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UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

INMUNOLOGÍA GENERAL
MANUAL DE PRÁCTICAS
2021 -I

ALUMNOS:
IRIGOIN ASTOPILCO, DIEGO
DOCENTE:
MEJÍA DELGADO ELVA
CURSO:
INMUNOLOGÍA GENERAL
HORARIO:
JUEVES 2:20PM – 5:55PM
NRC: 5496
FECHA: 30/5/21
TRUJILLO- PERÚ
2021

1
 PRÁCTICA 01

BIOSEGURIDAD Y SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos,

especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes biológicos, los cuales
son conocidos como Niveles de bioseguridad, la clasificación de cada laboratorio
identifica el riesgo biológico que representan para la salud los agentes que ahí se
manejan.

Nivel de Bioseguridad 1: En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro
mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se requiere
equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. El laboratorio no
está necesariamente aislado de las demás instalaciones del edificio. El trabajo se realiza
generalmente en mesas de trabajo abiertas. Por lo general, los materiales contaminados
se desechan en recipientes de residuos abiertos. Incluye varios tipos de bacterias y virus
como la hepatitis canina, Escherichia coli no patógena, Staphylococcus epidermidis,
Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, Sacharomyces cerevisiae, Penicillium
roqueforti, así como algunos cultivos de células.

Nivel de Bioseguridad 2: En él se manejan agentes de peligro moderado hacia el

personal y el ambiente y el personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el
manejo de agentes patógenos como las bacterias Bordetella pertussis, Clostridium
botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Streptococcus, Micobacterias oportunistas, Haemophilus
influenzae, Yersinia enterocolitica, Salmonelas gastroenteríticas, Shigella, Legionella,
Borrelia, Neiserias patógenas, Vibrio, Treponema pallidum y virus como Adenovirus,
Parvovirus B19, Rotavirus, Virus de la hepatitis A, Virus de la gripe, Virus del sarampión,
Virus de las paperas, Virus de la rubéola. . El acceso al laboratorio es restringido cuando
se está realizando algún trabajo. Se toman precauciones extremas con instrumentos
punzocortantes contaminados. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los
agentes o aerosoles se llevan a cabo en gabinetes de trabajo biológico.

Nivel de Bioseguridad 3: Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clínicos

de diagnóstico, laboratorios universitarios de investigación, en el cual se realiza trabajo
con agentes exóticos o que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como
resultado de la inhalación o exposición a los mismos, como las bacterias Bacillus
anthracis, Brucella, Escherichia coli (verotoxigénica), Francisella tularensis,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Rickettsias, Salmonella ser. Typhi,
Shigella dysenteriae ser. 1, Yersinia pestis; y los virus Virus de la encefalitis de California,
Virus de la encefalitis equina americana, Virus de la estomatitis vesicular, Virus de la
hepatitis B, Virus de la hepatitis C, Virus de la hepatitis D, Virus de la fiebre amarilla, VIH.
El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales y todos los materiales
son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección. El personal de laboratorio
tiene una formación específica en el manejo de patógenos y agentes potencialmente
letales, y son supervisados por científicos competentes con experiencia en el trabajo con
estos agentes. El acceso al laboratorio está restringido.

Nivel de Bioseguridad 4: Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes
biológicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que además son un
riesgo para la vida. Por lo regular los científicos que trabajan aquí, utilizan trajes

2
especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que además tienen una leve
sobrepresión para evitar que entren partículas infecciosas al mismo si es que éste llega
a desgarrarse. Además, las instalaciones están en un edificio separado o en un área
controlada dentro de un edificio, que está completamente aislado de las demás áreas
del edificio. Las enfermedades infecciosas que se manejan en el nivel 4 son: Virus de
la viruela, Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo), Virus de Marburg, Virus
Ébola.

OBJETIVO GENERAL
Aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunología.

Objetivos Específicos.
Familiarizar al estudiante con las normas de bioseguridad en el laboratorio de
inmunología.
Hacer conocer la importancia de los riesgos biológicos del manejo de material
infeccioso.
Aplicar los conocimientos en la resolución de casos de accidente ocupacional
con material infeccioso.

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

1. Requisito indispensable: Antes de realizar cada práctica leer cuidadosamente

el protocolo de la práctica para familiarizarse con el trabajo que va a desarrollar.
Al conocer el protocolo disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y
además puede aprovechar el tiempo de manera eficaz.
2. Prohibido: Comer, beber, fumar y distraer al profesor a la hora de la práctica.
Prohibido el acceso a toda persona ajena al área.
3. Protección: Llevar el equipo de protección personal necesario. Esto garantiza
que cualquier accidente que pueda ocurrir sea de menor gravedad, de no acatar
las reglas no se permitirá acceso a la práctica.
4. Material y Equipo: Debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para
la práctica que va a desarrollar. Ser cuidadoso con todo el material y equipo que
utilice para evitar accidentes y deterioro del mismo en las prácticas.
5. Limpieza: Dentro del área que se va a trabajar se comienza limpiando el área de
trabajo y se repite este procedimiento después de que se haya terminado. El
material de desecho depositarlo en el lugar que corresponde y el material
reutilizable lavarlo y desinfectarlo.
6. Higiene: Durante la sesión de trabajo lavarse las manos con agua y jabón antes
de hacer cualquier procedimiento y al finalizar repita el mismo procedimiento para
mantener buenas condiciones higiénicas.
7. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacíos, jeringas, cubre
bocas, portaobjetos, cubreobjetos, etc., no reciclar y desecharlos.
8. Indisciplina: Se sancionará con la expulsión parcial o total del alumno, según el
caso lo requiera.
9. Responsabilidades: En caso de accidente o lesión, avisar inmediatamente al
profesor o responsable de la práctica para que pueda auxiliar con rapidez y
eficacia al alumno.
RECOMENDACIONES:

1. Todo material biológico humano se manipula como si fuera potencialmente

infeccioso.
2. Protección personal: bata y guantes. Las heridas se traen cubiertas con
apósitos impermeables. La ropa de calle es un elemento adicional de

3
 protección, se desaconseja el pantalón corto o el calzado abierto.
3. El cabello largo debe estar atado atrás o arreglado de manera que no entre en
contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el
equipo.
4. Para trabajar, se colocan las muestras, reactivos etc. en la parte delantera de
la zona de trabajo, así se evita golpearlos con los brazos en un descuido.
5. Antes de utilizar un reactivo, se observa si tiene símbolos y avisos sobre su
toxicidad y riesgo de manejo (generalmente en recuadros de color naranja).
6. En el laboratorio no se debe comer, beber, aplicarse cosméticos u oler
reactivos o muestras directamente.
7. No arrojar a la papelera o desagüe material usado sin consultar al profesor.
Los residuos y el material punzante (puntas de pipeta, agujas, hojas de bisturí,
cubreobjetos y similares) se desechan en los contenedores repartidos por las
mesas.
8. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las áreas que no son de
laboratorio (pasillos, biblioteca, etc.).
9. Las manos deben ser lavadas después que se han quitado los guantes y antes
de dejar el laboratorio, así como en cualquier momento después de manipular
material conocido o sospechoso de estar contaminado.
10. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y después de
cualquier salpicadura de material potencialmente infeccioso.
11. Todo material contaminado, sólido o líquido, debe ser descontaminado antes
de descartarlo o de reusarlo.

ACCIDENTES:

1) Las salpicaduras o derrames en la piel intacta se deben lavar inmediatamente

con jabón y agua abundantes.
2) Las salpicaduras a mucosas (ej. a la boca), deben lavarse con agua corriente
durante 15 minutos. Las salpicaduras a los ojos se lavarán de inmediato con
frasco lavaojos o con agua corriente manteniendo los ojos muy abiertos con
los dedos.
3) Las inoculaciones percutáneas (ej. arañazo o corte con instrumental usado)
deben lavarse con agua y jabón, dejar, en su caso, fluir la sangre libremente
3 minutos, desinfectar con povidona yodada y cubrir con un apósito
impermeable. En todos los casos se comunicará el incidente al profesor.

