UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO - FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA

MANUAL DE PRACTICAS INMUNOLOGIA BASICA

PRÁCTICA 01

BIOSEGURIDAD Y SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos,

especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes biológicos, los
cuales son conocidos como Niveles de bioseguridad, la clasificación de cada
laboratorio identifica el riesgo biológico que representan para la salud los agentes que
ahí se manejan.

Nivel de Bioseguridad 1: En este nivel se trabaja con agentes que presentan un

peligro mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se
requiere equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. El
laboratorio no está necesariamente aislado de las demás instalaciones del edificio. El
trabajo se realiza generalmente en mesas de trabajo abiertas. Por lo general, los
materiales contaminados se desechan en recipientes de residuos abiertos. Incluye
varios tipos de bacterias y virus como la hepatitis canina, Escherichia coli no patógena,
Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis,
Sacharomyces cerevisiae, Penicillium roqueforti, así como algunos cultivos de células.

Nivel de Bioseguridad 2: En él se manejan agentes de peligro moderado hacia el

personal y el ambiente y el personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el
manejo de agentes patógenos como las bacterias Bordetella pertussis, Clostridium
botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Streptococcus, Micobacterias oportunistas, Haemophilus
influenzae, Yersinia enterocolitica, Salmonelas gastroenteríticas, Shigella, Legionella,
Borrelia, Neiserias patógenas, Vibrio, Treponema pallidum y virus como Adenovirus,
Parvovirus B19, Rotavirus, Virus de la hepatitis A, Virus de la gripe, Virus del sarampión,
Virus de las paperas, Virus de la rubéola. . El acceso al laboratorio es restringido
cuando se está realizando algún trabajo. Se toman precauciones extremas con
instrumentos punzocortantes contaminados. Ciertos procedimientos en los cuales
pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en gabinetes de trabajo
biológico.

Nivel de Bioseguridad 3: Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clínicos

de diagnóstico, laboratorios universitarios de investigación, en el cual se realiza trabajo
con agentes exóticos o que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como
resultado de la inhalación o exposición a los mismos, como las bacterias Bacillus
anthracis, Brucella, Escherichia coli (verotoxigénica), Francisella tularensis,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Rickettsias, Salmonella ser. Typhi,
Shigella dysenteriae ser. 1, Yersinia pestis; y los virus Virus de la encefalitis de
California, Virus de la encefalitis equina americana, Virus de la estomatitis vesicular,
Virus de la hepatitis B, Virus de la hepatitis C, Virus de la hepatitis D, Virus de la fiebre
amarilla, VIH. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales y todos
los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección. El
personal de laboratorio tiene una formación específica en el manejo de patógenos y
agentes potencialmente letales, y son supervisados por científicos competentes con
experiencia en el trabajo con estos agentes. El acceso al laboratorio está restringido.

Nivel de Bioseguridad 4: Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes
biológicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que además son un
riesgo para la vida. Por lo regular los científicos que trabajan aquí, utilizan trajes

1
especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que además tienen una leve
sobrepresión para evitar que entren partículas infecciosas al mismo si es que éste
llega a desgarrarse. Además, las instalaciones están en un edificio separado o en un
área controlada dentro de un edificio, que está completamente aislado de las demás
áreas del edificio. Las enfermedades infecciosas que se manejan en el nivel 4 son:
Virus de la viruela, Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo), Virus de
Marburg, Virus Ébola.

OBJETIVO GENERAL
 Aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunología.

Objetivos Específicos.
 Familiarizar al estudiante con las normas de bioseguridad en el laboratorio de
inmunología.
 Hacer conocer la importancia de los riesgos biológicos del manejo de material
infeccioso.
 Aplicar los conocimientos en la resolución de casos de accidente ocupacional
con material infeccioso.

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

1. Requisito indispensable: Antes de realizar cada práctica leer cuidadosamente

el protocolo de la práctica para familiarizarse con el trabajo que va a desarrollar.
Al conocer el protocolo disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y
además puede aprovechar el tiempo de manera eficaz.
2. Prohibido: Comer, beber, fumar y distraer al profesor a la hora de la práctica.
Prohibido el acceso a toda persona ajena al área.
3. Protección: Llevar el equipo de protección personal necesario. Esto garantiza
que cualquier accidente que pueda ocurrir sea de menor gravedad, de no acatar
las reglas no se permitirá acceso a la práctica.
4. Material y Equipo: Debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios
para la práctica que va a desarrollar. Ser cuidadoso con todo el material y
equipo que utilice para evitar accidentes y deterioro del mismo en las prácticas.
5. Limpieza: Dentro del área que se va a trabajar se comienza limpiando el área
de trabajo y se repite este procedimiento después de que se haya terminado. El
material de desecho depositarlo en el lugar que corresponde y el material
reutilizable lavarlo y desinfectarlo.
6. Higiene: Durante la sesión de trabajo lavarse las manos con agua y jabón
antes de hacer cualquier procedimiento y al finalizar repita el mismo
procedimiento para mantener buenas condiciones higiénicas.
7. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacíos, jeringas, cubre
bocas, portaobjetos, cubreobjetos, etc., no reciclar y desecharlos.
8. Indisciplina: Se sancionará con la expulsión parcial o total del alumno, según
el caso lo requiera.
9. Responsabilidades: En caso de accidente o lesión, avisar inmediatamente al
profesor o responsable de la práctica para que pueda auxiliar con rapidez y
eficacia al alumno.
RECOMENDACIONES:

1. Todo material biológico humano se manipula como si fuera potencialmente

infeccioso.
2. Protección personal: bata y guantes. Las heridas se traen cubiertas con
apósitos impermeables. La ropa de calle es un elemento adicional de
 protección, se desaconseja el pantalón corto o el calzado abierto.
3. El cabello largo debe estar atado atrás o arreglado de manera que no entre
en contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el
equipo.
4. Para trabajar, se colocan las muestras, reactivos etc. en la parte delantera de
la zona de trabajo, así se evita golpearlos con los brazos en un descuido.
5. Antes de utilizar un reactivo, se observa si tiene símbolos y avisos sobre su
toxicidad y riesgo de manejo (generalmente en recuadros de color naranja).
6. En el laboratorio no se debe comer, beber, aplicarse cosméticos u oler
reactivos o muestras directamente.
7. No arrojar a la papelera o desagüe material usado sin consultar al profesor.
Los residuos y el material punzante (puntas de pipeta, agujas, hojas de
bisturí, cubreobjetos y similares) se desechan en los contenedores repartidos
por las mesas.
8. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las áreas que no son de
laboratorio (pasillos, biblioteca, etc.).
9. Las manos deben ser lavadas después que se han quitado los guantes y
antes de dejar el laboratorio, así como en cualquier momento después de
manipular material conocido o sospechoso de estar contaminado.
10. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y después de
cualquier salpicadura de material potencialmente infeccioso.
11. Todo material contaminado, sólido o líquido, debe ser descontaminado antes
de descartarlo o de reusarlo.

ACCIDENTES:

1) Las salpicaduras o derrames en la piel intacta se deben lavar

inmediatamente con jabón y agua abundantes.
2) Las salpicaduras a mucosas (ej. a la boca), deben lavarse con agua corriente
durante 15 minutos. Las salpicaduras a los ojos se lavarán de inmediato con
frasco lavaojos o con agua corriente manteniendo los ojos muy abiertos con
los dedos.
3) Las inoculaciones percutáneas (ej. arañazo o corte con instrumental usado)
deben lavarse con agua y jabón, dejar, en su caso, fluir la sangre libremente
3 minutos, desinfectar con povidona yodada y cubrir con un apósito
impermeable. En todos los casos se comunicará el incidente al profesor.

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS (RPBI)

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias,
hongos, virus, parásitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos
nocivos para la salud y el medio ambiente.

Los RPBI se clasifican en:

1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc.
2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas de
cultivo, etc.
3. Residuos patológicos: residuos de tejidos, órganos, partes y fluidos corporales,
etc.
4. Residuos no anatómicos derivados de la atención a pacientes y de los
laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc.
5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas, jeringas,
pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos, etc.
Color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Sólidos Bolsas de plástico Rojo
Cultivos y cepas de Líquidos Recipientes Rojo
agentes infecciosos. herméticos
Residuos no
anatómicos
Patológicos Sólidos Bolsas de plástico Amarillo
Patológicos Líquidos Recipient Amarillo
es
herméticos
Objetos Sólidos Recipientes rígidos Rojo
punzocortantes

SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO

Se entiende por señalización de seguridad y de salud a la que referida a un objeto,

actividad o situación determinadas, proporcione una indicación o una obligación relativa
a la seguridad o la salud en el trabajo mediante señal en forma de panel, un color, una
señal luminosa o acústica, una comunicación verbal o una señal gestual, según
proceda. Pictograma es la imagen que describe una situación u obliga a un
comportamiento determinado utilizado sobre una señal en forma de panel o sobre una
superficie luminosa. En principio, los lugares de trabajo deben ser señalizados con los
pictogramas que se ajusten a las características de las tareas que se lleve a cabo en el
laboratorio/ taller.

