Upao-Manual de Practica de Inmunologia - Actualizada-12-09-2022

UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO - FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA

MANUAL DE PRACTICAS INMUNOLOGIA BASICA
PRÁCTICA 01
BIOSEGURIDAD Y SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos,

especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes biológicos, los cuales
son conocidos como Niveles de bioseguridad, la clasificación de cada laboratorio
identifica el riesgo biológico que representan para la salud los agentes que ahí se
manejan.
Nivel de Bioseguridad 1: En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro
mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se requiere
equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. El laboratorio no
está necesariamente aislado de las demás instalaciones del edificio. El trabajo se realiza
generalmente en mesas de trabajo abiertas. Por lo general, los materiales contaminados
se desechan en recipientes de residuos abiertos. Incluye varios tipos de bacterias y virus
como la hepatitis canina, Escherichia coli no patógena, Staphylococcus epidermidis,
Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, Sacharomyces cerevisiae, Penicillium
roqueforti, así como algunos cultivos de células.
Nivel de Bioseguridad 2: En él se manejan agentes de peligro moderado hacia el

personal y el ambiente y el personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el
manejo de agentes patógenos como las bacterias Bordetella pertussis, Clostridium
botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Streptococcus, Micobacterias oportunistas, Haemophilus
influenzae, Yersinia enterocolitica, Salmonelas gastroenteríticas, Shigella, Legionella,
Borrelia, Neiserias patógenas, Vibrio, Treponema pallidum y virus como Adenovirus,
Parvovirus B19, Rotavirus, Virus de la hepatitis A, Virus de la gripe, Virus del sarampión,
Virus de las paperas, Virus de la rubéola. . El acceso al laboratorio es restringido cuando
se está realizando algún trabajo. Se toman precauciones extremas con instrumentos
punzocortantes contaminados. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los
agentes o aerosoles se llevan a cabo en gabinetes de trabajo biológico.
Nivel de Bioseguridad 3: Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clínicos

de diagnóstico, laboratorios universitarios de investigación, en el cual se realiza trabajo
con agentes exóticos o que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como
resultado de la inhalación o exposición a los mismos, como las bacterias Bacillus
anthracis, Brucella, Escherichia coli (verotoxigénica), Francisella tularensis,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Rickettsias, Salmonella ser. Typhi,
Shigella dysenteriae ser. 1, Yersinia pestis; y los virus Virus de la encefalitis de California,
Virus de la encefalitis equina americana, Virus de la estomatitis vesicular, Virus de la
hepatitis B, Virus de la hepatitis C, Virus de la hepatitis D, Virus de la fiebre amarilla, VIH.
El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales y todos los materiales
son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección. El personal de laboratorio
tiene una formación específica en el manejo de patógenos y agentes potencialmente
letales, y son supervisados por científicos competentes con experiencia en el trabajo con
estos agentes. El acceso al laboratorio está restringido.
Nivel de Bioseguridad 4: Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes
biológicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que además son un
riesgo para la vida. Por lo regular los científicos que trabajan aquí, utilizan trajes
1
especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que además tienen una leve
sobrepresión para evitar que entren partículas infecciosas al mismo si es que éste llega
a desgarrarse. Además, las instalaciones están en un edificio separado o en un área
controlada dentro de un edificio, que está completamente aislado de las demás áreas
del edificio. Las enfermedades infecciosas que se manejan en el nivel 4 son: Virus de
la viruela, Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo), Virus de Marburg, Virus
Ébola.
OBJETIVO GENERAL
 Aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunología.
Objetivos Específicos.
 Familiarizar al estudiante con las normas de bioseguridad en el laboratorio de
inmunología.
 Hacer conocer la importancia de los riesgos biológicos del manejo de material
infeccioso.
 Aplicar los conocimientos en la resolución de casos de accidente ocupacional
con material infeccioso.
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
1. Requisito indispensable: Antes de realizar cada práctica leer cuidadosamente

el protocolo de la práctica para familiarizarse con el trabajo que va a desarrollar.
Al conocer el protocolo disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y
además puede aprovechar el tiempo de manera eficaz.
2. Prohibido: Comer, beber, fumar y distraer al profesor a la hora de la práctica.
Prohibido el acceso a toda persona ajena al área.
3. Protección: Llevar el equipo de protección personal necesario. Esto garantiza
que cualquier accidente que pueda ocurrir sea de menor gravedad, de no acatar
las reglas no se permitirá acceso a la práctica.
4. Material y Equipo: Debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para
la práctica que va a desarrollar. Ser cuidadoso con todo el material y equipo que
utilice para evitar accidentes y deterioro del mismo en las prácticas.
5. Limpieza: Dentro del área que se va a trabajar se comienza limpiando el área de
trabajo y se repite este procedimiento después de que se haya terminado. El
material de desecho depositarlo en el lugar que corresponde y el material
reutilizable lavarlo y desinfectarlo.
6. Higiene: Durante la sesión de trabajo lavarse las manos con agua y jabón antes
de hacer cualquier procedimiento y al finalizar repita el mismo procedimiento para
mantener buenas condiciones higiénicas.
7. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacíos, jeringas, cubre
bocas, portaobjetos, cubreobjetos, etc., no reciclar y desecharlos.
8. Indisciplina: Se sancionará con la expulsión parcial o total del alumno, según el
caso lo requiera.
9. Responsabilidades: En caso de accidente o lesión, avisar inmediatamente al
profesor o responsable de la práctica para que pueda auxiliar con rapidez y
eficacia al alumno.
RECOMENDACIONES:
1. Todo material biológico humano se manipula como si fuera potencialmente

infeccioso.
2. Protección personal: bata y guantes. Las heridas se traen cubiertas con
apósitos impermeables. La ropa de calle es un elemento adicional de
2
protección, se desaconseja el pantalón corto o el calzado abierto.