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS (RPBI)

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias,
hongos, virus, parásitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos
nocivos para la salud y el medio ambiente.

Los RPBI se clasifican en:

1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc.
2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas de
cultivo, etc.
3. Residuos patológicos: residuos de tejidos, órganos, partes y fluidos corporales,
etc.
4. Residuos no anatómicos derivados de la atención a pacientes y de los
laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc.
5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas, jeringas, pipetas
Pasteur, porta y cubreobjetos, etc.

4
Color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Sólidos Bolsas de plástico Rojo
Cultivos y cepas de Líquidos Recipientes Rojo
agentes infecciosos. herméticos
Residuos no anatómicos
Patológicos Sólidos Bolsas de plástico Amarillo
Patológicos Líquidos Recipientes Amarillo
herméticos
Objetos Sólidos Recipientes rígidos Rojo
punzocortantes

SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO

Se entiende por señalización de seguridad y de salud a la que referida a un objeto,

actividad o situación determinadas, proporcione una indicación o una obligación relativa
a la seguridad o la salud en el trabajo mediante señal en forma de panel, un color, una
señal luminosa o acústica, una comunicación verbal o una señal gestual, según proceda.
Pictograma es la imagen que describe una situación u obliga a un comportamiento
determinado utilizado sobre una señal en forma de panel o sobre una superficie luminosa.
En principio, los lugares de trabajo deben ser señalizados con los pictogramas que se
ajusten a las características de las tareas que se lleve a cabo en el laboratorio/ taller.

Requisitos de utilización

La altura y posición de las señales deberá tener en cuenta su relación con el

ángulo visual.
El lugar del emplazamiento de la señal debe estar iluminado, ser accesible y
fácilmente visible.
Las señales deben retirarse cuando deje de existir la situación que las justifica.

CLASIFICACIÓN DE PICTOGRAMAS:

1. Señales de advertencia
• Forma triangular.
• Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros.

2. Señales de prohibición.
• Forma redonda
• Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos

3. Señales de obligación.
• Forma redonda
• Pictograma blanco sobre fondo azul

4. Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios.

• Forma rectangular o cuadrada
• Pictograma blanco sobre fondo rojo.

5. Señales de salvamento o socorro.

• Forma rectangular o cuadrada.
• Pictograma blanco con fondo verde.

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 PRÁCTICA 02

TOMA DE MUESTRA PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Y PLASMA

INTRODUCCIÓN

El sistema hematopoyético (Hema = sangre, poyesis = producción, fabricación) es el

sistema encargado de la formación de la sangre. La sangre es un tejido líquido,
compuesto por agua y sustancias orgánicas e inorgánicas (sales minerales) disueltas,
que forman el plasma sanguíneo y tres tipos de elementos formes o células
sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas.

Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas que conforman la sangre se
producen en la parte esponjosa (médula roja) de algunos huesos del esqueleto (esos
son: el esternón, los huesos del cráneo, las costillas, el hueso ilíaco y las terminaciones
de los huesos de los miembros superiores e inferiores.

En la médula ósea roja de los huesos se encuentran las células hematopoyéticas

pluripotenciales de las que derivan todas las células de la sangre. Hasta los 5 años de
edad estas células tienen su origen en, prácticamente, todos los huesos del cuerpo.
Después de los 20 años, los glóbulos rojos, blancos y plaquetas son producidos
principalmente por la médula de los huesos planos, como las vértebras, el esternón y
las costillas.

Se puede realizar un examen físico o químico de la sangre, para lo cual se la obtiene

por punción venosa o por punción del pulpejo del dedo (sangre capilar) con lanceta
estéril. Para casi todo el trabajo hematológico se utiliza sangre total. Ello exige el uso
de anticoagulantes, los cuales impiden que el calcio actúe en la coagulación, sea
precipitándolo como sal insoluble (oxalatos) o fijándolo en forma no ionizada (citrato,
EDTA). La heparina actúa como agente antitrombínico, o sea neutraliza a la trombina.
Así mismo, casi todas las determinaciones bioquímicas en el laboratorio utilizan suero,
el cual se obtiene tomando la muestra en un tubo de ensayo y se lo deja coagular, para
la separación del suero.

Usualmente en adultos se utilizan las venas del pliegue antecubital del brazo, pero
también pueden ser otras zonas como, por ejemplo: del antebrazo, dorso de la mano,
dorso del pie, etc.

La práctica tiene por objetivos:

1. Adiestrar al alumno en la extracción de muestras de sangre del antebrazo para

la obtención de sangre total, suero y/o plasma.
2. Realizar extendidos sanguíneos en láminas portaobjetos.

MATERIAL Y MÉTODOS
1. Equipo necesario para la venopunción: Equipo Vacutainer.
Tubos de vacío diseñados para llenarse con un volumen predeterminado de
sangre por medio de vacío, esto garantiza una adecuada relación entre sangre y
anticoagulante. Los tapones de goma están codificados por color de acuerdo con
el aditivo que contienen así, por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los más
utilizados para hematología rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas
de coagulación.

8
 Agujas especiales para adaptador.
Adaptador para tubos de vacío.
Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre
para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de 0.8mm (21G) para
evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-19G) se
utilizan normalmente para punción venosa en adultos.
Torniquete: Generalmente una liga plana de látex.
Alcohol: Etílico o isopropílico al 70%.
Algodón
Gasas y/o vendas adhesivas
Dispensador de agujas

2. Etiquetado de los tubos

Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los
análisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el
etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analítica son:
Nombre o iniciales del paciente
Número de identificación del paciente
Fecha y hora de la toma de muestra
Iniciales del flebotomista

3. Punción venosa

La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las
pruebas necesarias en hematología. Las venas de elección suelen ser las de la
cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena cefálica y la vena basílica)
porque resulta fácil acceder a ellas.

Preparación del paciente

Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la

existencia de problemas hemorrágicos o de circulación, o alergias.
Evite puncionar en un área con hematoma, fístulas, quemaduras,
escoriaciones de la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado
mastectomía reciente.
Avisar al paciente que al introducir la aguja sentirá dolor.
Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba.

4. Punción capilar

Es utilizada para extraer pequeñas cantidades de sangre en determinaciones

de hemoglobina, hematocrito y frotes periféricos. Hay dos lugares de donde
realizar esta punción: el lóbulo de la oreja, la yema del dedo.

Metodología
Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja.
Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una
lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm.
Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un
microtubo y prepare las laminillas con esa muestra.

9
5. Algunos anticoagulantes utilizados en el laboratorio
Oxalatos: Los oxalatos de amonio y potasio se utilizan en mezcla de 3 partes
del primero por 2 del segundo. La sal de amonio aumenta el volumen de los
GR y la de potasio lo disminuye, por tanto, es muy usado en hematología. El
oxalato de potasio sólo se utiliza en bioquímica.
Citratos: Se utiliza la sal disódica al 3.8% (peso x volumen) en proporción
de una parte de la sal por nueve de sangre.
Dextrosa-citrato ácida: En las transfusiones de sangre y en pruebas
hematológicas para preservar los antígenos de los GR.
Sequestrene: Sal dipotásica o disódica del EDTA. Por quelación impide que
se ionice el calcio por lo que ejerce una acción anticoagulante muy intensa.
Fluoruro: Se combina con el calcio impidiendo su acción. Puede
usarse también como conservador cuando la muestra tenga que ser
guardada.
Desfibrinación: Se lleva a cabo en un matraz utilizando perlas de vidrio, a
las cuales queda adherido la fibrina formada por coagulación. Este proceso
es útil para el estudio de GB, GR y plaquetas. Se obtiene también buena
cantidad de suero.
CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el calibre de la aguja utilizada para el procedimiento de venopunción?