Requisitos de utilización

 La altura y posición de las señales deberá tener en cuenta su relación con el

ángulo visual.
 El lugar del emplazamiento de la señal debe estar iluminado, ser accesible y
fácilmente visible.
 Las señales deben retirarse cuando deje de existir la situación que las justifica.

CLASIFICACIÓN DE PICTOGRAMAS:

1. Señales de advertencia
 Forma triangular.
 Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros.

2. Señales de prohibición.
 Forma redonda
 Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos

3. Señales de obligación.
 Forma redonda
 Pictograma blanco sobre fondo azul

4. Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios.

 Forma rectangular o cuadrada
 Pictograma blanco sobre fondo rojo.

5. Señales de salvamento o socorro.

 Forma rectangular o cuadrada.
 Pictograma blanco con fondo verde.
 TAREAS DE LABORATORIO:
1. Esquematizar dos pictogramas de cada uno de los 5 tipos expuestos

a. SEÑALES DE ADVERTENCIA: b. SEÑALES DE PROHIBICIÓN:

 c. SEÑALES DE OBLIGACIÓN:

d. SEÑALES DE RELATIVAS A LOS EQUIPOS DE LUCHA CONTRA INCENDIOS.

e. SEÑALES DE SALVAMENTO O SOCORRO:

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2. De forma sencilla esquematice el laboratorio con sus pictogramas y diga el

significado de cada uno. Sugiera cambios.

6
 PRÁCTICA 02

TOMA DE MUESTRA PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Y PLASMA

INTRODUCCIÓN

El sistema hematopoyético (Hema = sangre, poyesis = producción, fabricación) es el

sistema encargado de la formación de la sangre. La sangre es un tejido líquido,
compuesto por agua y sustancias orgánicas e inorgánicas (sales minerales) disueltas,
que forman el plasma sanguíneo y tres tipos de elementos formes o células
sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas.

Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas que conforman la sangre se
producen en la parte esponjosa (médula roja) de algunos huesos del esqueleto (esos
son: el esternón, los huesos del cráneo, las costillas, el hueso ilíaco y las
terminaciones de los huesos de los miembros superiores e inferiores.

En la médula ósea roja de los huesos se encuentran las células hematopoyéticas

pluripotenciales de las que derivan todas las células de la sangre. Hasta los 5 años de
edad estas células tienen su origen en, prácticamente, todos los huesos del cuerpo.
Después de los 20 años, los glóbulos rojos, blancos y plaquetas son producidos
principalmente por la médula de los huesos planos, como las vértebras, el esternón y
las costillas.

Se puede realizar un examen físico o químico de la sangre, para lo cual se la obtiene

por punción venosa o por punción del pulpejo del dedo (sangre capilar) con lanceta
estéril. Para casi todo el trabajo hematológico se utiliza sangre total. Ello exige el uso
de anticoagulantes, los cuales impiden que el calcio actúe en la coagulación, sea
precipitándolo como sal insoluble (oxalatos) o fijándolo en forma no ionizada (citrato,
EDTA). La heparina actúa como agente antitrombínico, o sea neutraliza a la trombina.
Así mismo, casi todas las determinaciones bioquímicas en el laboratorio utilizan
suero, el cual se obtiene tomando la muestra en un tubo de ensayo y se lo deja
coagular, para la separación del suero.

Usualmente en adultos se utilizan las venas del pliegue antecubital del brazo, pero
también pueden ser otras zonas como, por ejemplo: del antebrazo, dorso de la mano,
dorso del pie, etc.

La práctica tiene por objetivos:

1. Adiestrar al alumno en la extracción de muestras de sangre del antebrazo

para la obtención de sangre total, suero y/o plasma.
2. Realizar extendidos sanguíneos en láminas portaobjetos.

MATERIAL Y MÉTODOS
1. Equipo necesario para la venopunción: Equipo Vacutainer.
 Tubos de vacío diseñados para llenarse con un volumen predeterminado de
sangre por medio de vacío, esto garantiza una adecuada relación entre sangre
y anticoagulante. Los tapones de goma están codificados por color de acuerdo
con el aditivo que contienen así, por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son
los más utilizados para hematología rutinaria y los tubos celestes (citrato) para
pruebas de coagulación.
  Agujas especiales para adaptador.
 Adaptador para tubos de vacío.
 Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
 Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre
para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de 0.8mm (21G) para
evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-19G) se
utilizan normalmente para punción venosa en adultos.
 Torniquete: Generalmente una liga plana de látex.
 Alcohol: Etílico o isopropílico al 70%.
 Algodón
 Gasas y/o vendas adhesivas
 Dispensador de agujas

2. Etiquetado de los tubos

Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de

los análisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el
etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analítica son:
 Nombre o iniciales del paciente
 Número de identificación del paciente
 Fecha y hora de la toma de muestra
 Iniciales del flebotomista

3. Punción venosa

La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las
pruebas necesarias en hematología. Las venas de elección suelen ser las de
la cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena cefálica y la vena basílica)
porque resulta fácil acceder a ellas.

Preparación del paciente

 Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la

existencia de problemas hemorrágicos o de circulación, o alergias.
 Evite puncionar en un área con hematoma, fístulas, quemaduras,
escoriaciones de la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado
mastectomía reciente.
 Avisar al paciente que al introducir la aguja sentirá dolor.
 Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba.

4. Punción capilar

Es utilizada para extraer pequeñas cantidades de sangre en determinaciones

de hemoglobina, hematocrito y frotes periféricos. Hay dos lugares de donde
realizar esta punción: el lóbulo de la oreja, la yema del dedo.

Metodología
 Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja.
 Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una
lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm.
 Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en
un microtubo y prepare las laminillas con esa muestra.
 5. Algunos anticoagulantes utilizados en el laboratorio
 Oxalatos: Los oxalatos de amonio y potasio se utilizan en mezcla de 3
partes del primero por 2 del segundo. La sal de amonio aumenta el
volumen de los GR y la de potasio lo disminuye, por tanto, es muy usado
en hematología. El oxalato de potasio sólo se utiliza en bioquímica.
 Citratos: Se utiliza la sal disódica al 3.8% (peso x volumen) en proporción
de una parte de la sal por nueve de sangre.
 Dextrosa-citrato ácida: En las transfusiones de sangre y en pruebas
hematológicas para preservar los antígenos de los GR.
 Sequestrene: Sal dipotásica o disódica del EDTA. Por quelación impide
que se ionice el calcio por lo que ejerce una acción anticoagulante muy
intensa.
 Fluoruro: Se combina con el calcio impidiendo su acción. Puede
usarse también como conservador cuando la muestra tenga que ser
guardada.
 Desfibrinación: Se lleva a cabo en un matraz utilizando perlas de vidrio, a
las cuales queda adherido la fibrina formada por coagulación. Este proceso
es útil para el estudio de GB, GR y plaquetas. Se obtiene también buena
cantidad de suero.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el calibre de la aguja utilizada para el procedimiento de venopunción?
- Para colección de sangre para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de
0.8mm (21G) para evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-
19G) se utilizan normalmente para punción venosa en adultos.

2. ¿Por qué se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extracción sanguínea?

- Generalmente una liga plana de látex, para diferenciar una vena o vaso para extraer sangre.

3. ¿Cómo se debe de introducir el bisel de la aguja y ¿Por qué?

- Introducir la aguja en ángulo de 45 grados con el bisel hacia arriba y luego girar para que el
bisel mire hacia abajo, el bisel nos habla del ángulo de la punta de la aguja, que es el que
va a determinar el tipo de corte que se producirá en el momento en el que se atraviese la
piel.

4. Defina que es un anticoagulante

- Un anticoagulante es una sustancia endógena o exógena que interfiere o inhibe la
coagulación de la sangre, creando un estado antitrombótico o prohemorrágico.

5. ¿Qué diferencia hay entre suero y plasma?

- El plasma es la parte libre de células de la sangre y por lo general es tratado con
anticoagulantes. El suero es la parte líquida de la sangre después de la coagulación.
Contienen 6-8% de las proteínas que forman la sangre. Están más o menos, igualmente
divididas entre la albúmina y las globulinas de suero
6. ¿Qué hacer en caso de no tener vena visible para la extracción sanguínea?

- Se hace la aplicación del torniquete 5-10 cm por encima del punto de punción y se utiliza
alcohol para la dilatación de las venas. Colocación en declive del miembro a puncionar.
7. Componentes de los tubos vacutainer que se muestran y sus usos:

Contenedores con coagulantes:

- Tapón amarillo o 'atigrado' rojo/negro: Con agentes coagulantes y gel para

separar el suero.
- Tapón rojo, tubos PLÁSTICOS: Contienen agentes coagulantes y se utiliza cuando
se requiere suero.
- Tapón naranja o gris/amarillo 'atigrado': Contiene trombina, un coagulante rápido
que es utilizado para análisis de urgencia en el suero.