3. El cabello largo debe estar atado atrás o arreglado de manera que no entre en
contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el
equipo.
4. Para trabajar, se colocan las muestras, reactivos etc. en la parte delantera de
la zona de trabajo, así se evita golpearlos con los brazos en un descuido.
5. Antes de utilizar un reactivo, se observa si tiene símbolos y avisos sobre su
toxicidad y riesgo de manejo (generalmente en recuadros de color naranja).
6. En el laboratorio no se debe comer, beber, aplicarse cosméticos u oler
reactivos o muestras directamente.
7. No arrojar a la papelera o desagüe material usado sin consultar al profesor.
Los residuos y el material punzante (puntas de pipeta, agujas, hojas de bisturí,
cubreobjetos y similares) se desechan en los contenedores repartidos por las
mesas.
8. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las áreas que no son de
laboratorio (pasillos, biblioteca, etc.).
9. Las manos deben ser lavadas después que se han quitado los guantes y antes
de dejar el laboratorio, así como en cualquier momento después de manipular
material conocido o sospechoso de estar contaminado.
10. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y después de
cualquier salpicadura de material potencialmente infeccioso.
11. Todo material contaminado, sólido o líquido, debe ser descontaminado antes
de descartarlo o de reusarlo.
ACCIDENTES:
1) Las salpicaduras o derrames en la piel intacta se deben lavar inmediatamente

con jabón y agua abundantes.
2) Las salpicaduras a mucosas (ej. a la boca), deben lavarse con agua corriente
durante 15 minutos. Las salpicaduras a los ojos se lavarán de inmediato con
frasco lavaojos o con agua corriente manteniendo los ojos muy abiertos con
los dedos.
3) Las inoculaciones percutáneas (ej. arañazo o corte con instrumental usado)
deben lavarse con agua y jabón, dejar, en su caso, fluir la sangre libremente
3 minutos, desinfectar con povidona yodada y cubrir con un apósito
impermeable. En todos los casos se comunicará el incidente al profesor.
MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS (RPBI)
Los residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), son los que contienen bacterias,
hongos, virus, parásitos, microorganismos capaces de causar infecciones, efectos
nocivos para la salud y el medio ambiente.
Los RPBI se clasifican en:

1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc.
2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas de
cultivo, etc.
3. Residuos patológicos: residuos de tejidos, órganos, partes y fluidos corporales,
etc.
4. Residuos no anatómicos derivados de la atención a pacientes y de los
laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc.
5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas, jeringas, pipetas
Pasteur, porta y cubreobjetos, etc.
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Color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:
Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Sólidos Bolsas de plástico Rojo
Cultivos y cepas de Líquidos Recipientes Rojo
agentes infecciosos. herméticos
Residuos no anatómicos
Patológicos Sólidos Bolsas de plástico Amarillo
Patológicos Líquidos Recipientes Amarillo
herméticos
Objetos Sólidos Recipientes rígidos Rojo
punzocortantes
SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO
Se entiende por señalización de seguridad y de salud a la que referida a un objeto,

actividad o situación determinadas, proporcione una indicación o una obligación relativa
a la seguridad o la salud en el trabajo mediante señal en forma de panel, un color, una
señal luminosa o acústica, una comunicación verbal o una señal gestual, según proceda.
Pictograma es la imagen que describe una situación u obliga a un comportamiento
determinado utilizado sobre una señal en forma de panel o sobre una superficie luminosa.
En principio, los lugares de trabajo deben ser señalizados con los pictogramas que se
ajusten a las características de las tareas que se lleve a cabo en el laboratorio/ taller.
Requisitos de utilización
 La altura y posición de las señales deberá tener en cuenta su relación con el

ángulo visual.
 El lugar del emplazamiento de la señal debe estar iluminado, ser accesible y
fácilmente visible.
 Las señales deben retirarse cuando deje de existir la situación que las justifica.
CLASIFICACIÓN DE PICTOGRAMAS:
1. Señales de advertencia
 Forma triangular.
 Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros.
2. Señales de prohibición.
 Forma redonda
 Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos
3. Señales de obligación.
 Forma redonda
 Pictograma blanco sobre fondo azul
4. Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios.

 Forma rectangular o cuadrada
 Pictograma blanco sobre fondo rojo.
5. Señales de salvamento o socorro.

 Forma rectangular o cuadrada.
 Pictograma blanco con fondo verde.
4
TAREAS DE LABORATORIO:
1. Esquematizar dos pictogramas de cada uno de los 5 tipos expuestos
5
2. De forma sencilla esquematice el laboratorio con sus pictogramas y diga el

significado de cada uno. Sugiera cambios.
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PRÁCTICA NO. 01
VÍAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
INTRODUCCIÓN
La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación científica,
con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre.
La experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser buscado
lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética en cuanto
al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el hombre y para su
salud.
La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar

en cuenta si la especie en cuestión es susceptible a la enfermedad contra la cual
estamos elaborando el producto. Es importante, además, considerar el costo de los
animales, así como el de su mantenimiento, el tamaño y docilidad de los mismos, etc.
Un factor importante en bioterios (unidades en donde se crían estos animales) y en
laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y
arañazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos.
Los animales de experimentación han proporcionado modelos para la realización de

diferentes investigaciones en diferentes áreas de las ciencias de la vida. Los animales
deben tratarse con seriedad y cuidado y si el sacrificio es parte de la experimentación
ésta debe de realizarse bajo un protocolo de eutanasia apropiado. El manejo de estos
animales varía de especie a especie. Las especies que más se utilizan en el laboratorio
son el cobayo, ratón albino, rata albina y el Hamster, de ellos ofrecen mayor dificultad
la rata y el ratón porque al sentirse capturados muerden. El cobayo y Hamster son
sumamente dóciles.
La inoculación de sustancias es una práctica generalizada, y en el área de la

inmunología las inoculaciones representan la práctica más extendida, pero también
existen pruebas diagnósticas, los test alérgicos que demandan cierto conocimiento de
las diferentes vías de inoculación. Asimismo, la toma de muestras sanguíneas es un
procedimiento de rutina en la mayor parte de los laboratorios de inmunología, ya que a
través de este procedimiento se obtienen células, fluidos y moléculas tanto para la
investigación como para el diagnóstico.
OBJETIVO
 Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y VENOPUNCIÓN (SANGRADO)
1. Inoculación y venopunción intravenosa en ratón y rata. Introduzca al ratón en