Para la venopunción se usa una aguja de 0.9-1.1 mm de diámetro. (21 G- 19G)

2. ¿Por qué se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extracción sanguínea?

Para detener el fluido sanguíneo del brazo dando como resultado un resalto en las
venas y de este modo facilitar la localización de la vena a la cual sele extraerá la
sangre.

3. Como se debe de introducir el bisel de la aguja y ¿Por qué?

Se debe introducir la aguja en la vena con el bisel hacia arriba, en el mismo sentido
que el flujo sanguíneo venoso, con un ángulo de 30 o 45o sobre la superficie de la
vena escogida y atraviese la piel.

4. Defina que es un anticoagulante

Sustancia endógena o exógena que interfiere o inhibe la coagulación de la sangre,

creando un estado antitrombótico o prohemorrágico. Se distinguen sustancias
endógenas, producidas por el propio organismo y sustancias exógenas(fármacos).

5. ¿Qué diferencia hay entre suero y plasma?

SUERO: No contiene fibrinógeno (factor de coagulación)

PLASMA: Contiene fibrinógeno

10
 6. ¿Qué hacer en caso de no tener vena visible para la extracción sanguínea?

En ese caso se tendría que palpar para poder ubicar la vena más
cercana o sino buscar a otra persona que tenga venas visibles.

7. Componentes de los tubos de vacutainer que se muestran y sus usos

• Tapón Negro: Este tubo puede presentar dentro tanto citrato de sodio como EDTA. Este
tubo se utiliza para almacenar aquellas muestras de sangres que se les realizara
pruebas de V.S.G. y Velocidad de sedimentación Globular.

• Tapón Violeta/Lila: Contiene EDTA, son utilizados para el conteo sanguíneo o para
realizar frotis para ver en el microscopio

• Tapón Rojo: Contiene agentes coagulantes, su función es la de almacenar la muestra

de sangre y son utilizados para realizar estudios de química clínica y serología

• Tapón Verde: Tubo con heparina, ya sea de sodio o de litio, utilizado para la
determinación química clínica en el plasma

• Tapón Gris: Contiene fluoruro y oxalato de potasio, utilizado para la determinación de

glucosa en el plasma

• Tapón Naranja: Contiene trombina, coagulante rápido usado para análisis de urgencia
en el suero.

• Tapón amarillo: Contiene agentes coagulantes y gel para separar el suero, se utiliza para
realizar estudios de química clínica y determinaciones del suero

• Tapón Celeste: Contiene citrato (anticoagulante reversible), utilizado para pruebas de

tiempo coagulación como TP y TTP

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COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
 PRÁCTICA 03

EL HEMOGRAMA

INTRODUCCIÓN

Erlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina, aunque sus

preparados ya no se utilizan en la actualidad. Lanner, en 1 889, encontró que el
precipitado obtenido por la mezcla de eosina y azul de metileno podía disolverse en
alcohol metílico para formar un colorante útil, que combinaba algunas propiedades
de los dos colorantes iniciales.

Romanowsky, 1 890, encontró que al mezclar una solución de azul de metileno

madura, con eosina (policromía), y disolviendo el precipitado en alcohol metílico, se
obtenía un colorante de uso más amplio que el de Lanner, que podía teñir los
núcleos celulares y los gránulos de las plaquetas (a los que la mezcla de Lanner no
coloreaba).

Colorantes modernos a los de Romanowsky; por ejemplo, los colorantes de Wright,

Leishman, etc., son semejantes, en principio, al método original de Romanowsky,
la diferencia principal estriba en el método de obtención de la policromía del azul
de metileno.

El estudio cito morfológico de extendidos coloreados de la sangre pone de

manifiesto el producto final de un maravilloso y complicado proceso de maduración
que tiene lugar en el sistema hematopoyético, y que se encuentra representado por
los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas.

Cada profesional de la salud debe entrenarse y aprender a observar todos los

elementos del frotis sanguíneo, mientras lleva a cabo el recuento diferencial. Debe
formar el hábito de verificar en cuanto al tamaño, forma y concentración de
hemoglobina en eritrocitos, además si existe un grado importante de anisocitosis o
poiquilocitosis, hipocromía, microcítocis, macrocitocis e hipercromía aparente, etc.
En cuanto a plaquetas se debe tener en cuenta si se encuentran en cantidades
normales (de 3 a 8 por 100 glóbulos rojos), si son normales o si hay formas gigantes
o extrañas. Asimismo, en cuanto a leucocitos se debe considerar si son maduros o
atípicos; si su número es normal, aumentado (leucocitosis) o disminuido
(leucopenia).

En los frotis muy gruesos, los leucocitos son pequeños, difíciles de teñir, siendo
imposible su reconocimiento. Aun en los mejores frotis, a causa de la diferencia de
tamaño, densidad, etc., los leucocitos muestran una distribución particular. Los
monocitos grandes y los polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al
final de la extensión, mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en
forma más uniforme en la parte media.

El hemograma consta de 2 partes: recuento leucocitario y la fórmula leucocitaria. El

recuento leucocitario consiste en determinar el número total de leucocitos x mm3 y,
la fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes
puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm 3 de
sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.

13
 Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos es
de 20 000, entonces el valor absoluto de neutrófilos segmentados sería: 60/100
x 20 000 = 12 000.

La práctica tiene por objetivos:

1. Hacer recuentos de leucocitos y plaquetas.
2. Colorear extendidos de muestras de sangre.
3. Reconocer células sanguíneas y establecer la fórmula leucocitaria

MATERIAL Y MÉTODOS:

1. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS:

MATERIAL:
Sangre total (con anticoagulante).
Láminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO:

Preparar una lámina cuyo ancho se ha reducido unos 5 mm. y que servirá como
"lámina extensora".
Colocar a 1 cm. del extremo de una lámina bien limpia y seca, una gota pequeña
de sangre total o directamente de la aguja, jeringa o del dedo; por delante de
ella colocar un extremo de la lámina extensora en ángulo de 30º y retroceder
hasta que toque la gota que se extenderá a lo ancho de la primera lámina, luego
deslizar la lámina extensora siempre en ángulo de 30º, en forma rápida y
uniforme hacia el otro extremo.
Si el ángulo entre las láminas es mayor, el frotis será más grueso y viceversa.
Dejar secar las láminas a temperatura ambiente y rotular.

2. COLORACIÓN DE EXTENDIDOS SANGUÍNEOS: (Método de Wright)

PROCEDIMIENTO:

El frotis bien seco y rotulado se coloca sobre la gradilla de coloración.

Cubrir la lámina con un volumen de colorante y dejar por un minuto (4-5 gotas)
Diluir el colorante con dos volúmenes de agua tamponada pH. 6.4, mezclar bien,
observándose la formación de una escarcha metálica y dejar por 6 minutos.
Lavar con agua corriente y dejar secar colocando la lámina verticalmente.
NOTA: Los tiempos indicados pueden variar de acuerdo a la antigüedad del
colorante.

3. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS:

MATERIAL:

Láminas con extendidos sanguíneos coloreados.

Microscopio óptico.

PROCEDIMIENTO:

Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de aceite de

cedro y observar con objetivo de inmersión.
Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.

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4. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

MATERIAL:

Hemocitómetro (Cámara de Neubauer)

Pipeta de glóbulos blancos (de Thoma)
Diluyente: Líquido Turk (Ácido acético 2-3% más gotas de violeta de genciana:
La solución hipotónica del ácido acético destruye los GR y la violeta de genciana
hace observar mejor los GB, a los que tiñe ligeramente).

PROCEDIMIENTO:

Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.