Contenedores con anticoagulantes:

- Verde - Con heparina sódica o litio heparina usada para análisis en plasma.
- Verde claro o verde/gris 'atigrado': Para determinaciones químicas en plasma.
- Violeta o lavanda - con EDTA (la sal de potasio, o K2EDTA). Éste es un
anticoagulante potente por lo que dichos tubos se utilizan para el conteo sanguíneo
completo y elfrotis. Los tubos con tapones de color lavanda se utilizan cuando se
necesita sangre entera. Puede también utilizarse para procedimientos de los bancos
de sangre como tipo sanguíneo y seguridad. Para otros procedimientos de los
bancos de sangre, como por ejemplo para estudios de compatibilidad sanguínea,
deben utilizarse los tubos con tapón rosa.

-
- Gris - Estos contienen fluoruro y oxalato. El fluoruro evita que las enzimas en
sangre trabajen, y así un sustrato como la glucosano se consuma. El oxalato es un
anticoagulante.
- Celeste - Contiene una medida de citrato. Citrato es un anticoagulante reversible, y
estos tubos se usan para ensayos de coagulación. Ya que el citrato líquido diluye la
sangre, es importante que el tubo se llene bien para que la concentración sea la
esperada.
- Azul oscuro - Contiene heparina sódica, un anticoagulante. También puede
contener EDTA como aditivo. Estos tubos se utilizan para buscar trazas de metales.
- Rosa - Similar a los tubos violetas (ambos contienen EDTA) estos se usan en los
bancos de sangre
COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA TOMA DE MUESTRA
 PRÁCTICA 03

EL HEMOGRAMA

INTRODUCCIÓN

Erlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina, aunque sus

preparados ya no se utilizan en la actualidad. Lanner, en 1 889, encontró que el
precipitado obtenido por la mezcla de eosina y azul de metileno podía disolverse
en alcohol metílico para formar un colorante útil, que combinaba algunas
propiedades de los dos colorantes iniciales.

Romanowsky, 1 890, encontró que al mezclar una solución de azul de metileno

madura, con eosina (policromía), y disolviendo el precipitado en alcohol metílico,
se obtenía un colorante de uso más amplio que el de Lanner, que podía teñir los
núcleos celulares y los gránulos de las plaquetas (a los que la mezcla de Lanner
no coloreaba).

Colorantes modernos a los de Romanowsky; por ejemplo, los colorantes de

Wright, Leishman, etc., son semejantes, en principio, al método original de
Romanowsky, la diferencia principal estriba en el método de obtención de la
policromía del azul de metileno.

El estudio cito morfológico de extendidos coloreados de la sangre pone de

manifiesto el producto final de un maravilloso y complicado proceso de
maduración que tiene lugar en el sistema hematopoyético, y que se encuentra
representado por los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas.

Cada profesional de la salud debe entrenarse y aprender a observar todos los

elementos del frotis sanguíneo, mientras lleva a cabo el recuento diferencial.
Debe formar el hábito de verificar en cuanto al tamaño, forma y concentración de
hemoglobina en eritrocitos, además si existe un grado importante de anisocitosis o
poiquilocitosis, hipocromía, microcítocis, macrocitocis e hipercromía aparente, etc.
En cuanto a plaquetas se debe tener en cuenta si se encuentran en cantidades
normales (de 3 a 8 por 100 glóbulos rojos), si son normales o si hay formas
gigantes o extrañas. Asimismo, en cuanto a leucocitos se debe considerar si son
maduros o atípicos; si su número es normal, aumentado (leucocitosis) o
disminuido (leucopenia).

En los frotis muy gruesos, los leucocitos son pequeños, difíciles de teñir, siendo
imposible su reconocimiento. Aun en los mejores frotis, a causa de la diferencia
de tamaño, densidad, etc., los leucocitos muestran una distribución particular. Los
monocitos grandes y los polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al
final de la extensión, mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en
forma más uniforme en la parte media.

El hemograma consta de 2 partes: recuento leucocitario y la fórmula leucocitaria.

El recuento leucocitario consiste en determinar el número total de leucocitos x
mm3 y, la fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las
distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los
porcentajes puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos
por mm3 de sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.
 Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos es
de 20 000, entonces el valor absoluto de neutrófilos segmentados sería:
60/100 x 20 000 = 12 000.

La práctica tiene por objetivos:

a. Hacer recuentos de leucocitos y plaquetas.
b. Colorear extendidos de muestras de sangre.
c. Reconocer células sanguíneas y establecer la fórmula leucocitaria

MATERIAL Y MÉTODOS:

1. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS:

MATERIAL:
 Sangre total (con anticoagulante).
 Láminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO:

 Preparar una lámina cuyo ancho se ha reducido unos 5 mm. y que servirá
como "lámina extensora".
 Colocar a 1 cm. del extremo de una lámina bien limpia y seca, una gota
pequeña de sangre total o directamente de la aguja, jeringa o del dedo; por
delante de ella colocar un extremo de la lámina extensora en ángulo de 30º y
retroceder hasta que toque la gota que se extenderá a lo ancho de la primera
lámina, luego deslizar la lámina extensora siempre en ángulo de 30º, en forma
rápida y uniforme hacia el otro extremo.
 Si el ángulo entre las láminas es mayor, el frotis será más grueso y viceversa.
 Dejar secar las láminas a temperatura ambiente y rotular.

2. COLORACIÓN DE EXTENDIDOS SANGUÍNEOS: (Método de Wright)

PROCEDIMIENTO:

 El frotis bien seco y rotulado se coloca sobre la gradilla de coloración.

 Cubrir la lámina con un volumen de colorante y dejar por un minuto (4-5 gotas)
 Diluir el colorante con dos volúmenes de agua tamponada pH. 6.4, mezclar
bien, observándose la formación de una escarcha metálica y dejar por 6
minutos.
 Lavar con agua corriente y dejar secar colocando la lámina verticalmente.
NOTA: Los tiempos indicados pueden variar de acuerdo a la antigüedad del
colorante.

3. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS
SANGUÍNEAS: MATERIAL:

 Láminas con extendidos sanguíneos coloreados.

 Microscopio óptico.

PROCEDIMIENTO:

 Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de aceite de

cedro y observar con objetivo de inmersión.
 Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.
4. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

MATERIAL:

 Hemocitómetro (Cámara de Neubauer)

 Pipeta de glóbulos blancos (de Thoma)
 Diluyente: Líquido Turk (Ácido acético 2-3% más gotas de violeta de genciana:
La solución hipotónica del ácido acético destruye los GR y la violeta de
genciana hace observar mejor los GB, a los que tiñe ligeramente).

PROCEDIMIENTO:

 Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.

 Llenar con sangre la pipeta de GB hasta la marca de 0, 5 y limpiar la punta.
 Introducir la pipeta en el diluyente de glóbulos blancos y llenar la pipeta hasta la
marca de
11. Hacer rotar para que se movilice la perla mezcladora.
 No permitir que ingrese aire ni se escape sangre.
 Tapar ambos extremos de la pipeta y mezclar manualmente por 1 minuto.
 Preparar la cámara de Neubauer con su laminilla cubre-cámara.
 Agitar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas para luego colocar una gota pequeña
cerca de un extremo abierto de la cámara, para que se llene por capilaridad.
 Dejar en reposo por 3 minutos:
 Enfocar la cuadrícula de Glóbulos blancos y luego con el objetivo de 40X
contar en los cuatro cuadrados grandes angulares.
 La enumeración incluye las células que cubren o tocan por dentro o por fuera
las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadrado grande de recuento y
no se consideran las de los limites inferior y derecho.

Nº de Leucocitos = G. blancos contados en 4 cuadrados x mm3

Áreas contadas X altura cámara X dilución de sangre

Nº de Leucocitos = Glóbulos contados

4 x 1/10 x 1/20
Nº de Leucocitos = Glóbulos contados x 50 x mm3

VALORES NORMALES: de 5 000 a 1 0 000 x mm3

5. RECUENTO DE PLAQUETAS: (método indirecto)

PROCEDIMIENTO:

 De la lámina de hemograma contar 20 campos con más o menos 100 GR/campo.

 Hacer recuento de plaquetas en cada campo.
 Sacar promedio de plaquetas por campo, que corresponde al número de
plaquetas por 100 glóbulos rojos.
 Confrontar con la Tabla de Relación entre Hematocrito y Número de glóbulos
rojos y con dichos datos, calcular el número de plaquetas por mm3

EJEMPLO: Se observa 10 plaquetas por 100 glóbulos rojos como promedio:

Si el paciente tiene 35% de Hematocrito, según la tabla te corresponde 3'850

000 de glóbulos rojos. Por tanto, el número de plaquetas se obtiene:
 Si en 100 G. R----------------------10 plaquetas
En 3' 850 000 G.R. x mm3-------------------X

X = 3' 850 000 G.R. por mm3 X 10 plaquetas

100 G.R.

X = 385 000 plaquetas x mm3

TABLA: RELACIÓN ENTRE HEMATOCRITO Y NÚMERO DE GLÓBULOS ROJOS

(PARA RECUENTO DE PLAQUETAS)

Hto. (%) Nro. G.R. Hto. (%) Nro. G.R.