un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la
cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se
dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja de 25. Para
la venopunción se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un
pedazo de la cola.
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1. Inoculación intraperitoneal en ratón, rata o cobayo. Sujete al animal con la mano,
con la parte ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de que
las vísceras se desplacen hacia abajo, limpie la región peritoneal con una torunda
y agua caliente; posteriormente, con una torunda desinfecte la zona, con la ayuda
de una jeringa tipo tuberculina con aguja delgada, se procede a la inoculación de
la sustancia a probar. Al introducir la aguja debe percibir que perfora los dos planos
(piel y pared abdominal).
2. Inoculación subcutánea en rata, ratón o cobayo. Con la ayuda de unas pinzas,

se inmoviliza al animal por atrás de las orejas, fije las pinzas del lado opuesto y jale
la cola. Con los dedos pulgar e índice forme un pliegue de la piel e introduzca la guja
por este pliegue.
3. Inoculación intramuscular. Se utiliza como una vía de administración sistémica,

en estudios de liberación lenta (formulaciones oleosas) y en valoración de vacunas.
La inyección debe hacerse en una masa grande, alejada de vasos sanguíneos y
nervios mayores. Se hará entre la cara lateral y la craneal de los músculos del muslo.
Inyecte lentamente, retire la aguja y dé masajes en la zona.
4. Punción cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona izquierda del tórax, localizar
el corazón y extraer lentamente lasangre usando una jeringa con aguja del número
20 x 32.
FOTOS QUE MUESTRAN LAS VÍAS DE INCOCULACIÓN
INOCULACIÓN O SANGRADO INTRAVENOSA INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL
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PUNCIÓN CARDIACA
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TAREA DE LABORATORIO: COLOCAR SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
CUESTIONARIO:
1. Anote los usos de la inoculación.
 Estudios de Inflamación; Sensibilización; Diagnóstico de flujo sanguíneo;

Inmunología.
 Vacunación
 Para obtener muestras
 Administración de medicamento
2. Anote los usos de la venopunción.

 Obtención de sangre con fines diagnósticos
 Recolectar sangre para transfusiones
 Administrar tratamientos terapéuticos: medicamentos, nutrición, quimioterapia
 Monitoreo de niveles de componentes sanguíneos
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PRÁCTICA 02
SISTEMA SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RH
INTRODUCCIÓN
En 1818, James Blundell, Fisiólogo Inglés, hizo la primera transfusión de hombre a

hombre y para 1875 ya se habían hecho unas 350 transfusiones en humanos. En 1899
Shattock informó sobre la aglutinación de eritrocitos de algunas personas con el suero de
otras e interpretó este fenómeno como anormal. Fue Karl Landsteiner, quien descubrió
las diferencias de la sangre entre grupos de personas y con su teoría sobre la
especificidad de las reacciones serológicas (1900) dio inicio a la era inmunológica de la
historia de la transfusión sanguínea.
Lanomenclaturaaceptadaen1928porla LigadelasNacionesfueladeJansky,quienpropuso
cuatro grupossanguíneos:(A, B, O, AB). Eldescubrimientodelosgrupossanguíneosrevolucionó
laprácticade latransfusiónsanguíneapuestoqueyaconestehallazgo eraposibleseleccionarlos
donantes mediante pruebas pretransfusiónales in vitro. El avance en la tecnología permitió el
almacenamiento seguro de sangre y dio lugar a la formación del primer banco de sangre en
Estados Unidos en el Cook Country Hospital de Chicago en 1937. En los últimos años se ha
logrado avanzar al grado de permitir la transfusióndemúltiplesfraccionesdesangre.
Las membranas de las células del organismo humano, incluyendo los eritrocitos, están
formadas por varias capas de moléculas lipídicas, proteicas, y carbohidratos distribuidos en tal
forma que permiten unaseparación entre elmedio intracelular yelmedio extracelular. Muchasde
estassustancias, esdecir, glicolípidos yglicoproteínastienencapacidad antigénicayconstituyen
los llamados grupos sanguíneos. Se cree también que algunos grupos sanguíneos son
proteínas puras, pero es posible que dichas sustancias solo sean las portadoras de los
determinantes antigénicos y que siempre necesiten de lípidos o carbohidratos para efectuar
como antígenoscompletos.
Estos antígenos de la membrana están determinados genéticamente. Los genes que
controlan la estructura de un antígeno en particular, ocupan un lugar correspondiente
(loci) en un par de cromosomas homólogos, en esta forma para todos los genes que se
encuentran en cromosomas autosómicos un individuo puede ser homocigoto o
heterocigoto. El único grupo sanguíneo que no es autosómico es el sistema XG cuyos
genes están en el cromosoma X.
Estos antígenos pueden formar parte de la membrana del glóbulo rojo como ser el
antígeno Rh que es una lipoproteina o estar adherido a la superficie de los glóbulos rojos,
como los antígenos ABO que químicamente son lipopolisacáridos. Algunos antígenos
sanguíneos (Ej. ABO) están presentes en la mayoría de los tejidos y líquidos corporales
y otros como el Rh, K, etc. limitados y formando parte de las membranas de los glóbulos
rojos. Hoy en día se conocen más de 15 sistemas de grupos sanguíneos distintos como
muchas variantes dentro de cada sistema, la mayoría tienen 2 o 3 alelos pero por ejemplo
el Rh tiene por lo menos 28 alelos.
Los antígenos A y B son glicoproteínas, producidas por genes alelicos en un locus único,
localizados en la parte proximal del brazo corte del cromosoma 9. Los antígenos
correspondientes se encuentran aparentemente adheridos a la membrana de los glóbulos
rojos. La especificidad antigénica es conferida por el azúcar, terminal; Ej. Azúcar N-
aceteilgalactosamina proporciona la especificidad antigénica A y el azúcar galactosa
determina la actividad B. Los antígenos ABO están presentes en todos los tejidos excepto
el sistema nervioso central, de donde se deduce la importancia de dicho sistema en
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transfusión de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y transplantes de tejidos, también se

encuentran presentes en las secreciones, como polisacáridos solubles. El polisacárido
presente en las secreciones es químicamente idéntico al presente en los glóbulos rojos.
SISTEMAS SANGUÍNEOS ESTABLECIDOS
SISTEMA SANGUÍNEO ABO
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OBJETIVOS
1. Adiestrar al alumno en la determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh
2. Capacitar al alumno en la interpretación clínica de resultados en relación al sistema
ABO y Rh
MATERIAL
 Portaobjetos. Rotulador para vidrio