Llenar con sangre la pipeta de GB hasta la marca de 0, 5 y limpiar la punta.
Introducir la pipeta en el diluyente de glóbulos blancos y llenar la pipeta hasta la
marca de
11. Hacer rotar para que se movilice la perla mezcladora.
No permitir que ingrese aire ni se escape sangre.
Tapar ambos extremos de la pipeta y mezclar manualmente por 1 minuto.
Preparar la cámara de Neubauer con su laminilla cubre-cámara.
Agitar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas para luego colocar una gota pequeña
cerca de un extremo abierto de la cámara, para que se llene por capilaridad.
Dejar en reposo por 3 minutos:
Enfocar la cuadrícula de Glóbulos blancos y luego con el objetivo de 40X contar
en los cuatro cuadrados grandes angulares.
La enumeración incluye las células que cubren o tocan por dentro o por fuera
las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadrado grande de recuento y
no se consideran las de los limites inferior y derecho.

Nº de Leucocitos = G. blancos contados en 4 cuadrados x mm 3

Áreas contadas X altura cámara X dilución de sangre

Nº de Leucocitos = Glóbulos contados

4 x 1/10 x 1/20
Nº de Leucocitos = Glóbulos contados x 50 x mm3

VALORES NORMALES: de 5 000 a 1 0 000 x mm3

5. RECUENTO DE PLAQUETAS: (método indirecto)

PROCEDIMIENTO:

De la lámina de hemograma contar 20 campos con más o menos 100 GR/campo.

Hacer recuento de plaquetas en cada campo.
Sacar promedio de plaquetas por campo, que corresponde al número de
plaquetas por 100 glóbulos rojos.
Confrontar con la Tabla de Relación entre Hematocrito y Número de glóbulos
rojos y con dichos datos, calcular el número de plaquetas por mm3

EJEMPLO: Se observa 10 plaquetas por 100 glóbulos rojos como promedio:

Si el paciente tiene 35% de Hematocrito, según la tabla te corresponde 3'850

000 de glóbulos rojos. Por tanto, el número de plaquetas se obtiene:

15
 Si en 100 G. R --------------------- 10 plaquetas
En 3' 850 000 G.R. x mm3 ------------------- X

X = 3' 850 000 G.R. por mm3 X 10 plaquetas

100 G.R.

X = 385 000 plaquetas x mm3

TABLA: RELACIÓN ENTRE HEMATOCRITO Y NÚMERO DE GLÓBULOS ROJOS

(PARA RECUENTO DE PLAQUETAS)

Hto. (%) Nro. G.R. Hto. (%) Nro. G.R.

28 3'140 000 41 4'510 000

30 3'330 000 42 4'620 000
31 3'410 000 43 41730000
32 3'520 000 44 4'840 000
33 3'630 000 45 4'950 000
34 3'740 000 45,5 5’000,000
35 3'850 000 46 5'060 000
36 31960000 47 51170000
37 4'070 000 48 51280000
38 4'180 000 49 5'390 000
39 4'290 000 50 5'500 000
40 4'400 000

Fórmula Leucocitaria:

Como los granulocitos generalmente están en los márgenes del extendido y los
linfocitos en el centro, se recomienda el método utilizado por Schíling, que consiste en
tomar cuatro puntos marginales distintos recorriendo el campo en zig-zag desde el
borde hacia la parte central, y contar 25 a 50 elementos en cada uno de los cuatro
puntos.

Tabla: Fórmula leucocitaria normal

TIPO CELULAR %

Granulocito Neutrófilo abastonado 2a5

Granulocito Neutrófilo segmentado 45 a 65

Granulocito Eosinófilo 1a4

Granulocito Basófilo 0a1

Linfocitos 20 a 45

Monocitos 4a8

16
Estas cifras pueden variar por condiciones climáticas, altura, raza, emociones, dolor,
edad, etc. Conociendo la relación numérica y la cantidad total de leucocitos por
milímetro cúbico, es fácil establecer la fórmula absoluta de cada tipo celular de la
siguiente manera:

Fórmula absoluta = Recuento global leucocitario x % variedad de célula.

100

CÁMARA DE NEUBAUER

17
PIPETAS PARA GLÓBULOS ROJOS Y BLANCOS

18
TÉRMINOS USADOS:

Leucopenia: Disminución del número total en el recuento de leucocitos.

Leucocitosis: Aumento del número total en el recuento de leucocitos.
Neutropenia: Disminución del número absoluto de neutrófilos. Aplasia medular.
Mieloptisis de la médula ósea. Agentes citotóxicos.
Trombocitopenia: Disminución del número total en el recuento de plaquetas.
Linfocitosis: Aumento del número absoluto en el recuento de leucocitos.
Infecciones virales agudas, como la mononucleosis infecciosa, hepatitis,
citomegalovirus. Otras infecciones agudas, como la tos ferina. Infecciones por
protozoos, como la toxoplasmosis y la enfermedad de Chagas.Infecciones
bacterianas crónicas como la tuberculosis o la brucelosis. Cáncer, especialmente
del sistema linfático
Monocitosis: Tuberculosis. Endocarditis bacteriana. Enfermedades virales como
sarampión, rubeola. Colagenosis. Neoplasias.
Desviación a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en
banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrófilos. Puede observarse en:
infecciones e intoxicaciones.
Desviación a la derecha: Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La
mayoría de polimorfonucleares presenta más de 5 lobulaciones. Ocurre en:
Anemia perniciosa. Hipersegmentación constitucional hereditaria. Reacciones
mieloides de la sepsis. Afecciones hepáticas. Leucemia mieloide. En la agonía.
Eosinofilia: Infecciones parasitarias. Reacciones alérgicas. Enfermedades
cutáneas. Neoplasias.

19
CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento del colorante de Wright.

El colorante de Wright se usa en histología con la finalidad de

diferenciar los tipos de células de la sangre. Se usa para teñir: frotis
de sangre, punción medular; para examinarlas en el microscopio.
Esta tinción de Wright consiste en una solución de alcohol de metílico
de un colorante acido (eosina Y) y otro básico (azul de metileno) y sus
productos de oxidación; la mezcla de estos colorantes provoca el
efecto conocido como Romanowsky, es decir proporciona una
coloración purpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos
neutrofílicos, mientras que los glóbulos rojos se tiñen de color
rosado.

2. Cómo haría el recuento de G.B. si no cuenta con la pipeta de Thoma.

Al no tener una pipeta de Thoma, se utilizaría una micropipeta que

es un instrumento usado para recolectar volúmenes muy
pequeños, medido en uL, lo que corresponde a la millonésima
parte de un litro; el volumen que pueden recolectar varían según
el modelo pero los más comunes admiten un máximo de 20 , 200 y
1000.

3. Ud. cuenta 10 campos de 100 G.R. c/u y cuenta un total de 25 plaquetas. Si se tiene
el dato que el paciente tiene 40 de Hto. ¿Cuál es en Nro. de plaquetas por mm3?
Escriba sus cálculos

Hto:40 4400000 Nro. G.R.

Si en 100 G.R. 25 plaquetas
4400000 G.R. “x”

20
4. Dibuje las células sanguíneas:

21
5. Pegue fotos de células sanguíneas observadas en práctica, señalando su nombre y
aumento.

22
Eosinófilo Basófilo
Aumento:400x Aumento:400x

Monocito Neutrófilo
Aumento:400x Aumento:400x

Linfocito
Aumento:400x

23
 PRÁCTICA NO. 04

VÍAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

INTRODUCCIÓN

La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación científica,
con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre.
La experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser buscado
lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética en cuanto
al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el hombre y para su
salud.

La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar

en cuenta si la especie en cuestión es susceptible a la enfermedad contra la cual
estamos elaborando el producto. Es importante, además, considerar el costo de los
animales, así como el de su mantenimiento, el tamaño y docilidad de los mismos, etc.
Un factor importante en bioterios (unidades en donde se crían estos animales) y en
laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y
arañazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos.