28 3'140 000 41 4'510 000

30 3'330 000 42 4'620 000
31 3'410 000 43 41730000
32 3'520 000 44 4'840 000
33 3'630 000 45 4'950 000
34 3'740 000 45,5 5’000,000
35 3'850 000 46 5'060 000
36 31960000 47 51170000
37 4'070 000 48 51280000
38 4'180 000 49 5'390 000
39 4'290 000 50 5'500 000
40 4'400 000

Fórmula Leucocitaria:

Como los granulocitos generalmente están en los márgenes del extendido y los
linfocitos en el centro, se recomienda el método utilizado por Schíling, que consiste en
tomar cuatro puntos marginales distintos recorriendo el campo en zig-zag desde el
borde hacia la parte central, y contar 25 a 50 elementos en cada uno de los cuatro
puntos.

Tabla: Fórmula leucocitaria normal

TIPO CELULAR %

Granulocito Neutrófilo abastonado 2a5

Granulocito Neutrófilo segmentado 45 a 65

Granulocito Eosinófilo 1a4

Granulocito Basófilo 0a1

Linfocitos 20 a 45

Monocitos 4a8
Estas cifras pueden variar por condiciones climáticas, altura, raza, emociones, dolor,
edad, etc. Conociendo la relación numérica y la cantidad total de leucocitos por
milímetro cúbico, es fácil establecer la fórmula absoluta de cada tipo celular de la
siguiente manera:

Fórmula absoluta = Recuento global leucocitario x % variedad de célula.

100

CÁMARA DE NEUBAUER

PIPETAS PARA GLÓBULOS ROJOS Y BLANCOS

TÉRMINOS USADOS:

 Leucopenia: Disminución del número total en el recuento de leucocitos.

 Leucocitosis: Aumento del número total en el recuento de leucocitos.
 Neutropenia: Disminución del número absoluto de neutrófilos. Aplasia medular.
Mieloptisis de la médula ósea. Agentes citotóxicos.
 Trombocitopenia: Disminución del número total en el recuento de plaquetas.
 Linfocitosis: Aumento del número absoluto en el recuento de leucocitos.
Infecciones virales agudas, como la mononucleosis infecciosa, hepatitis,
citomegalovirus. Otras infecciones agudas, como la tos ferina. Infecciones por
protozoos, como la toxoplasmosis y la enfermedad de Chagas.Infecciones
bacterianas crónicas como la tuberculosis o la brucelosis. Cáncer, especialmente
del sistema linfático
 Monocitosis: Tuberculosis. Endocarditis bacteriana. Enfermedades virales como
sarampión, rubeola. Colagenosis. Neoplasias.
 Desviación a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en
banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrófilos. Puede observarse en:
infecciones e intoxicaciones.
 Desviación a la derecha: Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La
mayoría de polimorfonucleares presenta más de 5 lobulaciones. Ocurre en:
Anemia perniciosa. Hipersegmentación constitucional hereditaria. Reacciones
mieloides de la sepsis. Afecciones hepáticas. Leucemia mieloide. En la agonía.
 Eosinofilia: Infecciones parasitarias. Reacciones alérgicas. Enfermedades
cutáneas. Neoplasias.
 CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento del colorante de Wright.

- La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky y consiste en azul de
metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.
- La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da
una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos
y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la
eosina
2. Cómo haría el recuento de G.B. si no cuenta con la pipeta de Thoma.
- En su lugar, y por ser un procedimiento mucho más seguro actualmente, podemos
emplear una micropipeta provista de punta desechable para tomar con ella un
volumen determinado de sangre y mezclarlo con un volumen conocido de diluyente.

3. Ud. cuenta 10 campos de 100 G.R. c/u y cuenta un total de 25 plaquetas. Si se

tiene el dato que el paciente tiene 40 de Hto. ¿Cuál es en Nro. de plaquetas
por mm3? Escriba sus cálculos

4. Dibuje las células sanguíneas observadas en práctica, señalando su nombre.

 BASOFILO
NEUTROFILO

BASOFILO

EOSINOFILO
5. Pegue fotos de células observadas en práctica, señalando su nombre y
aumento.
 PRÁCTICA NO. 04

VÍAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

INTRODUCCIÓN

La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación

científica, con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral
del hombre. La experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser
buscado lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética
en cuanto al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el
hombre y para su salud.

La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe

tomar en cuenta si la especie en cuestión es susceptible a la enfermedad contra la
cual estamos elaborando el producto. Es importante, además, considerar el costo de
los animales, así como el de su mantenimiento, el tamaño y docilidad de los mismos,
etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se crían estos animales) y
en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y

arañazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos.

Los animales de experimentación han proporcionado modelos para la realización de

diferentes investigaciones en diferentes áreas de las ciencias de la vida. Los animales
deben tratarse con seriedad y cuidado y si el sacrificio es parte de la experimentación
ésta debe de realizarse bajo un protocolo de eutanasia apropiado. El manejo de estos
animales varía de especie a especie. Las especies que más se utilizan en el
laboratorio son el cobayo, ratón albino, rata albina y el Hamster, de ellos ofrecen
mayor dificultad la rata y el ratón porque al sentirse capturados muerden. El cobayo y
Hamster son sumamente dóciles.

La inoculación de sustancias es una práctica generalizada, y en el área de la

inmunología las inoculaciones representan la práctica más extendida, pero también
existen pruebas diagnósticas, los test alérgicos que demandan cierto conocimiento de
las diferentes vías de inoculación. Asimismo, la toma de muestras sanguíneas es un
procedimiento de rutina en la mayor parte de los laboratorios de inmunología, ya que
a través de este procedimiento se obtienen células, fluidos y moléculas tanto para la
investigación como para el diagnóstico.
 OBJETIVO

 Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y VENOPUNCIÓN (SANGRADO)

1. Inoculación y venopunción intravenosa en ratón y rata. Introduzca al ratón en

un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la
cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se
dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja de 25. Para
la venopunción se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un
pedazo de la cola.
 2. Inoculación intraperitoneal en ratón, rata o cobayo. Sujete al animal con la mano,

con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que
las vísceras se desplacen hacia abajo, limpie la región peritoneal con una torunda
y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda
de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a la inoculación de
la sustancia a probar. Al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos
planos (piel y pared abdominal).

3. Inoculación subcutánea en rata, ratón o cobayo. Con la ayuda de unas pinzas,

se inmoviliza al animal por atrás de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y
jale la cola. Con los dedos pulgar e índice forme un pliegue de la piel e introduzca
la guja por este pliegue.

4. Inoculación intramuscular. Se utiliza como una vía de administración sistémica,

en estudios de liberación lenta (formulaciones oleosas) y en valoración de
vacunas. La inyección debe hacerse en una masa grande, alejada de vasos
sanguíneos y nervios mayores. Se hará entre la cara lateral y la craneal de los
músculos del muslo. Inyecte lentamente, retire la aguja y dé masajes en la zona.

5. Punción cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del tórax,

localizar el corazón y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja
del número 20 x 32.

FOTOS QUE MUESTRAN LAS VÍAS DE INCOCULACIÓN

INOCULACIÓN O SANGRADO INTRAVENOSA INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL

PUNCIÓN CARDIACA
TAREA DE LABORATORIO: COLOCAR SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
 CUESTIONARIO:

1. Anote los usos de la inoculación.

- Hasta la fecha, la única forma que se conoce para producir estos anticuerpos es
inoculando animales. Se pueden emplear para el aislamiento primario de virus o
para virus tediosos o difíciles de cultivar en otros sistemas. Y, por último, también se
utilizan para estudios de antivirales y vacunas.

2. Anote los usos de la venopunción.

- Recolección de sangre de una vena, usualmente para pruebas de laboratorio. Venopunción.

Es la técnica por la cual se perfora una vena por vía transcutánea con un estilete rígido de
punta aguda o una cánula portadora de un catéter de plástico flexible unido a una jeringa o
un catéte
 PRÁCTICA 05

FAGOCITOSIS IN VIVO

INTRODUCCIÓN

La fagocitosis se inicia con la adherencia de células fagocíticas al endotelio vascular.

Estas son células especializadas, que pueden ser macrófagos o PMN. Los mismos
serán estimulados para que produzcan citoquinas (IL-1, TNF, IFN). La quimiotaxis es
la etapa de movilización y reclutamiento de leucocitos, por medio de la interacción
celular, a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere levemente a la superficie
del endotelio (previamente activado por las citocinas), a través de uniones
moleculares de baja afinidad entre receptores en el leucocito y selectinas sobre la
superficie endotelial (selectina E y selectina P, por ejemplo).