 Lancetas estériles desechables
 Papel de filtro
 Alcohol de 96°
 Sueros anti-A, anti-B y anti-D
 Algodón
 Sangre obtenida por punción
PROCEDIMIENTO
Determinación del grupo hemático:

1. Masajear enérgicamente la yema de un dedo y limpiar con algodón humedecido
en alcohol. Dejar unos segundos que evapore y pinchar con la lanceta estéril.
Sobre el portaobjetos, depositar tres gotas de aproximadamente
0.5 cm de diámetro, bien separadas.
2. Sobre cada gota de sangre de la lámina porta se pipetean 10 µl del Ac
correspondiente. El orden recomendable es (de izquierda a derecha): anti-A,
anti-B, anti-D.
3. Mezclar bien la sangre y el Ac con una punta limpia para cada gota.
4. Casi instantáneamente podrá ver los resultados de A y B.
5. Para D, espere al menos tres minutos moviendo la lámina porta ligeramente. En
caso de duda, visualice con transiluminador omicroscopio.
TAREA DE LABORATORIO
1. Explique a qué tipo de reacción serológica corresponde la determinación del grupo
sanguíneo.
- Pertenece al tipo de reacción serológica por aglutinación, esta se produce por la

reacción antígeno - anticuerpo, generando que se forme un agregado de células.
Esta reacción se puede observar directamente sin utilizar un microscopio.
2. Explique porque una persona del grupo A no puede ser donador para un receptor del
grupo B.
- La persona con el grupo sanguíneo A en la membrana de sus eritrocitos tiene

antígenos de Tipo A, por qué genera Anticuerpos contra un antígeno que no sea
este, anticuerpos B. Entonces cuando una persona de tipo sanguíneo B dona
sangre a una persona de tipo A, los anticuerpos contra el antígeno B reaccionan
formando grandes agregados celulares que podemos ver (aglutinación),
posteriormente se produce la hemólisis.
3. Explique porque el grupo “O” es considerado donador universal.

- El grupo Sanguíneo O no presenta antígenos en la superficie de sus eritrocitos por lo que los
anticuerpos, anti A o Anti B, no podrán reaccionar y esto le permitirá donar sangre a todos
los grupos sanguíneos.
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4. Explique porque el grupo “AB” es considerado como receptor universal.

- El grupo AB + se considera como receptor universal porque en la superficie
de la membrana de sus eritrocitos va a presentar tanto antígenos A como
antígenos B, gracias a esto ni los anticuerpos anti A ni los anti B pueden
generar la aglutinación y posterior hemólisis.
5. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre grupo “A” y

la madre grupo “B”
6. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre del grupo

“O” y la madre del grupo “AB”
7. Con esquemas, explique en qué consiste la eritroblastosis fetal, proceso que puede
presentarse en algunos embarazos como consecuencia del factor Rh.
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COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
Grupo Genotipo
"A" AA, AO
"B" BB, BO
"AB" AB
"O" OO
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PRÁCTICA 03
TOMA DE MUESTRA PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Y PLASMA
INTRODUCCIÓN
El sistema hematopoyético (Hema = sangre, poyesis = producción, fabricación) es el

sistema encargado de la formación de la sangre. La sangre es un tejido líquido,
compuesto por agua y sustancias orgánicas e inorgánicas (sales minerales) disueltas,
que forman el plasma sanguíneo y tres tipos de elementos formes o células
sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas.
Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas que conforman la sangre se
producen en la parte esponjosa (médula roja) de algunos huesos del esqueleto (esos
son: el esternón, los huesos del cráneo, las costillas, el hueso ilíaco y las terminaciones
de los huesos de los miembros superiores e inferiores.
En la médula ósea roja de los huesos se encuentran las células hematopoyéticas

pluripotenciales de las que derivan todas las células de la sangre. Hasta los 5 años de
edad estas células tienen su origen en, prácticamente, todos los huesos del cuerpo.
Después de los 20 años, los glóbulos rojos, blancos y plaquetas son producidos
principalmente por la médula de los huesos planos, como las vértebras, el esternón y
las costillas.
Se puede realizar un examen físico o químico de la sangre, para lo cual se la obtiene

por punción venosa o por punción del pulpejo del dedo (sangre capilar) con lanceta
estéril. Para casi todo el trabajo hematológico se utiliza sangre total. Ello exige el uso
de anticoagulantes, los cuales impiden que el calcio actúe en la coagulación, sea
precipitándolo como sal insoluble (oxalatos) o fijándolo en forma no ionizada (citrato,
EDTA). La heparina actúa como agente antitrombínico, o sea neutraliza a la trombina.
Así mismo, casi todas las determinaciones bioquímicas en el laboratorio utilizan suero,
el cual se obtiene tomando la muestra en un tubo de ensayo y se lo deja coagular, para
la separación del suero.
Usualmente en adultos se utilizan las venas del pliegue antecubital del brazo, pero
también pueden ser otras zonas como, por ejemplo: del antebrazo, dorso de la mano,
dorso del pie, etc.
La práctica tiene por objetivos:
1. Adiestrar al alumno en la extracción de muestras de sangre del antebrazo para

la obtención de sangre total, suero y/o plasma.
2. Realizar extendidos sanguíneos en láminas portaobjetos.
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Equipo necesario para la venopunción: Equipo Vacutainer.
 Tubos de vacío diseñados para llenarse con un volumen predeterminado de
sangre por medio de vacío, esto garantiza una adecuada relación entre sangre y
anticoagulante. Los tapones de goma están codificados por color de acuerdo con
el aditivo que contienen así, por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los más
utilizados para hematología rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas
de coagulación.
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 Agujas especiales para adaptador.