Los animales de experimentación han proporcionado modelos para la realización de

diferentes investigaciones en diferentes áreas de las ciencias de la vida. Los animales
deben tratarse con seriedad y cuidado y si el sacrificio es parte de la experimentación
ésta debe de realizarse bajo un protocolo de eutanasia apropiado. El manejo de estos
animales varía de especie a especie. Las especies que más se utilizan en el laboratorio
son el cobayo, ratón albino, rata albina y el Hamster, de ellos ofrecen mayor dificultad
la rata y el ratón porque al sentirse capturados muerden. El cobayo y Hamster son
sumamente dóciles.

La inoculación de sustancias es una práctica generalizada, y en el área de la

inmunología las inoculaciones representan la práctica más extendida, pero también
existen pruebas diagnósticas, los test alérgicos que demandan cierto conocimiento de
las diferentes vías de inoculación. Asimismo, la toma de muestras sanguíneas es un
procedimiento de rutina en la mayor parte de los laboratorios de inmunología, ya que a
través de este procedimiento se obtienen células, fluidos y moléculas tanto para la
investigación como para el diagnóstico.

OBJETIVO

• Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y VENOPUNCIÓN (SANGRADO)

1. Inoculación y venopunción intravenosa en ratón y rata. Introduzca al ratón en

un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la
cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se
dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja de 25. Para
la venopunción se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un
pedazo de la cola.

24
 2. Inoculación intraperitoneal en ratón, rata o cobayo. Sujete al animal con la mano,

con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que
las vísceras se desplacen hacia abajo, limpie la región peritoneal con una torunda
y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda
de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a la inoculación de
la sustancia a probar. Al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos
(piel y pared abdominal).

3. Inoculación subcutánea en rata, ratón o cobayo. Con la ayuda de unas pinzas,

se inmoviliza al animal por atrás de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y jale
la cola. Con los dedos pulgar e índice forme un pliegue de la piel e introduzca la guja
por este pliegue.

4. Inoculación intramuscular. Se utiliza como una vía de administración sistémica,

en estudios de liberación lenta (formulaciones oleosas) y en valoración de vacunas.
La inyección debe hacerse en una masa grande, alejada de vasos sanguíneos y
nervios mayores. Se hará entre la cara lateral y la craneal de los músculos del muslo.
Inyecte lentamente, retire la aguja y dé masajes en la zona.

5. Punción cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del tórax, localizar
el corazón y extraer lentamente la sangre usando una jeringa con aguja del número
20 x 32.

FOTOS QUE MUESTRAN LAS VÍAS DE INCOCULACIÓN

INOCULACIÓN O SANGRADO INTRAVENOSA INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL

25
INOCULACIÓN SUBCUTÁNEA PUNCIÓN CARDIÁCA

26
 VÍA INTRAPERITONEAL
VIA INTRAVENOSA
- Inmovilizar al ratón en un • Colocar al animal en la
cepo (sujetador para ratón), posición e lasfotos.
utilizan las venas laterales • Se inserta la aguja en la piel
de la cola, estas se dilatan levantandola aguja en contra de
con alcohol. la pared abdominalpara evitar la
- Las venas se observan punción en el interior del
cuando la cola es levantada intestino.
y girada lentamente. • Se puede administrar hasta 3 mL.
- En conejos se utiliza las • Una rápida administración
venas marginales de la
puede causardaños en el tejido y
oreja, frotando con éter para
hemorragia debido a la presión
dilatar las venas
interna.

VIA DE ADMINISTRACION
SUBCUTANEA PUNCIÓN CARDIACA

- Es utilizada como Coloque el ratón sobre la

alternativa a la espalda, de espaldas a usted. Si
intramuscular, en los ratones. usted es diestro, coloque el dedo
- Se prefieren los sitios en que índice izquierdo a nivel de las
abunde tejido conjuntivo (en costillas inferiores, sin aplicar
el dorso, a nivel del cuello o ninguna presión. El corazón se
los flancos). encuentra aproximadamente 1
- La aguja se inserta en la piel cm por encima de este punto,
paralela a la columna ligeramente hacia la derecha.
vertebral Una inyección
subcutánea (SC o subQ)
significa que se aplica en el
tejido adiposo, justo bajo la
piel.
Vía Enteral: Vía oral

- Utiliza la forma natural de absorciónque es el intestino, aunque dichas sustancias no solo se ingieren
por la boca, sino que se depositan directamente en otros tramos del intestino como el recto.
- La sustancia se suministra en el alimento, en el agua de bebida, o bien mediante la administración
forzada utilizando una sonda.
- Lo ideal es mediante sonda orogástrica
CUESTIONARIO:

1. Anote los usos de la inoculación.

INOCULACIÓN: Introducción de un antígeno o antisuero para conferir inmunidad.

Su uso se da en diferentes ámbitos:

• Inoculación en plantas Producir una enfermedad y con ella

controlarla biológicamente, para protegerlas del ataque de patógenos
• Inoculación de bacterias Producir una enfermedad
• Inoculación de frutos e Inoculación de semillas Tienen la prioridad
de estimular el crecimiento en plantas
En el caso de la medicina el caso más relevante en nuestro país, fue el caso de
Daniel Alcides Carrión, cuando él mismo se inoculó viruela en el “Hospital Dos de
Mayo”

2. Anote los usos de la venopunción.

La venopunción permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas
necesarias en hematología, Inmunología, Microbiología y Bioquímica.

Dentro de las pruebas de Hematología:

Hemogramas
Hb
Bioquímica:

Perfil Hepático

Perfil Lipídico

Glicemia

28
 PRÁCTICA 05

FAGOCITOSIS IN VIVO

INTRODUCCIÓN

La fagocitosis se inicia con la adherencia de células fagocíticas al endotelio vascular.

Estas son células especializadas, que pueden ser macrófagos o PMN. Los mismos
serán estimulados para que produzcan citoquinas (IL-1, TNF, IFN). La quimiotaxis es
la etapa de movilización y reclutamiento de leucocitos, por medio de la interacción
celular, a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere levemente a la superficie del
endotelio (previamente activado por las citocinas), a través de uniones moleculares de
baja afinidad entre receptores en el leucocito y selectinas sobre la superficie endotelial
(selectina E y selectina P, por ejemplo).

El flujo sanguíneo laminar empuja a los leucocitos así adheridos en dirección de la

corriente sanguínea. El fagocito se despega de las interacciones corriente-arriba y sus
ligandos de membrana se unen a nuevas selectinas corriente-abajo. El resultado es un
movimiento neto a lo largo de la superficie endotelial. Otras moléculas que participan
en esta movilización son las moléculas de adhesión vascular (VCAM-1) presentes en
el endotelio, cuyos ligando correspondiente muestran preferencia por los linfocitos T y
eosinófilos.

En un punto específico, determinado por la presencia y activación de quimiocinas, los

fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el
endotelio por medio de integrinas y otros ligando endoteliales. En especial las
moléculas endoteliales LFA-a, CR3 y VLA-4 se adhieren a ligando específicos sobre
los fagocitos, entre ellos VCAM-1 e ICAM-1. La expresión de estos ligando sobre la
superficie del fagocito es regulada por proteínas inflamatorias, como el TNF y la IL-1.

Es en ese punto de movilización lenta cuando los fagocitos, atraídos por gradientes de
concentración de las quimiocinas, atraviesan el epitelio vascular hacia el foco de
infección patógena. Los receptores sobre la membrana de los fagocitos actúan como
mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos microbianos
específicos o sobre opsoninas (opsonización) del sistema inmune del hospedador.

La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación intracelular

que resultan en la evaginación de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su
ligando patogénico. Al rodear por completo al complejo receptor-molécula, la
membrana se une en sus extremos y libera al interior de la célula un fagosoma. Esto
puede ocurrir en más de un punto de la membrana celular.