El flujo sanguíneo laminar empuja a los leucocitos así adheridos en dirección de la

corriente sanguínea. El fagocito se despega de las interacciones corriente-arriba y
sus ligandos de membrana se unen a nuevas selectinas corriente-abajo. El resultado
es un movimiento neto a lo largo de la superficie endotelial. Otras moléculas que
participan en esta movilización son las moléculas de adhesión vascular (VCAM-1)
presentes en el endotelio, cuyos ligando correspondiente muestran preferencia por
los linfocitos T y eosinófilos.

En un punto específico, determinado por la presencia y activación de quimiocinas, los

fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el
endotelio por medio de integrinas y otros ligando endoteliales. En especial las
moléculas endoteliales LFA-a, CR3 y VLA-4 se adhieren a ligando específicos sobre
los fagocitos, entre ellos VCAM-1 e ICAM-1. La expresión de estos ligando sobre la
superficie del fagocito es regulada por proteínas inflamatorias, como el TNF y la IL-1.

Es en ese punto de movilización lenta cuando los fagocitos, atraídos por gradientes
de concentración de las quimiocinas, atraviesan el epitelio vascular hacia el foco de
infección patógena. Los receptores sobre la membrana de los fagocitos actúan como
mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos microbianos
específicos o sobre opsoninas (opsonización) del sistema inmune del hospedador.

La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación intracelular

que resultan en la evaginación de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su
ligando patogénico. Al rodear por completo al complejo receptor-molécula, la
membrana se une en sus extremos y libera al interior de la célula un fagosoma. Esto
puede ocurrir en más de un punto de la membrana celular.

Una vez que el fagolisosoma es formado comienza la desintegración del

micororganismo, proceso que se realiza por mecanismos dependientes o
independientes de Oxígeno. El primero se da tras activarse rutas metabólicas que
consumen oxígeno, como el sistema de la NADPH oxidasa, el cual produce la
liberación de radicales libres del oxígeno, que se constituyen en el principal
mecanismo bactericida para los microorganismos. En el segundo caso se liberan
enzimas hidrolíticas que destruirán al antígeno.

OBJETIVO
1. Comprender el proceso de fagocitosis in vivo y aplicar los conocimientos en
casos de daño tisular, o invasión de múltiples microorganismos o sustancias.
MATERIAL Y MÉTODOS:

1. De laboratorio:

 Tubos de ensayo.
 Mechero y asa bacteriológica, en anillo.
 Centrífuga
 Solución salina fisiológica estéril
 Tubo Nº 3 de Mc. Farland
 Estufa y Baño María
 Agujas hipodérmicas
 Tabla de disección
 Estuche de disección
 Láminas porta-objetos
 Soporte de coloración
 Colorante de Wright y azul de metileno
 Agua destilada
 Microscopio
 Aceite de cedro

2. Biológico:
 Cultivo de Escherichia coli
 Rata blanca adulta

PROCEDIMIENTO:

1. Obtención del inóculo bacteriano

 Sembrar la cepa de E. coli en caldo nutritivo e incubar a 37 ºC por 18 horas

 Centrifugar a 1500r.p.m. durante 15 minutos, eliminar el sobrenadante y
agregar solución salina fisiológica (repetir esta acción tres veces)
 Hacer una suspensión del cultivo equivalente a la turbidez del tubo Nº 03 del
Nefelómetro de McFarland
 Llevar la suspensión a baño maría a 85 ºC durante 60 min.

2. Inoculación: PRIMERA FASE

 Inoculación de 1 mL de suspensión de E. coli (cultivo muerto), mezclado con
saponina (50/50), vía intraperitoneal en ratas blancas adultas.
 Dejar reposar las ratas 48 horas.

3. Inoculación: SEGUNDA FASE

 A la misma rata, inoculación de E. coli (cultivo vivo), vía intraperitoneal.
 Dejar reposar las ratas 4 horas

4. Disección de las ratas

 Luego, diseccionar la rata para la obtención de líquido intraperitoneal con
hisopos estériles.
 Extender los hisopos sobre 4 láminas portaobjetos, secar al mechero.
 Colorear con Wright o azul de metileno y observar al microscopio.
 Dibujar sus resultados y preparación de su informe.
TAREA DE LABORATORIO
1. ¿Cuál es la finalidad de inocular primero el germen muerto?

2. ¿Cuál es el papel de la saponina?

3. ¿Por qué se inocula por segunda vez el germen vivo?

4. COLOCAR LAS FOTOS DE SU PROCEDIMIENTO

 5.- DIBUJAR SUS OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS, SEÑALANDO LO QUE
OBSERVA

6.- COLOCAR SUS FOTOS DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

 PRÁCTICA 06

HIPERSENSIBILIDAD TIPO 1: SHOCK ANAFILACTICO

INTRODUCCIÓN

Laanafilaxia esunsíndrome deaparición bruscay afectaciónplurisistémica cuyaincidenciaglobalno

se conoce con toda precisión. La anafilaxia constituye una reacción inflamatoria de
instauración generalmente inmediat causada por la liberación masiva de mediadores
inflamatorios (histamina, prostaglandinas, serotonina, factor activador de plaquetas,
leucotrienos) de leucocitos basófilos y mastocitos,comoconsecuenciadelaunión de anticuerpos
tipo inmunoglobulina E (IgE) frente a determinados antígenos. Tales mediadores son causantes
de manifestaciones clínicas que según la vía de acceso y el grado de difusión intracorporal
del alérgeno (sustancia extraña), pueden adoptar una forma localizada como la rinitis o el
asma,o generalizada como el eritema, diaforesis, palidez o cianosis, vasodilatación
sistémica, hipotensión, shock, etc.

La unión Ag.-Ac. (Anticuerpo tipo IgE) es uno de los mecanismos fisiopatológicos más
importantes que se involucran en el desarrollo de la anafilaxia, por lo cual los modelos que
desarrollan las reacciones de hipersensibilidad tipo1 asociadas a esta interacción han
cobrado vital importanciaenlaevaluación preclínica de sustancias con efectos
antianafilácticos.

En la producción del choque anafiláctico experimental existen dos periodos marcados. El

primero llamado “Sensibilizante” es producido por la inyección de un antígeno
generalmente, albúmina de huevo, por vía intraperitoneal o subcutánea, seguida de un
periodo de latencia que permitirá al anticuerpo formado fijarse en los tejidos. El segundo
periodo o desencadénate es producido dos a tres semanas después de la sensibilización
con una dosis de antígeno mayor e inyectado por vía venosa. El cobayo es el animal más
usado para la demostración de anafilaxis, debido a que permite visualizar con claridad
todas las manifestaciones de esta reacción.

La serie de manifestaciones que serán observadas en el cobayo

dependeránprincipalmente de dos factores pato-genéticos: contracción de la musculatura
lisa y aumento de la permeabilidad capilar; y las manifestaciones externas consistirá en un
cuadro caracterizado por: Intranquilidad, disnea, dificultad para respirar, rascado del
hocico, trastornos esfinterianos, etc.

OBJETIVO

1. Demostrar al alumno una de las manifestaciones más dramáticas de la

combinación antígeno- anticuerpo (Reacciones de Hipersensibilidad-I).

MATERIALES

 Ovoalbúmina
 Cobayo
 Mechero y asa bacteriológica, en anillo
 Solución salina fisiológica estéril
 Agujas hipodérmicas N°21
 Jeringasde 5 ml
 Equipo de disección
 Algodón
 Alcohol yodado
PROCEDIMIENTO

1. Dosis sensibilizante: Inyectar 1.mL de una solución al 50% de albumina de huevo

vía intraperitoneal. Dejar reposar al cobayo por 21 días.
2. Dosis desencadenante: Después de los 21 días inyectar el doble de la dosis
sensibilizante, vía intracardiaca.
3. Observar los síntomas del choque anafiláctico e interpretar los resultados
4. Tan pronto como el animal deje de respirar, lleve a cabo la necropsia. Observe el
corazón y los pulmones primero, observe otrosórganosbrevemente y describa
cualquier otrohallazgo positivo.