 Adaptador para tubos de vacío.
 Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
 Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre
para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de 0.8mm (21G) para
evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-19G) se
utilizan normalmente para punción venosa en adultos.
 Torniquete: Generalmente una liga plana de látex.
 Alcohol: Etílico o isopropílico al 70%.
 Algodón
 Gasas y/o vendas adhesivas
 Dispensador de agujas
2. Etiquetado de los tubos
Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los
análisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el
etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analítica son:
 Nombre o iniciales del paciente
 Número de identificación del paciente
 Fecha y hora de la toma de muestra
 Iniciales del flebotomista
3. Punción venosa
La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las
pruebas necesarias en hematología. Las venas de elección suelen ser las de la
cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena cefálica y la vena basílica)
porque resulta fácil acceder a ellas.
Preparación del paciente
 Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la

existencia de problemas hemorrágicos o de circulación, o alergias.
 Evite puncionar en un área con hematoma, fístulas, quemaduras,
escoriaciones de la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado
mastectomía reciente.
 Avisar al paciente que al introducir la aguja sentirá dolor.
 Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba.
4. Punción capilar
Es utilizada para extraer pequeñas cantidades de sangre en determinaciones

de hemoglobina, hematocrito y frotes periféricos. Hay dos lugares de donde
realizar esta punción: el lóbulo de la oreja, la yema del dedo.
Metodología
 Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja.
 Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una
lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm.
 Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un
microtubo y prepare las laminillas con esa muestra.
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5. Algunos anticoagulantes utilizados en el laboratorio

 Oxalatos: Los oxalatos de amonio y potasio se utilizan en mezcla de 3 partes
del primero por 2 del segundo. La sal de amonio aumenta el volumen de los
GR y la de potasio lo disminuye, por tanto, es muy usado en hematología. El
oxalato de potasio sólo se utiliza en bioquímica.
 Citratos: Se utiliza la sal disódica al 3.8% (peso x volumen) en proporción
de una parte de la sal por nueve de sangre.
 Dextrosa-citrato ácida: En las transfusiones de sangre y en pruebas
hematológicas para preservar los antígenos de los GR.
 Sequestrene: Sal dipotásica o disódica del EDTA. Por quelación impide que
se ionice el calcio por lo que ejerce una acción anticoagulante muy intensa.
 Fluoruro: Se combina con el calcio impidiendo su acción. Puede
usarse también como conservador cuando la muestra tenga que ser
guardada.
 Desfibrinación: Se lleva a cabo en un matraz utilizando perlas de vidrio, a
las cuales queda adherido la fibrina formada por coagulación. Este proceso
es útil para el estudio de GB, GR y plaquetas. Se obtiene también buena
cantidad de suero.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el calibre de la aguja utilizada para el procedimiento de venopunción?
- Para adultos se usan más los de 20G (1.1mm) y 18G (1.3mm)

- Para los niños se usan más la de 22G (0.9mm)
2. ¿Por qué se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extracción sanguínea?
- Para hacer el torniquete que funcionará ayudando al trabajador de la salud a

encontrar las venas y su dirección para la extracción más precisa de sangre.
3. Como se debe de introducir el bisel de la aguja y ¿Por qué?
- El bisel debe introducirse mirando hacia arriba, para evitar un menor daño en los
tejidos del paciente y el sangrado.
4. Defina que es un anticoagulante
- Una sustancia que evita que la sangre al estar fuera del cuerpo se coagule, su
importancia principal es que, al evitar la coagulación, la sangre se mantenga de la
forma en la que está en el torrente sanguíneo y que con esta sangre no coagulada
se puedan hacer distintos exámenes.
5. ¿Qué diferencia hay entre suero y plasma?
- Suero: Es el líquido sanguíneo que queda después de eliminar los elementos

formes de la sangre y el fibrinógeno.
- Plasma: Es el componente de la sangre en el que están suspendidos los glóbulos
rojos, leucocitos y plaquetas.
6. ¿Qué hacer en caso de no tener vena visible para la extracción sanguínea?
- Pedir al paciente que abra y cierre su mano formando un puño; guiarse por las referencias
anatómicas y el tacto en el brazo del paciente para encontrar la vena; o sacar la muestra
de otro lado (dorso de la mano).
18
7. Componentes de los tubos vacutainer que se muestran y sus usos:
19
COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA TOMA DE MUESTRA
20
PRÁCTICA 04
COLORACION Y RECONOCIMIENTO DE CELULAS SANGUINEAS
INTRODUCCIÓN
Erlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina, aunque sus

preparados ya no se utilizan en la actualidad. Lanner, en 1 889, encontró que el
precipitado obtenido por la mezcla de eosina y azul de metileno podía disolverse en
alcohol metílico para formar un colorante útil, que combinaba algunas propiedades
de los dos colorantes iniciales.
Romanowsky, 1 890, encontró que al mezclar una solución de azul de metileno

madura, con eosina (policromía), y disolviendo el precipitado en alcohol metílico, se
obtenía un colorante de uso más amplio que el de Lanner, que podía teñir los
núcleos celulares y los gránulos de las plaquetas (a los que la mezcla de Lanner no
coloreaba).
Colorantes modernos a los de Romanowsky; por ejemplo, los colorantes de Wright,

Leishman, etc., son semejantes, en principio, al método original de Romanowsky,
la diferencia principal estriba en el método de obtención de la policromía del azul
de metileno.
El estudio cito morfológico de extendidos coloreados de la sangre pone de

manifiesto el producto final de un maravilloso y complicado proceso de maduración
que tiene lugar en el sistema hematopoyético, y que se encuentra representado por
los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas.
Cada profesional de la salud debe entrenarse y aprender a observar todos los

elementos del frotis sanguíneo, mientras lleva a cabo el recuento diferencial. Debe
formar el hábito de verificar en cuanto al tamaño, forma y concentración de
hemoglobina en eritrocitos, además si existe un grado importante de anisocitosis o
poiquilocitosis, hipocromía, microcítocis, macrocitocis e hipercromía aparente, etc.
En cuanto a plaquetas se debe tener en cuenta si se encuentran en cantidades
normales (de 3 a 8 por 100 glóbulos rojos), si son normales o si hay formas gigantes
o extrañas. Asimismo, en cuanto a leucocitos se debe considerar si son maduros o
atípicos; si su número es normal, aumentado (leucocitosis) o disminuido
(leucopenia).
En los frotis muy gruesos, los leucocitos son pequeños, difíciles de teñir, siendo
imposible su reconocimiento. Aun en los mejores frotis, a causa de la diferencia de
tamaño, densidad, etc., los leucocitos muestran una distribución particular. Los
monocitos grandes y los polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al
final de la extensión, mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en
forma más uniforme en la parte media.
El hemograma consta de 2 partes: recuento leucocitario y la fórmula leucocitaria. El

recuento leucocitario consiste en determinar el número total de leucocitos x mm3 y,
la fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes
puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm3 de
sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.
21
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos es
de 20 000, entonces el valor absoluto de neutrófilos segmentados sería: 60/100
x 20 000 = 12 000.
La práctica tiene por objetivos:

1. Hacer recuentos de leucocitos y plaquetas.
2. Colorear extendidos de muestras de sangre.
3. Reconocer células sanguíneas y establecer la fórmula leucocitaria
MATERIAL Y MÉTODOS:
1. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS:

MATERIAL:
 Láminas con extendidos sanguíneos coloreados.

