manera se obtiene una solución
1X.

1.6. Solución stock de reguladores de crecimiento

Las diferentes auxinas y citoquininas se disuelven en agua bidestilada de manera de
obtenerse soluciones stock con una concentración de 200 ppm. Las drogas básicas pueden
acidificarse con HCl 0,1 N y las drogas ácidas alcalinizarse con NaOH 0,1 N para favorecer su
disolución.
Un ejemplo de preparación es pesar 40 mg de droga sólida y disolver en H2O
bidestilada para llevar a un volumen final de 200 mL.

Todas las soluciones stock deben conservarse en heladera y deber controlarse que no haya
habido contaminación o deterioro de las mismas antes de preparar los medios de cultivo. En
caso de observarse desarrollo microbiano o precipitación de sus componentes, deben ser
descartadas y se procederá a preparar nuevas soluciones de almacenamiento.

2. Preparación de medios de cultivo

2.1. Medir los volúmenes de las soluciones stock correspondiente al volumen de medio de
cultivo a preparar

2.2. Pesar los componentes sólidos. Por cada litro de medio MS, pesar

sacarosa 30 g
mioinositol 100 mg

2.3. Mezclar y homogeneizar los componentes líquidos y sólidos en las tres cuartas partes del
volumen total de medio a preparar.

2.4. Adicionar los reguladores de crecimiento

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Medio ANA KIN IBA BAP 2,4-D

ANA 0,5 0,5 ppm - - - -
ANA/KIN 2 ppm 0,1 ppm - - -
IBA/BAP - - 4 ppm 4 ppm -
2,4 D - - - - 1 ppm
MSRT - - - - -

2.5. Ajustar el pH (5,6 – 5,8) con el empleo de soluciones de KOH 0,5 N y/o HCl 0,5 N.

2.6. Ajustar al volumen final.

2.7. Agregar el agente solidificante en caso de preparar medio sólido, a razón de 9 – 10 g de

agar por litro de medio de cultivo.

2.8. Fraccionar en erlenmeyers en caso de medio líquido o fundir el agar por calentamiento a
baño maría y una vez fundido fraccionar en tubos o frascos de acuerdo al propósito deseado.

3. Esterilización
Esterilizar por calor húmedo en autoclave a 2 atm de presión (PEb. del agua = 121ºC) durante
15 minutos. No exceder dicho tiempo ya que el medio contiene una elevada proporción de
azúcar que puede caramelizarse y vitaminas que pueden sufrir descomposición.

4. Fraccionamiento
En caso de tratarse de medio sólido, se realiza el fraccionamiento en placas de Petri y cabina
de flujo laminar y se deja solidificar.