TAREA DE LABORATORIO

1. Anotar resultados de sus observaciones

SINTOMAS OBSERVACION

Intranquilidad,

Disnea

Dificultad para respirar

Rascado del hocico

Erizado pelos de nuca

OTROS:

NECROPSIA OBSERVACION

Corazón

Pulmones

Hígado

Riñones

Otros órganos
2. Esquematice y explique la fase sensibilizante y la fase desencadenante

3. Colocar sus fotos de la fase sensibilizante:

4. Colocar sus fotos de la fase desencadenante (síntomas y necropsia)
 PRÁCTICA 07

SISTEMA SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RH

INTRODUCCIÓN

En 1818, James Blundell, Fisiólogo Inglés, hizo la primera transfusión de hombre a

hombre y para 1875 ya se habían hecho unas 350 transfusiones en humanos. En 1899
Shattock informó sobre la aglutinación de eritrocitos de algunas personas con el suero
de otras e interpretó este fenómeno como anormal. Fue Karl Landsteiner, quien
descubrió las diferencias de la sangre entre grupos de personas y con su teoría sobre la
especificidad de las reacciones serológicas (1900) dio inicio a la era inmunológica de la
historia de la transfusión sanguínea.

Lanomenclaturaaceptadaen1928porla LigadelasNacionesfueladeJansky,quienpropuso
cuatro grupossanguíneos:(A, B, O, AB).
Eldescubrimientodelosgrupossanguíneosrevolucionó laprácticade la transfusión
sanguíneapuestoqueyaconestehallazgo eraposibleseleccionar los donantes mediante
pruebas pretransfusiónales in vitro. El avance en la tecnología permitió el
almacenamiento seguro de sangre y dio lugar a la formación del primer banco de
sangre en Estados Unidos en el Cook Country Hospital de Chicago en 1937. En los
últimos años se ha logrado avanzar al grado de permitir la
transfusióndemúltiplesfraccionesdesangre.
Las membranas de las células del organismo humano, incluyendo los eritrocitos, están
formadas por varias capas de moléculas lipídicas, proteicas, y carbohidratos distribuidos en
tal forma que permiten una separación entre elmedio intracelular yelmedio extracelular.
Muchasde estassustancias, esdecir, glicolípidos yglicoproteínas tienencapacidad
antigénica yconstituyen los llamados grupos sanguíneos. Se cree también que algunos
grupos sanguíneos son proteínas puras, pero es posible que dichas sustancias solo
sean las portadoras de los determinantes antigénicos y que siempre necesiten de
lípidos o carbohidratos para efectuar como antígenos completos.
Estos antígenos de la membrana están determinados genéticamente. Los genes que
controlan la estructura de un antígeno en particular, ocupan un lugar correspondiente
(loci) en un par de cromosomas homólogos, en esta forma para todos los genes que se
encuentran en cromosomas autosómicos un individuo puede ser homocigoto o
heterocigoto. El único grupo sanguíneo que no es autosómico es el sistema XG
cuyos genes están en el cromosoma X.
Estos antígenos pueden formar parte de la membrana del glóbulo rojo como ser el
antígeno Rh que es una lipoproteina o estar adherido a la superficie de los glóbulos
rojos, como los antígenos ABO que químicamente son lipopolisacáridos. Algunos
antígenos sanguíneos (Ej. ABO) están presentes en la mayoría de los tejidos y líquidos
corporales y otros como el Rh, K, etc. limitados y formando parte de las membranas de
los glóbulos rojos. Hoy en día se conocen más de 15 sistemas de grupos sanguíneos
distintos como muchas variantes dentro de cada sistema, la mayoría tienen 2 o 3 alelos
pero por ejemplo el Rh tiene por lo menos 28 alelos.
Los antígenos A y B son glicoproteínas, producidas por genes alelicos en un locus
único, localizados en la parte proximal del brazo corte del cromosoma 9. Los antígenos
correspondientes se encuentran aparentemente adheridos a la membrana de los
glóbulos rojos. La especificidad antigénica es conferida por el azúcar, terminal; Ej.
Azúcar N- aceteilgalactosamina proporciona la especificidad antigénica A y el azúcar
galactosa determina la actividad B. Los antígenos ABO están presentes en todos los
tejidos excepto el sistema nervioso central, de donde se deduce la importancia de dicho
sistema en
transfusión de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y transplantes de tejidos, también se
encuentran presentes en las secreciones, como polisacáridos solubles. El polisacárido
presente en las secreciones es químicamente idéntico al presente en los glóbulos rojos.

SISTEMAS SANGUÍNEOS ESTABLECIDOS

SISTEMA SANGUÍNEO ABO

 OBJETIVOS
1. Adiestrar al alumno en la determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh
2. Capacitar al alumno en la interpretación clínica de resultados en relación al
sistema ABO y Rh

MATERIAL

 Portaobjetos. Rotulador para vidrio

 Lancetas estériles desechables
 Papel de filtro
 Alcohol de 96°
 Sueros anti-A, anti-B y anti-D
 Algodón
 Sangre obtenida por punción

PROCEDIMIENTO

Determinación del grupo hemático:

1. Masajear enérgicamente la yema de un dedo y limpiar con algodón
humedecido en alcohol. Dejar unos segundos que evapore y pinchar con la
lanceta estéril. Sobre el portaobjetos, depositar tres gotas de
aproximadamente
0.5 cm de diámetro, bien separadas.
2. Sobre cada gota de sangre de la lámina porta se pipetean 10 µl del Ac
correspondiente. El orden recomendable es (de izquierda a derecha): anti-A,
anti-B, anti-D.
3. Mezclar bien la sangre y el Ac con una punta limpia para cada gota.
4. Casi instantáneamente podrá ver los resultados de A y B.
5. Para D, espere al menos tres minutos moviendo la lámina porta ligeramente.
En caso de duda, visualice con transiluminador omicroscopio.

TAREA DE LABORATORIO
1. Explique a qué tipo de reacción serológica corresponde la determinación del grupo
sanguíneo.

2. Explique porque una persona del grupo A no puede ser donador para un receptor
del grupo B.

- Porque tiene anticuerpos B

3. Explique porque el grupo “O” es considerado donador universal.

- El tipo de sangre O negativo no tiene antígenos. Se le llama el tipo "donante universal", ya

que es compatible con cualquier tipo de sangre.
4. Explique porque el grupo “AB” es considerado como receptor universal.

- El tipo de sangre AB-positivo se conoce como "receptor universal" debido a que la

persona que lo tiene puede recibir sangre de cualquier tipo.

5. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre grupo “A”

y la madre grupo “B”

6. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre del grupo

“O” y la madre del grupo “AB”

7. Con esquemas, explique en qué consiste la eritroblastosis fetal, proceso que puede
presentarse en algunos embarazos como consecuencia del factor Rh.
COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA

Grupo Genotipo

"A" AA, AO

"B" BB, BO

"AB" AB

"O" OO
 PRÁCTICA Nro. 08

PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO

INTRODUCCIÓN:

REACCIÓN DE WIDAL: demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes

(aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi
en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea y también mide los antígenos somáticos
de
S. paratyphí “A”, S. paratyphi "B". Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen
luego de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y
6 meses. Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días,
alcanzando títulos más elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por más
de 1 año.

LA PROTEINA C-REACTIVA (PCR); es una proteína sanguínea que forma parte de

las denominadas Proteínas de Fase Aguda que tiene la propiedad de precipitar los
polisacáridos somáticos de los neumococos. La PCR comúnmente se encuentra
aumentada en artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre
reumatoidea activa, infarto agudo del miocardio, luego de una operación quirúrgica y de
transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR indica la intensidad de la
enfermedad y la respuesta del paciente a un tratamiento dado. La PCR se detecta en
suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de
látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las
partículas de látex, visible macroscópicamente.

LA ARTRITIS REUMATOIDEA; es un Síndrome crónico de origen desconocido; se

caracteriza por la inflamación simétrica de las articulaciones. Los factores reumatoideos
generalmente de tipo IgM reaccionan con las fracciones Fc. de las IgG. El factor
reumatoideo de tipo IgM se detecta en presencia de Gamma-inmunoglobulina o
fracción II de Cohn (que actúa como antígeno) adsorbida sobre un soporte inerte de
látex poliestireno. El antígeno se une a los FR (anti - IgG) produciendo una aglutinación
de las partículas de látex poliestireno, visible macroscópicamente.

ANTIESTREPTOLISINA-O (AS0) es la medición de anticuerpos anti-Estreptococo

betahemolíticos del tipo A (Streptococcus pyogenes). Esta bacteria produce una enzima
llamada estreptolisina O, que puede destruir los hematíes y el cuerpo reacciona contra
ella produciendo anticuerpos específicos antiestreptolisina O. La presencia de títulos
altos de antiestreptolisinas O ó ASLO, indican una infección por la bacteria Estreptococo
betahemolíticosdeltipoA,quepuedeproducirunaglomerulonefritis,unafiebrereumática,una
endocarditis bacteriana o una escarlatina.
SÍFILIS: es una infección sistémica de evolución crónica, con períodos asintomáticos,
causada por Treponema pallidum. Es un patógeno exclusivo del hombre, quien es su
único reservorio. Se adquiere por contacto directo con una lesión de sífilis reciente, por
vía transplacentaria y raramente por transfusión de sangre. T. pallidum penetra a través
de mucosa sana o piel erosionada y rápidamente disemina en el organismo, por lo que
desde etapas precoces la infección es sistémica.
Las pruebas serológicas no treponémicas como el VDRL (Venereal Disease
Research Laboratory) o RPR (Rapid Plasma Reagin) son fáciles de realizar, tienen
escaso costo económico, son útiles para el diagnóstico y esenciales para controlar la
respuesta al tratamiento, para lo cual se necesita que el estudio sea cuantitativo.
Resultan reactivas después de 14 a 20 días de aparecido el chancro.
Aunque estas pruebas habitualmente se negativizan después del tratamiento, en
algunos pacientes persisten reactivas por el resto de su vida, pero con títulos bajos. Un
descenso no significativo de los títulos o un nuevo ascenso después del tratamiento,
hace sospechar fracaso terapéutico o reinfección.
El objetivo de la práctica es:
1. Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.