 Microscopio óptico.
PROCEDIMIENTO:
 Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de aceite de

cedro y observar con objetivo de inmersión.
 Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.
Tabla: Fórmula leucocitaria normal
TIPO CELULAR %
Granulocito Neutrófilo abastonado 2a5
Granulocito Neutrófilo segmentado 45 a 65
Granulocito Eosinófilo 1a4
Granulocito Basófilo 0a1
Linfocitos 20 a 45
Monocitos 4a8
Estas cifras pueden variar por condiciones climáticas, altura, raza, emociones, dolor,
edad, etc. Conociendo la relación numérica y la cantidad total de leucocitos por
milímetro cúbico, es fácil establecer la fórmula absoluta de cada tipo celular de la
siguiente manera:
Fórmula absoluta = Recuento global leucocitario x % variedad de célula.

100
22
TÉRMINOS USADOS:
 Leucopenia: Disminución del número total en el recuento de leucocitos.

 Leucocitosis: Aumento del número total en el recuento de leucocitos.
 Neutropenia: Disminución del número absoluto de neutrófilos. Aplasia medular.
Mieloptisis de la médula ósea. Agentes citotóxicos.
 Trombocitopenia: Disminución del número total en el recuento de plaquetas.
 Linfocitosis: Aumento del número absoluto en el recuento de leucocitos.
Infecciones virales agudas, como la mononucleosis infecciosa, hepatitis,
citomegalovirus. Otras infecciones agudas, como la tos ferina. Infecciones por
protozoos, como la toxoplasmosis y la enfermedad de Chagas.Infecciones
bacterianas crónicas como la tuberculosis o la brucelosis. Cáncer, especialmente
del sistema linfático
 Monocitosis: Tuberculosis. Endocarditis bacteriana. Enfermedades virales como
sarampión, rubeola. Colagenosis. Neoplasias.
 Desviación a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en
banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrófilos. Puede observarse en:
infecciones e intoxicaciones.
 Desviación a la derecha: Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La
mayoría de polimorfonucleares presenta más de 5 lobulaciones. Ocurre en:
Anemia perniciosa. Hipersegmentación constitucional hereditaria. Reacciones
mieloides de la sepsis. Afecciones hepáticas. Leucemia mieloide. En la agonía.
 Eosinofilia: Infecciones parasitarias. Reacciones alérgicas. Enfermedades
cutáneas. Neoplasias.
23
CUESTIONARIO
1. Explique el fundamento del colorante de Wright.
- Se obtienen mediante la mezcla de colorantes básicos (azul de metileno) que tiñen

de color azul, y ácidos (Eosina) que tiñe de rojo. Por esto los componentes ácidos
de la célula, como los gránulos y el núcleo, se tiñen de azul o violeta y los básicos,
como hemoglobina o gránulos eosinófinos, de rojo o naranja.
2. Cómo haría el recuento de G.B. si no cuenta con la pipeta de Thoma.
-
- Se puede usar una micropipeta.
3. Ud. cuenta 10 campos de 100 G.R. c/u y cuenta un total de 25 plaquetas. Si se tiene
el dato que el paciente tiene 40 de Hto. ¿Cuál es en Nro. de plaquetas por mm 3?
Escriba sus cálculos
4. Dibuje las células sanguíneas observadas en práctica, señalando su nombre.
24
5. Pegue fotos de células observadas en práctica, señalando su nombre y

aumento.
25
PRÁCTICA 05
FAGOCITOSIS IN VIVO
INTRODUCCIÓN
La fagocitosis se inicia con la adherencia de células fagocíticas al endotelio vascular.

Estas son células especializadas, que pueden ser macrófagos o PMN. Los mismos
serán estimulados para que produzcan citoquinas (IL-1, TNF, IFN). La quimiotaxis es
la etapa de movilización y reclutamiento de leucocitos, por medio de la interacción
celular, a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere levemente a la superficie del
endotelio (previamente activado por las citocinas), a través de uniones moleculares de
baja afinidad entre receptores en el leucocito y selectinas sobre la superficie endotelial
(selectina E y selectina P, por ejemplo).
El flujo sanguíneo laminar empuja a los leucocitos así adheridos en dirección de la

corriente sanguínea. El fagocito se despega de las interacciones corriente-arriba y sus
ligandos de membrana se unen a nuevas selectinas corriente-abajo. El resultado es un
movimiento neto a lo largo de la superficie endotelial. Otras moléculas que participan
en esta movilización son las moléculas de adhesión vascular (VCAM-1) presentes en
el endotelio, cuyos ligando correspondiente muestran preferencia por los linfocitos T y
eosinófilos.
En un punto específico, determinado por la presencia y activación de quimiocinas, los

fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el
endotelio por medio de integrinas y otros ligando endoteliales. En especial las
moléculas endoteliales LFA-a, CR3 y VLA-4 se adhieren a ligando específicos sobre
los fagocitos, entre ellos VCAM-1 e ICAM-1. La expresión de estos ligando sobre la
superficie del fagocito es regulada por proteínas inflamatorias, como el TNF y la IL-1.
Es en ese punto de movilización lenta cuando los fagocitos, atraídos por gradientes de
concentración de las quimiocinas, atraviesan el epitelio vascular hacia el foco de
infección patógena. Los receptores sobre la membrana de los fagocitos actúan como
mecanismos de adherencia sobre los microorganismos, sea a productos microbianos
específicos o sobre opsoninas (opsonización) del sistema inmune del hospedador.
La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación intracelular

que resultan en la evaginación de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su
ligando patogénico. Al rodear por completo al complejo receptor-molécula, la
membrana se une en sus extremos y libera al interior de la célula un fagosoma. Esto
puede ocurrir en más de un punto de la membrana celular.
Una vez que el fagolisosoma es formado comienza la desintegración del