Una vez que el fagolisosoma es formado comienza la desintegración del

micororganismo, proceso que se realiza por mecanismos dependientes o
independientes de Oxígeno. El primero se da tras activarse rutas metabólicas que
consumen oxígeno, como el sistema de la NADPH oxidasa, el cual produce la liberación
de radicales libres del oxígeno, que se constituyen en el principal mecanismo
bactericida para los microorganismos. En el segundo caso se liberan enzimas
hidrolíticas que destruirán al antígeno.

OBJETIVO
1. Comprender el proceso de fagocitosis in vivo y aplicar los conocimientos en
casos de daño tisular, o invasión de múltiples microorganismos o sustancias.

29
MATERIAL Y MÉTODOS:

1. De laboratorio:

• Tubos de ensayo.
• Mechero y asa bacteriológica, en anillo.
• Centrífuga
• Solución salina fisiológica estéril
• Tubo Nº 3 de Mc. Farland
• Estufa y Baño María
• Agujas hipodérmicas
• Tabla de disección
• Estuche de disección
• Láminas porta-objetos
• Soporte de coloración
• Colorante de Wright y azul de metileno
• Agua destilada
• Microscopio
• Aceite de cedro

2. Biológico:
• Cultivo de Escherichia coli
• Rata blanca adulta

PROCEDIMIENTO:

1. Obtención del inóculo bacteriano

• Sembrar la cepa de E. coli en caldo nutritivo e incubar a 37 ºC por 18 horas

• Centrifugar a 1500r.p.m. durante 15 minutos, eliminar el sobrenadante y agregar
solución salina fisiológica (repetir esta acción tres veces)
• Hacer una suspensión del cultivo equivalente a la turbidez del tubo Nº 03 del
Nefelómetro de McFarland
• Llevar la suspensión a baño maría a 85 ºC durante 60 min.

2. Inoculación: PRIMERA FASE

• Inoculación de 1 mL de suspensión de E. coli (cultivo muerto), mezclado con
saponina (50/50), vía intraperitoneal en ratas blancas adultas.
• Dejar reposar las ratas 48 horas.

3. Inoculación: SEGUNDA FASE

• A la misma rata, inoculación de E. coli (cultivo vivo), vía intraperitoneal.
• Dejar reposar las ratas 4 horas

4. Disección de las ratas

• Luego, diseccionar la rata para la obtención de líquido intraperitoneal con hisopos
estériles.
• Extender los hisopos sobre 4 láminas portaobjetos, secar al mechero.
• Colorear con Wright o azul de metileno y observar al microscopio.
• Dibujar sus resultados y preparación de su informe.

30
TAREA DE LABORATORIO

1. ¿Cuál es la finalidad de inocular primero el germen muerto?

Se inocula el germen muerto con la finalidad de reducir la patogenia o

virulencia, para poder exponer al organismo a este patógeno sin poner
en riesgo o exponer la vida del individuo expuesto.

2. ¿Cuál es el papel de la saponina?

Actúa como inmunomodulador, coadyuvante basado en emulsiones

oleosas y surfactantes
Los adyuvantes actúan a través de los siguientes mecanismos:

1) Acción sobre la inmunidad innata y adquirida.

2) Inducción de citocinas inmunorreguladoras.

3) Efectos sobre células presentadoras de antígenos (CPA).

4) Efecto sobre la liberación antigénica.

3. ¿Por qué se inocula por segunda vez el germen vivo?

Se inocula por segunda vez el germen vivo para poder observar la

respuesta fisiológica normal en un individuo y para que haya una
respuesta inmune rápida y efectiva.

31
4. COLOCAR LAS FOTOS DE SU PROCEDIMIENTO

32
33
 PRÁCTICA 07

SISTEMA SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RH

INTRODUCCIÓN

En 1818, James Blundell, Fisiólogo Inglés, hizo la primera transfusión de hombre a

hombre y para 1875 ya se habían hecho unas 350 transfusiones en humanos. En 1899
Shattock informó sobre la aglutinación de eritrocitos de algunas personas con el suero de
otras e interpretó este fenómeno como anormal. Fue Karl Landsteiner, quien descubrió
las diferencias de la sangre entre grupos de personas y con su teoría sobre la
especificidad de las reacciones serológicas (1900) dio inicio a la era inmunológica de la
historia de la transfusión sanguínea.

Lanomenclaturaaceptadaen1928porla Liga de las Naciones fue la de Jansky, quien

propuso cuatro grupos sanguíneos:(A, B, O, AB). El descubrimiento de los grupos sanguíneos
revolucionó la práctica de la transfusión sanguínea puesto que ya con este hallazgo era
posible seleccionar los donantes mediante pruebas pretransfusiónales in vitro. El avance en
la tecnología permitió el almacenamiento seguro de sangre y dio lugar a la formación del
primer banco de sangre en Estados Unidos en el Cook Country Hospital de Chicago en 1937.
En los últimos años se ha logrado avanzar al grado de permitir la transfusión de múltiples
fracciones de sangre.
Las membranas de las células del organismo humano, incluyendo los eritrocitos, están
formadas por varias capas de moléculas lipídicas, proteicas, y carbohidratos distribuidos en tal
forma que permiten una separación entre el medio intracelular y el medio extracelular. Muchas
de estas sustancias, es decir, glicolípidos y glicoproteínas tienen capacidad antigénica y
constituyen los llamados grupos sanguíneos. Se cree también que algunos grupos
sanguíneos son proteínas puras, pero es posible que dichas sustancias solo sean las
portadoras de los determinantes antigénicos y que siempre necesiten de lípidos o
carbohidratos para efectuar como antígenos completos.
Estos antígenos de la membrana están determinados genéticamente. Los genes que
controlan la estructura de un antígeno en particular, ocupan un lugar correspondiente
(loci) en un par de cromosomas homólogos, en esta forma para todos los genes que se
encuentran en cromosomas autosómicos un individuo puede ser homocigoto o
heterocigoto. El único grupo sanguíneo que no es autosómico es el sistema XG cuyos
genes están en el cromosoma X.
Estos antígenos pueden formar parte de la membrana del glóbulo rojo como ser el
antígeno Rh que es una lipoproteina o estar adherido a la superficie de los glóbulos rojos,
como los antígenos ABO que químicamente son lipopolisacáridos. Algunos antígenos
sanguíneos (Ej. ABO) están presentes en la mayoría de los tejidos y líquidos corporales
y otros como el Rh, K, etc. limitados y formando parte de las membranas de los glóbulos
rojos. Hoy en día se conocen más de 15 sistemas de grupos sanguíneos distintos como
muchas variantes dentro de cada sistema, la mayoría tienen 2 o 3 alelos pero por ejemplo
el Rh tiene por lo menos 28 alelos.
Los antígenos A y B son glicoproteínas, producidas por genes alelicos en un locus único,
localizados en la parte proximal del brazo corte del cromosoma 9. Los antígenos
correspondientes se encuentran aparentemente adheridos a la membrana de los glóbulos
rojos. La especificidad antigénica es conferida por el azúcar, terminal; Ej. Azúcar N-
aceteilgalactosamina proporciona la especificidad antigénica A y el azúcar galactosa
determina la actividad B. Los antígenos ABO están presentes en todos los tejidos excepto
el sistema nervioso central, de donde se deduce la importancia de dicho sistema en

34
transfusión de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y transplantes de tejidos, también se
encuentran presentes en las secreciones, como polisacáridos solubles. El polisacárido
presente en las secreciones es químicamente idéntico al presente en los glóbulos rojos.