MATERIAL Y MÉTODOS:

1. REACCIÓN DE WIDAL: (Aglutinaciones)

 Sobre una placa de cristal “escavada” se coloca en fila 80 uL de suero del

paciente sin diluir (5 en total). Agregar 1 gota de los antígenos
correspondientes para S. typhí "O", S. typhí "H", S. paratyphi "A", S. paratyphi
"B” y Brucela.
 Se mezcla el suero con el antígeno, mover la placa varias veces hacia atrás y
hacia adelante por 5 minutos y se procede a la observación de una reacción de
aglutinación visible.
 Con los antígenos positivos repetir con cantidades de 40, 20, 10 y 5 uL,
respectivamente. Con este procedimiento los anticuerpos resultan titulados en
1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320, respectivamente.

Negativo: No hay aglutinación.

Positivo: Aglutinación.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce la aglutinación.

2. PROTEÍNA C – REACTIVA

 Preparar una muestra diluida 1:20 de suero en un tubo de ensayo, mezclando

1 gota (50uL) del suero con 1 mL. de buffer glicina. Luego, en una placa de
vidrio mezclar una gota (50 uL) del reactivo de látex y una gota (50 uL) del
suero diluido.
 Inmediatamente poner en marcha el cronómetro, balanceando suavemente la
placa de vidrio por tres minutos. Observar la aglutinación sobre un fondo
negro y por encima de un haz luminoso.

Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas de: 1:40,
1:80, 1:160, etc.

Negativo : No hay aglutinación

Positivo : Aglutinación que aparece a los tres minutos.
Título : Inversa de la máxima dilución en la que se observa
aglutinación.

3. ARTRITEST:
 Diluir una muestra de suero 1: 20 con buffer glicina. En una placa de vidrio
colocar separadamente el suero diluido 1 gota (50 uL) y una gota de reactivo
de látex-globulina. Mezclar con un palillo descartaba hasta obtener una
suspensión uniforme,
 Inmediatamente disparar el cronómetro, balanceando suavemente la placa
de vidrio observando el resultado dentro de los dos minutos.
 Para la titulación de los sueros se hacen diluciones en tubos, colocando 1,9
mL de buffer glicina en el primer tubo y 1 mL en los restantes.
  Agregar 0,1 mL de suero al tubo Nº 1 mezclando, luego transferir 1 mL de la
dilución al tubo Nº 2, y así se continua con el resto de los tubos. Se obtienen
diluciones de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.

Negativo: No se ve aglutinación.
Positivo: Aglutinación dentro de los dos minutos.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce aglutinación.

4. ANTIESTREPTOLISINA-O (ASO)
 Llevar los reactivosylamuestraatemperaturaambiente. Agitar el Reactivo
Aantes de usar, vaciando previamentelapipetadelgotero.
 En uno delos sectores delimitados dela placa adjunta al equipo colocar: 1
gota del Reactivo A(25ul)másla muestra ycontroles25ul.
 Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener
una suspensiónuniforme enlasuperficie delimitada delaplaca.
 Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.

Negativo: suspensión homogénea.

Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1
a 4 +.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible
macroscópicamente.

5. El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para

detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos, del tipo reagina, producidos
por el individuo ante una infección sifilítica.
 En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo VDRL,
agitar constantemente por 5 minutos y observar al microscopio con objetivo
10X la floculación formada.
 Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16,
1/32, colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo
VDRL.

Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.

6. El RPR es una prueba de floculación diseñada para detectar reagina en el suero de

pacientes con sífilis de manera rápida. La muestra se mezcla con una suspensión
que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón.

 En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo RPR,
agitar constantemente por 5 minutos y observar floculación visible.
 Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16,
1/32, colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo RPR.

Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.
TAREA DE LABORATORIO:

1. Defina que es una reacción serológica directa e indirecta

2. Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación

3. Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.

4. Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas

en el laboratorio.
5. Diga porque las pruebas de VDRL y RPR son consideradas no treponémicas.
Mencione que pruebas serológicas son del tipo treponémicas.

6. Coloque fotos de material usado en la práctica

7. Coloque fotos de resultados de la práctica
 PRÁCTICA Nro. 09

ELISA

Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas

INTRODUCCIÓN:

ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo, en la cual una
enzima ligada a un complejo antígeno – anticuerpo es capaz de generar un producto
detectable con cambio de color. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a
un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de
volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos
y al resultado de la prueba; por lo tanto, como prueba diagnóstica, posee diversas
limitaciones que conviene conocer:
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa
necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado
enferma y que ya se ha recuperado, o que ha sido vacunado, puede seguir produciendo
anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo
que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo.
Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se
encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o
que estén infectadas por una cepa extraña.
En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre
antígeno-anticuerpo. En estos casos, normalmente, se lleva a cabo un western blot donde
se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma
infección en una muestra.
Las enzimas que componen el conjugado deben reunir condiciones como la temperatura
de catálisis semejante a la de la reacción antígeno-anticuerpo; dar productos colorados y
solubles al degradar el substrato; y no dar productos intermedios de catálisis. Las enzimas
más empleadas son la fosfatasa alcalina (con substrato p-nitrofenil fosfato o dietanolamina
en bufer carbonato pH 9,6) la peroxidasa (con substrato ortofenilendiamina) y la beta-
galactosidasa (son substrato o.nitrofenil-beta-galactosido)
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificación de un antígeno en solución (DIRECTO), la detección de un anticuerpo
(INDIRECTO) en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o
la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo (INDIRECTO).
A continuación se describen los más comunes.
1. ELISA directo Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Principio: Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la
muestra problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos
monoclonales específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los
anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los
cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se
encuentran fijados a los anticuerpos (2da. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para
la enzima y luego una
sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del
color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.

2. ELISA directo doble Sándwich

“HADAS”. Principio:
Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra
problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales
específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos
con los que se han tapizado el soporte). (2da reacción Ag-Ac). Agregar anti-anticuerpos
(contra el 2do. Ac) conjugados con una enzima (3ra. Reacción Ag-Ac). Adición de un
substrato para la enzima y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción
enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores
especiales para cuantificar. En caso de negatividad, no aparecerá ningún color.

3. ELISA Indirecto

Principio: En el soporte se encuentra fijado el antígeno, se agrega la muestra que

contiene el anticuerpo que capta al antígeno fijado (reacción Ag-Ac). Se adiciona anti-
anticuerpos conjugados con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima usada y luego
una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del
color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.

4. ELISA Directo Competitivo

Principio: En el soporte se encuentran fijados los anticuerpos. Se agrega en forma

simultánea la muestra que contiene el antígeno problema y una concentración conocida
(comercial) del mismo Ag marcado con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima
usada y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Si la
muestra es negativa la lectura de color será mayor a que si la muestra contiene al
antígeno, Estas lecturas deberán ser confrontadas con la curva de calibración respectiva.
Como puede observarse, los dos antígenos agregados están compitiendo con el
anticuerpo fijado en el soporte. También puede utilizarse el ELISA competitivo para
detectar anticuerpos.

5. ELISA Directo de inhibición

Principio: En el soporte se encuentran fijados los antígenos. Se agrega en forma

simultánea la muestra que contiene el antígeno, más un anticuerpo específico marcado
con una enzima. En este paso se establece una reacción de inhibición entre del Ag
(muestra) con el Ac marcado, impidiendo que este último se una al Ag del soporte. Con el
lavado se eliminan el anticuerpo no fijado al Ag del soporte y se determina la cantidad de
anticuerpo marcado que se ha inmovilizado. Se construye una curva de calibrado
representando la cantidad de anticuerpo marcado inmovilizado frente a la concentración de
antígeno soluble añadida. Puede emplearse también el inhibitorio indirecto.