micororganismo, proceso que se realiza por mecanismos dependientes o
independientes de Oxígeno. El primero se da tras activarse rutas metabólicas que
consumen oxígeno, como el sistema de la NADPH oxidasa, el cual produce la liberación
de radicales libres del oxígeno, que se constituyen en el principal mecanismo
bactericida para los microorganismos. En el segundo caso se liberan enzimas
hidrolíticas que destruirán al antígeno.
OBJETIVO
1. Comprender el proceso de fagocitosis in vivo y aplicar los conocimientos en
casos de daño tisular, o invasión de múltiples microorganismos o sustancias.
26
1. De laboratorio:
 Tubos de ensayo.
 Mechero y asa bacteriológica, en anillo.
 Centrífuga
 Solución salina fisiológica estéril
 Tubo Nº 3 de Mc. Farland
 Estufa y Baño María
 Agujas hipodérmicas
 Tabla de disección
 Estuche de disección
 Láminas porta-objetos
 Soporte de coloración
 Colorante de Wright y azul de metileno
 Agua destilada
 Microscopio
 Aceite de cedro
2. Biológico:
 Cultivo de Escherichia coli
 Rata blanca adulta
PROCEDIMIENTO:
1. Obtención del inóculo bacteriano
 Sembrar la cepa de E. coli en caldo nutritivo e incubar a 37 ºC por 18 horas

 Centrifugar a 1500r.p.m. durante 15 minutos, eliminar el sobrenadante y agregar
solución salina fisiológica (repetir esta acción tres veces)
 Hacer una suspensión del cultivo equivalente a la turbidez del tubo Nº 03 del
Nefelómetro de McFarland
 Llevar la suspensión a baño maría a 85 ºC durante 60 min.
2. Inoculación: PRIMERA FASE

 Inoculación de 1 mL de suspensión de E. coli (cultivo muerto), mezclado con
saponina (50/50), vía intraperitoneal en ratas blancas adultas.
 Dejar reposar las ratas 48 horas.
3. Inoculación: SEGUNDA FASE

 A la misma rata, inoculación de E. coli (cultivo vivo), vía intraperitoneal.
 Dejar reposar las ratas 4 horas
4. Disección de las ratas

 Luego, diseccionar la rata para la obtención de líquido intraperitoneal con hisopos
estériles.
 Extender los hisopos sobre 4 láminas portaobjetos, secar al mechero.
 Colorear con Wright o azul de metileno y observar al microscopio.
 Dibujar sus resultados y preparación de su informe.
27
1. ¿Cuál es la finalidad de inocular primero el germen muerto?
- Para que el cuerpo reaccione contra el germen debilitado para fabricar anticuerpos
que reconozcan partes específicas de estos. Básicamente para presentar el
germen al sistema inmune y generar anticuerpos para posibles infecciones.
2. ¿Cuál es el papel de la saponina?
- Es una adyuvante de vacunas, se usa para reforzar la respuesta inmune contra un

antígeno administrado simultáneamente, promueven la maduración de células
dendríticas e inducen la liberación de citosinas pro inflamatorias y otros mediadores
que favorecen la respuesta inmune.
3. ¿Por qué se inocula por segunda vez el germen vivo?
- Porque cuando se inocula por segunda vez se lleva a cabo la respuesta humoral
secundaria, por lo que contribuye a que los linfocitos B se diferencien en células
plasmáticas que secretan anticuerpos de alta afinidad, además de aumentar los
linfocitos B de memoria.
4. COLOCAR LAS FOTOS DE SU PROCEDIMIENTO
28
5.- DIBUJAR SUS OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS, SEÑALANDO LO QUE

OBSERVA
6.- COLOCAR SUS FOTOS DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
29
PRÁCTICA Nro. 06
PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO: REACCIÓN DE WIDAL
REACCIÓN DE WIDAL: demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes

(aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en
el suero de los pacientes con fiebre tifoidea y también mide los antígenos somáticos de
S. paratyphí “A”, S. paratyphi "B". Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego
de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses.
Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días, alcanzando títulos
más elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por más de 1 año.
Aunque estas pruebas habitualmente se negativizan después del tratamiento, en algunos

pacientes persisten reactivas por el resto de su vida, pero con títulos bajos. Un descenso
no significativo de los títulos o un nuevo ascenso después del tratamiento, hace
sospechar fracaso terapéutico o reinfección.
El objetivo de la práctica es:
1. Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.
1. REACCIÓN DE WIDAL: (Aglutinaciones)
 Sobre una placa de cristal “escavada” se coloca en fila 80 uL de suero del

paciente sin diluir (5 en total). Agregar 1 gota de los antígenos correspondientes
para S. typhí "O", S. typhí "H", S. paratyphi "A", S. paratyphi "B” y Brucela.
 Se mezcla el suero con el antígeno, mover la placa varias veces hacia atrás y
hacia adelante por 5 minutos y se procede a la observación de una reacción de
aglutinación visible.
 Con los antígenos positivos repetir con cantidades de 40, 20, 10 y 5 uL,
respectivamente. Con este procedimiento los anticuerpos resultan titulados en
1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320, respectivamente.
Negativo: No hay aglutinación.

Positivo: Aglutinación.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce la aglutinación.
TAREA DE LABORATORIO:
1. Defina que es una reacción serológica directa e indirecta

- DIRECTA: Son las que se basan en el principio de la reacción antígeno - anticuerpo
investigan la presencia del antígeno, da lugar a una manifestación macroscópica. Esta
prueba incluye precipitación y aglutinación.
- INDIRECTA: También se basan en la reacción antígeno - anticuerpo, investigan la huella
que dejó el antígeno al pasar por una respuesta inmune puesta en evidencia por el
hallazgo de anticuerpos específicos contra el agente o alguno de sus componentes y que,
indirectamente permite suponer que el agente en cuestión estuvo presente en el huésped
en algún momento.
30
2. Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación
- AGLUTINACIÓN: Cuando un antígeno particulado reacciona con su anticuerpo

específico (divalente por lo menos) se observa la formación de grumos o agregados
de estas partículas, esto se conoce como aglutinación. En estas reacciones el
determinante antigénico está sobre la superficie de una partícula o de una célula.
- PRECIPITACIÓN: La reacción de precipitación ocurre cuando se combina un