SISTEMAS SANGUÍNEOS ESTABLECIDOS

SISTEMA SANGUÍNEO ABO

35
 OBJETIVOS

1. Adiestrar al alumno en la determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh

2. Capacitar al alumno en la interpretación clínica de resultados en relación al sistema ABO y
Rh

PROCEDIMIENTO

Determinación del grupo hemático:

1. Masajear enérgicamente la yema de un dedo y limpiar con algodón humedecido en

alcohol. Dejar unos segundos que evapore y pinchar con la lanceta estéril. Sobre el
portaobjetos, depositar tres gotas de aproximadamente
0.5 cm de diámetro, bien separadas.
2. Sobre cada gota de sangre de la lámina porta se pipetean 10 µl del Ac
correspondiente. El orden recomendable es (de izquierda a derecha): anti-A, anti-B, anti-
D.
3. Mezclar bien la sangre y el Ac con una punta limpia para cada gota.
4. Casi instantáneamente podrá ver los resultados de A y B.
5. Para D, espere al menos tres minutos moviendo la lámina porta ligeramente. En caso de
duda, visualice con transiluminador omicroscopio.

TAREA DE LABORATORIO
1. Explique a qué tipo de reacción serológica corresponde la determinación del grupo sanguíneo.
Existen varios métodos in vitro para detectar reacciones de antígeno-anticuerpo, los más utilizados en
serología de Banco de Sangre son: Aglutinación y hemolisis
AGLUTINACIÓN: Es el fenómeno in vitro más comúnmente utilizado en serología de Banco de Sangre.
Existen dos fases:
1)Sensibilización: en la cual el anticuerpo se adhiere físicamente al antígeno específico de la superficie
de los glóbulos rojos (con o sin fijación de complemento) y no es visible.
2)Aglutinación de eritrocitos, visible in vitro, en el que se forman puentes o uniones entre eritrocitos
sensibilizados. Si los anticuerpos son IgM la aglutinación ocurre inmediatamente después de la
sensibilización. Para demostrar sensibilización por anticuerpos IgG es necesario utilizar soluciones o
medios potenciadores. Los fenómenos de sensibilización y aglutinación están influenciados por varios
factores: temperatura (La temperatura para reacción óptima de anticuerpos varía: ej. IgG tiende a
reaccionar mejor a 37° C e IgM a temperatura ambiente o temperaturas frías), pH, tiempo de incubación
(necesario para que la reacción antígeno anticuerpo alcance un equilibrio) fuerza iónica del medio, etc.
HEMOLISIS: Algunos anticuerpos cuando reaccionan contra antígenos o grupos sanguíneos
específicos producen por consiguiente lisas de los eritrocitos. Estos anticuerpos se llaman hemolisinas,
Ej: Anti A, antí B, antí AB, Lea, Leb, JKb, etc.

2. Explique porqué una persona del grupo A no puede ser donador para un receptor del grupo B.
La razón de porque el grupo A no puede ser donador a un grupo B es porque tiene diferentes antígenos y
diferentes anticuerpos, en caso del grupo A tiene antígeno A y anticuerpo anti-B, mientras en grupo B tiene
antigeno B y anticuerpo anti-A, al combinarlos los anti-A del grupo B van a atacar a los antígenos A del grupo
A, produciendo aglutinación.

3. Explique porqué el grupo “O” es considerado donador universal.

Porque no presenta antígenos ni para “A” ni para “B” y al no tenerlo se le hace más fácil combinarse con
otro tipo de sangre sin que los anticuerpos del receptor los ataque.

36
4. Explique porque el grupo “AB” es considerado como receptor universal.

Porque no presenta anticuerpos ni para “A” ni para “B”, y al no tenerlo se le hace más fácil
recibir otro tipo de sangre sin que ataque a estos con sus anticuerpos.

5. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre grupo “A” y la

madre grupo “B”

25 % AB
Genotipo A y O A O
25% A
B AB BO
O AO OO 25% B
25% O

Genotipo de A y B B B
A AB AB RESULTADOS:
A AB AB HIJOS AB =100%

6. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre del grupo “O”
y la madre del grupo “AB”

Genotipo de AB y O O O
A AO AO
B BO BO

50% A
50% B

7. Con esquemas, explique en qué consiste la eritroblastosis fetal, proceso que puede
presentarse en algunos embarazos como consecuencia del factor Rh.

EMBARAZO II EMBARAZO

Feto Rh (+)
Feto RH (+) AgD Madre Rh (+)
Madre Rh (-) Hemólisis Fetal

Producción de Ac´s
anti o fetales

37
 MUERTO

MACROFAGO

ERITOBLASTOCIS FETAL

38
39
 PRÁCTICA Nro. 08

PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO

INTRODUCCIÓN:

REACCIÓN DE WIDAL: demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes

(aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en
el suero de los pacientes con fiebre tifoidea y también mide los antígenos somáticos de
S. paratyphí “A”, S. paratyphi "B". Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego
de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses.
Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días, alcanzando títulos
más elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por más de 1 año.

LA PROTEINA C-REACTIVA (PCR); es una proteína sanguínea que forma parte de las
denominadas Proteínas de Fase Aguda que tiene la propiedad de precipitar los
polisacáridos somáticos de los neumococos. La PCR comúnmente se encuentra
aumentada en artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre
reumatoidea activa, infarto agudo del miocardio, luego de una operación quirúrgica y de
transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR indica la intensidad de la
enfermedad y la respuesta del paciente a un tratamiento dado. La PCR se detecta en
suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de
látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las
partículas de látex, visible macroscópicamente.

LA ARTRITIS REUMATOIDEA; es un Síndrome crónico de origen desconocido; se

caracteriza por la inflamación simétrica de las articulaciones. Los factores reumatoideos
generalmente de tipo IgM reaccionan con las fracciones Fc. de las IgG. El factor
reumatoideo de tipo IgM se detecta en presencia de Gamma-inmunoglobulina o fracción
II de Cohn (que actúa como antígeno) adsorbida sobre un soporte inerte de látex
poliestireno. El antígeno se une a los FR (anti - IgG) produciendo una aglutinación de las
partículas de látex poliestireno, visible macroscópicamente.

ANTIESTREPTOLISINA-O (AS0) es la medición de anticuerpos anti-Estreptococo

betahemolíticos del tipo A (Streptococcus pyogenes). Esta bacteria produce una enzima
llamada estreptolisina O, que puede destruir los hematíes y el cuerpo reacciona contra ella
produciendo anticuerpos específicos antiestreptolisina O. La presencia de títulos altos de
antiestreptolisinas O ó ASLO, indican una infección por la bacteria Estreptococo
betahemolíticos del tipo A, que puede producir una glomerulonefritis, una fiebre
reumática, una endocarditis bacteriana o una escarlatina.
SÍFILIS: es una infección sistémica de evolución crónica, con períodos asintomáticos,
causada por Treponema pallidum. Es un patógeno exclusivo del hombre, quien es su
único reservorio. Se adquiere por contacto directo con una lesión de sífilis reciente, por
vía transplacentaria y raramente por transfusión de sangre. T. pallidum penetra a través
de mucosa sana o piel erosionada y rápidamente disemina en el organismo, por lo que
desde etapas precoces la infección es sistémica.
Las pruebas serológicas no treponémicas como el VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory) o RPR (Rapid Plasma Reagin) son fáciles de realizar, tienen escaso costo
económico, son útiles para el diagnóstico y esenciales para controlar la respuesta al
tratamiento, para lo cual se necesita que el estudio sea cuantitativo. Resultan reactivas
después de 14 a 20 días de aparecido el chancro.

40
Aunque estas pruebas habitualmente se negativizan después del tratamiento, en algunos
pacientes persisten reactivas por el resto de su vida, pero con títulos bajos. Un descenso no
significativo de los títulos o un nuevo ascenso después del tratamiento, hace sospechar
fracaso terapéutico o reinfección.
El objetivo de la práctica es:
1. Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.

MATERIAL Y MÉTODOS:

1. REACCIÓN DE WIDAL: (Aglutinaciones)

• Sobre una placa de cristal “escavada” se coloca en fila 80 uL de suero del

paciente sin diluir (5 en total). Agregar 1 gota de los antígenos correspondientes
para S. typhí "O", S. typhí "H", S. paratyphi "A", S. paratyphi "B” y Brucela.
• Se mezcla el suero con el antígeno, mover la placa varias veces hacia atrás y
hacia adelante por 5 minutos y se procede a la observación de una reacción de
aglutinación visible.
• Con los antígenos positivos repetir con cantidades de 40, 20, 10 y 5 uL,
respectivamente. Con este procedimiento los anticuerpos resultan titulados en
1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320, respectivamente.