Objetivo de la práctica:
1. Conocer las técnicas y el fundamento que se usan para los distintos ELISA.
 I. MATERIAL Y MÉTODOS
ELISA directo Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
1. Anticuerpo fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag que va marcado con enzimas
4. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador.
5. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en
fotocolorímetro.
ELISA directo doble Sándwich “HADAS”
1. Anticuerpo fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag
4. Agregar un anti anticuerpo que va marcado con enzimas
5. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador.
6. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en
fotocolorímetro.
ELISA Indirecto
1. Antígeno fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anti-anticuerpo que va marcado con enzimas
4. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador.
5. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en
fotocolorímetro.
ELISA competitivo para anticuerpos (Indirecto)
1. Antígeno fijado en el soporte.
2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema y simultáneamente el mismo tipo de
anticuerpos marcadas con una enzima.
3. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador.
4. Leer al fotocolorímetro: ausencia de color, color tenue, color intenso y confrontar la
lectura con la curva de calibración.
ELISA directo Sandwich “DAS”

ELISA directo doble Sandwich “HADAS”

II. TAREAS DE LABORATORIO

1. Con esquemas, explicar el fundamento de los distintos tipos de ELISA

mencionados.
2. Colocar sus fotos de la práctica
 PRÁCTICA 10

PRUEBAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

INTRODUCCIÓN

DIAGNÓSTICO DE EMBARAZO:

La aparición de la hormona gonodotrofina coriónica ( hCG) en orina y suero poco

después de la concepción y su posterior aumento rápido durante el principio de la
gestación convierten a esta hormonaenunexcelentemarcador para la detección
precozdel embarazo. La prueba hCG de embarazo en un solo paso en placa
(Orina/Suero) es una prueba rápida que detecta cualitativamente la presencia de hCG
en una muestra de orina o suero con una sensibilidadde 25mUI/ml.

La prueba utiliza una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales para

detectar selectivamente los niveles elevados de hCG en orina o suero. Laprueba hCG de
embarazoen un solo paso en placa (Orina/Suero) no muestra interferencias cruzadas
con otras hormonas glucoproteicas estructuralmenterelacionadas, FSH, LH y TSH, en
niveles fisiológicos altos.

Lapruebautiliza dos líneas para indicar el resultado. La línea de la prueba utiliza una
combinación deanticuerposque incluyen unanticuerpo monoclonal hCG para detectar
selectivamente niveles elevados de hCG. La línea de control está compuesta por
anticuerpos policlonales de cabra y partículas coloidales de oro. Elensayo se realiza
añadiendo la muestradeorinaosueroalpocillo de la placa y observando laformación de
líneas de color.

El Ag en las muestras positivas reacciona con el conjugado de color del anticuerpo

específico anti-hCG para formar una línea de color en la región de la línea de la prueba
de la membrana. La ausencia de esta línea de color sugiere un resultado negativo. Para
servir como control del procedimiento, siempre aparecerá una línea de color en la región
de la línea de control, si la prueba se ha realizado correctamente.

PRUEBA RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICUERPOS HIV 1+2

El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE.UU. (CDC), destaca

la importancia de la utilización de pruebas rápidas de detección del HIV para facilitar el
acceso al diagnósticoprecozenzonasdealtaprevalencia, enindividuosdealtoriesgo
oenzonas donde otros métodos de diagnóstico como ELISA, Western Blot o amplificación
de ácidos nucleicos no esténdisponibles.

También son de gran utilidad en el momento del parto, especialmente para el

diagnóstico de mujeres que no hayan sido controladas durante el embarazo. Por otra
parte, estas pruebas rápidas constituyen unaherramienta diagnóstica que puede
desempeñar un papel importante en campañas de prevención y diagnóstico en entornos
clínicos y no clínicos, facilitando de esta manera, la detección precoz de la infección.

WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatográfico "in vitro", de lectura visual, para
la detección cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y
sangre entera. Laprueba constadeuncassetteplásticoquecontiene:-
unamembranadenitrocelulosa sensibilizada con antígenos recombinantes para HIV-1
(gp41) y HIV-2 (gp36) en la zona de prueba "T", conjugados a oro coloidal. La muestra y
el buffer se agregan en el pocillo de muestra "S" solubilizando y mezclándose
conelconjugado deantígenosrecombinantes.
Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a través de la membrana de nitrocelulosa.
Si la muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarán un
complejo con los antígenos conjugados a oro coloidal. Este complejo se unirá
posteriormente a los antígenos inmovilizados en la zona de prueba "T" dela membranade
nitrocelulosa, formando asíuna línea de color rosa-rojo púrpura. La ausencia de dicha línea
indica un resultado negativo. Como control de procedimiento, la prueba incluye una zona
de control "C" de color celeste que cambia a color rosa-
rojopúrpuratraselpasodelamuestra.La ausencia de esta línea invalida los resultados.

OBJETIVO:

1. Describir y comprender el procedimiento y fundamento de pruebas rápida del

tipo directo (Ags) e Indirecto (Acs).

DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO:

MATERIALES

 Muestra de suero y/o orina

 Test en tira
 Contenedor para la recolección de la muestra
 Cronómetro

PROCEDIMIENTO

 Deje que la placa, la muestra de orina o suero y/ó los controles alcancen la
temperatura ambiente (15- 30°C) antes de realizar la prueba.
 Deposite3gotasdeorinaosuero(aproximadamente100μL)enelpocillodelaplaca
(S)ypongaen marchaelcronómetro. Evite quequedenretenidas burbujasdeaire
enel pocillo delaplaca(S).
 Espere hasta que aparezcan una o dos líneas coloreadas. Los resultados
deberán leerse alos 3 minutos cuando se analice orina o a los 5 minutos
cuando se analice una muestra de suero.
 NOTA: Una concentración baja de hCG podría dar lugar, después de un
periodo de tiempo prolongado, a la aparición de una débil línea en la región de
la prueba (T); por tanto, no interprete elresultado después de 10 minutos.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

 POSITIVO: Aparecendos líneas coloreadasdistintas. Una línea

quedaráenlaregión de control (C) y otra línea quedará en la región de la
prueba (T).
 NEGATIVO: Una línea coloreada aparece en la región de control (C). No
aparece ninguna línea coloreada en la región de la prueba (T).
 NO VÁLIDO: No aparece la línea de Control. Un volumen de la muestra
insuficiente o una técnica incorrecta son las razones más frecuentes del fallo
de la línea de control.

PRUEBA RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICUERPOS HIV 1+2

MATERIALES

 Muestra de suero y/o orina

 Test en tira
  Contenedor para la recolección de la muestra
 Cronómetro

PROCEDIMIENTO

 Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente (18-30o C)

antes de utilizar.
 Agregar la muestra (dos gotas) sobre la superficieabsorbente del pocillo de
 Iniciar el cronómetro.
 Leer los resultados entre los 20 y 30 minutos. No leer pasado los 30 minutos
ya que pueden obtenerseresultadoserróneos.
 Algunas muestras positivas reaccionan inmediatamente mientras que otras lo
hacen más lentamente dentrodel tiempodelecturaindicado.

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA PRUEBA

 El cassettecuentaconuna línea decolor celesteenlazonadecontrol"C"

quealrealizar el ensayo debe cambiar a color rosa-rojo púrpura. Este cambio de
color confirma que se ha agregado el volumen adecuado de muestra, que su
migración fue apropiada y que la realización del procedimiento fue correcta.
 Resultado Positivo (2 líneas): se observan 2 líneas de color rosa-rojo
púrpura, unaenlazonade prueba"T" yotra enla zonade control "C". El
resultado espositivo, aunque las intensidades del color de las líneas "T" y"C"
sean diferentes.
 Resultado Negativo (1 línea): se observa solamente una línea de color rojo-
rosa púrpuraenlazonade control "C".
 Resultado Inválido: la ausencia de la línea de color rosa-rojo púrpura en la
zona de control "C" invalida
elresultado,aunqueestéonopresentelalíneadecolorrosa-rojo
púrpuraenlazonadeprueba"T".
ESQUEMA DE PRUEBA RAPIDA PARA DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO:
Explique su fundamento
COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

1. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Laboratorio de Análisis Biológicos.

Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. 8va.
Edición. 2017.
2. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Fisiología y Genética Bacteriana.
Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. 8va.
Edición. 2017.
3. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Manual de Prácticas de Laboratorio de
Inmunología. Universidad Autónoma de México. México 2015.
4. Rubio-Pedraza, Gonzalo. Manual de Prácticas de Inmunología Clínica. Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
de Murcia. España 2014.
5. Martínez-Romero, Aurora y Ortega-Sánchez, José. Manual de Laboratorio de
Inmunología Básica y Clínica. Como un suplemento de REDVET Revista electrónica
de Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet). Abril, 2011
6. Paz-Morales, Ana y Gaitán-Fernández, Isabel. Manual de Prácticas de Laboratorio de
Inmunología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Mariano Gálvez. Facultad de
Ciencias Médicas y de la Salud. Guatemala 2013.

Enlaces:

 http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/tema-07.pdf

 http://anatobioterio.blogspot.com/2011/03/tecnicas-de-inoculacion.html

 http://www.uap.edu.pe/intranet/fac/material/04/20122BX040104234040104011/2012
2BX04010423404010401137640.pdf