Negativo: No hay aglutinación.

Positivo: Aglutinación.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce la aglutinación.

2. PROTEÍNA C – REACTIVA

• Preparar una muestra diluida 1:20 de suero en un tubo de ensayo, mezclando

1 gota (50uL) del suero con 1 mL. de buffer glicina. Luego, en una placa de
vidrio mezclar una gota (50 uL) del reactivo de látex y una gota (50 uL) del suero
diluido.
• Inmediatamente poner en marcha el cronómetro, balanceando suavemente la
placa de vidrio por tres minutos. Observar la aglutinación sobre un fondo negro
y por encima de un haz luminoso.

Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas de: 1:40,
1:80, 1:160, etc.

Negativo : No hay aglutinación

Positivo : Aglutinación que aparece a los tres minutos.
Título : Inversa de la máxima dilución en la que se observa
aglutinación.

3. ARTRITEST:
• Diluir una muestra de suero 1: 20 con buffer glicina. En una placa de vidrio
colocar separadamente el suero diluido 1 gota (50 uL) y una gota de reactivo
de látex-globulina. Mezclar con un palillo descartaba hasta obtener una
suspensión uniforme,
• Inmediatamente disparar el cronómetro, balanceando suavemente la placa de
vidrio observando el resultado dentro de los dos minutos.
• Para la titulación de los sueros se hacen diluciones en tubos, colocando 1,9
mL de buffer glicina en el primer tubo y 1 mL en los restantes.

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 • Agregar 0,1 mL de suero al tubo Nº 1 mezclando, luego transferir 1 mL de la
dilución al tubo Nº 2, y así se continua con el resto de los tubos. Se obtienen
diluciones de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.

Negativo: No se ve aglutinación.
Positivo: Aglutinación dentro de los dos minutos.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce aglutinación.

4. ANTIESTREPTOLISINA-O (ASO)
• Llevar los reactivosylamuestraatemperaturaambiente. Agitar el Reactivo Aantes
de usar, vaciando previamentelapipetadelgotero.
• En uno delos sectores delimitados dela placa adjunta al equipo colocar: 1 gota
del Reactivo A(25ul)másla muestra ycontroles25ul.
• Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una
suspensiónuniforme enlasuperficie delimitada delaplaca.
• Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.

Negativo: suspensión homogénea.

Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1
a 4 +.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible
macroscópicamente.

5. El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para

detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos, del tipo reagina, producidos por
el individuo ante una infección sifilítica.
• En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo VDRL,
agitar constantemente por 5 minutos y observar al microscopio con objetivo
10X la floculación formada.
• Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32,
colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo VDRL.

Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.

6. El RPR es una prueba de floculación diseñada para detectar reagina en el suero de

pacientes con sífilis de manera rápida. La muestra se mezcla con una suspensión
que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón.

• En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo RPR,
agitar constantemente por 5 minutos y observar floculación visible.
• Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32,
colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo RPR.

Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.

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 TAREA DE LABORATORIO:

1. Defina que es una reacción serológica directa e indirecta

Prueba Directa: Basado en el principio de la reacción Ag-Ac, investiga la

presencia de Ag. En la enfermedad infecciosa equivale a decir que
investiga la presencia del Ag. etiológico.

Prueba Indirecta: Está basada en la reacción Ag- Ac, no el agente en sí ,

la huella que dejó este al pasar por su huésped en términos de una
respuesta inmune puesta en evidencia.

2. Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación

Las reacciones de aglutinación y precipitación son la base de la mayor parte

de las técnicas inmunológicas. Sus principios se basan en la reacción Ag- Ac

Prueba de Aglutinación: La reacción de aglutinación se desarrolla con un

simple mecanismo. Se coloca una dilución que contenga anticuerpos
específicos contra determinados grupos antígenos del antígeno en
suspensión.

Prueba de Precipitación: En este caso son utilizados antígenos solubles que

se difunden frente a los anticuerpos, la unión antígeno- anticuerpo precipita de
forma visible y permite entablar la presencia de anticuerpos específicos

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3. Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.

Éste tipo de aglutinación se lleva a cabo utilizando eritrocitos recubiertos de

antígenos o anticuerpos acoplados de manera espontánea o mediante un
acoplamiento químico, utilizando diversas sustancias, como el BOB, cloruro
crómico, glutaaldehído.

4. Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas en

el laboratorio.

PCR Positivo (Aglutina) Cualitativa

ASO Negativo (Indirecta) Cualitativa

Factor Reumatoide: Aglutinación

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5. Diga porque las pruebas de VDRL y RPR son consideradas no treponémicas.
Mencione que pruebas serológicas son del tipo treponémicas.

- Se consideran así porque no tiene el antígeno TREPONEMA PALLIDUM

- Las pruebas treponémicas son las que detectan Ags por IgG e IgM, compiten
contra T.Pallidum gracias a los Ag de la membrana del protozoo.

- Son consideradas pruebas no treponémica ya que estas pruebas están

basadas en antígenos en solución alcohólica, que contienen cardiolipina,
colesterol y lecitina purificada en cantidad adecuada para producir
reacciones estándares.

- Se denomina reagina a una proteína similar a un anticuerpo, que se une a

un antígeno, como pueden ser la cardiolipina y la lecitina en las pruebas no-
treponémicas, y se denomina anticuerpos reagínicos a anticuerpos no-
treponémicos, producidos por un individuo infectado con T pallidum, contra
sus propios tejidos o contra células de mamíferos. Estos anticuerpos
reagínicos, no son exclusivos de la sífilis y también son producidos en otras
enfermedades infecciosas como son el sarampión, varicela, hepatitis,
mononucleosis infecciosa, lepra, tuberculosis, malaria, leptospirosis,
tripanosomiasis, linfogranuloma venéreo, o por personas con enfermedades
autoinmunes, drogadictos, individuos que han recibido alguna inmunización
recientemente, embarazo y en edad avanzada.

PRUEBAS TREPONÉMICAS

Las pruebas treponémicas comprenden FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody

absorption), y sus variantes FTA-ABS-DS (FTA-double staining), 19S-IgM-FTA-
ABS; MHA-TP (Microhemaglutinación para T. pallidum), y TPI (T pallidum
immobilization), de los cuales el último es obsoleto por su baja sensibilidad en la
sífilis primaria.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

1. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Laboratorio de Análisis

Biológicos. Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad
Nacional de Trujillo. 8va. Edición. 2017.
2. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Fisiología y Genética
Bacteriana.Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad
Nacional de Trujillo. 8va. Edición. 2017.
3. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Manual de Prácticas de
Laboratorio de Inmunología. Universidad Autónoma de México. México
2015.
4. Rubio-Pedraza, Gonzalo. Manual de Prácticas de Inmunología Clínica.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología.
Facultad de Medicina. Universidad de Murcia. España 2014.
5. Martínez-Romero, Aurora y Ortega-Sánchez, José. Manual de
Laboratorio de Inmunología Básica y Clínica. Como un suplemento de
REDVET Revista electrónica de Veterinaria
(http://www.veterinaria.org/revistas/redvet). Abril, 2011
6. Paz-Morales, Ana y Gaitán-Fernández, Isabel. Manual de Prácticas de
Laboratorio de Inmunología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad
Mariano Gálvez. Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud.
Guatemala 2013.

Enlaces:

• http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/tema-07.pdf

• http://anatobioterio.blogspot.com/2011/03/tecnicas-de-inoculacion.html

• http://www.uap.edu.pe/intranet/fac/material/04/20122BX040104234040104011/
20122BX04010423404010401137640.pdf

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