anticuerpo, por lo menos divalente, con un antígeno soluble y esto conlleva a la
formación de agregados que precipitan. Como las reacciones de precipitación son
fácilmente observables "in vitro", éstas resultan pruebas serológicas muy útiles,
especialmente para medir concentraciones de anticuerpos. Para que la
precipitación ocurra en forma máxima se necesita que tanto el antígeno como el
anticuerpo estén en concentraciones óptimas, cuando cualquiera de los
reaccionantes está en exceso no se pueden formar grandes agregados antígeno-
anticuerpo.
3. Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.
- Es un método semi-cuantitativo que permite determinar concentraciones relativas

de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución aglutinante. Se da cuando el
Antígeno es soluble y se necesita un soporte de látex para que se pueda generar la
reacción.
4. Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas en

el laboratorio.
- Es una reacción serológica indirecta.
31
5. Coloque fotos de material usado en la práctica
32
6. Coloque fotos de resultados de la práctica
33
PRÁCTICA 07
AGLUTINACION PASIVA: DIAGNOSTICO DE EMBARAZO
DIAGNÓSTICO DE EMBARAZO:
La hormona gonodotrofina coriónica (hCG) es una glucoproteína producida por las células
trofoblásticas de la placenta.
Comienza a secretarse en la fase más temprana de la etapa gestacional y aumenta
constantemente hasta alcanzar un pico, alrededor de 9 semanas después del comienzo
del último periodo menstrual normal, cuyos niveles son muy variables de una mujer a otra.
Su producción es índice de crecimiento placentario, hecho que permite establecer una
relación directa entre la aparición de (hCG) y el diagnostico de embarazo.
OBJETIVO:
1. Describir y comprender el procedimiento y fundamento de la prueba.
DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO:
MATERIALES
 Muestra de suero
 Placa
 Contenedor para la recolección de la muestra
 Cronómetro
RECTIVOS
A. Reactivo A: suspensión de partículas de látex – poliestireno que tienen

absorbidas moléculas de anti-hCG.
 Control positivo: solución buffer conteniendo hCG y conservantes.
 Control negativo: solución buffer conteniendo hCGy conservantes.
REACTIVOS NO PROVISTOS
Solución fisiológica.
INSTRUCCIONES PARA EL USO

Reactivo A: homogenizar por agitación antes de usar.
Controles Positivo y Negativo: listo para usar.
PROCEDIMIENTO
 Deje que la placa, la muestra de suero y/ó los controles alcancen la temperatura
ambiente (15- 30°C) antes de realizar la prueba.
 Deposite 3 gotas de suero(aproximadamente100μL) en la placa, luego agregar
el reactivo Fecuntest directo 1 gota y ponga en marcha el cronómetro. Evite que
queden retenidasburbujas en la placa(S).
 Utilizar una espátula – gotero plástica provista, en posición vertical, para
colocar cada muestra o control.
 Los resultados deberán leerse a los 5 minutos cuandoseanaliceuna muestra de
suero.
34
TECNICA: Cualitativa
FUNDAMENTO DEL METODO
 La muestra se pone en contacto con un reactivo de latex sensibilizado con

anticuerpos monoclonales anti-hCG. Si la muestra contiene hCG, esta se unirá
en forma sensible y especifica produciéndose una aglutinación visible
macroscópicamente.
 POSITIVO: Aglutinación visible macroscópicamente.
 NEGATIVO: No aglutinación.
35
PRÁCTICA Nro. 08
ACCIÓN HEMOLITICA DEL COMPLEMENTO (CH50)
Vía común y Complejo de ataque a membrana (CAM
• A partir del C5b, se fijarán los demás factores C6, C7, C8 y Poli-C9 (este último contribuyendo
con 12 a 15 unidades) formando un poro en la membrana que permite el paso de iones y
agua, causando lisis del Ag captado.
• Este conjunto de proteínas que forman el poro se conocen como MAC: Complejo de ataque a
la membrana C5bC6C7C8C9.
Complejo de ataque a la membrana
Técnica: Acción Hemolítica del Complemento (CH50)
FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA
• La técnica AHC, mide la capacidad del suero del paciente para lisar una suspensión de
eritrocitos cubiertos con anticuerpos.
• Esta lisis, mediada por el C’ se denomina inmuno hemólisis y refleja la integridad funcional de
los componentes del sistema.
• Si existiera un déficit, no se activaría correctamente y habría ausencia de lisis, que se
observa a simple vista o por espectrofotometría.
• Hemólisis menores de 50% indican deficiencia del
complemento, pero no permite determinar qué componente es el que está deficitario.
MATERIAL Y EQUIPOS
• Suero de sangre humana, cobayo y rata.

• Glóbulos rojos de carnero al 2%
• Hemolisina
• Baño maría a 37°C
• Espectrofotómetro
36
PROCEDIMIENTO
• Extraer 10 ml de sangre de un alumno para la obtención de suero

• Hacer lo mismo con los siguientes animales: cobayo y rata.
• Preparar solución 2% de glóbulos rojos de carnero, lavado y diluido con SSF
COMPONENTES Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

(Problema) (Control +) (Control -)
Glóbulos rojo 2% 1 ml 1 ml 1 ml
Hemolisina 0.1 ml
SSF 0.1 ml 0.1 ml
Baño maría s 37°C por 30 minutos
Suero problema 0.1 ml
Agua destilada 0.1 ml
SSF 0.1 ml
Baño maría s 37°C por 30 minutos
 Luego de la incubación, centrifugar los tubos a 1500 r.p.m. por 5 minutos con el fin de
sedimentar los restos de eritrocitos y los eritrocitos no memorizados.
 Observar la coloración del sobrenadante de cada tubo (resultado cualitativo).
 Recoger el sobrenadante de cada tubo con una pipeta y en
un espectrofotómetro medir la densidad óptica a 540 nm
 Obtener el % de hemólisis usando la siguiente fórmula.
% hemólisis = (DOs – Dob) x 100

DOo
 DOs = Densidad óptica sobrenadante tubo problema

 DOb = Densidad óptica tubo control negativo (0%)
 DOo = Densidad óptica tubo control positivo (100%)
Hemólisis menores de 50% indican deficiencia del complemento, pero no permite determinar
qué componente es el que está deficitario.
37
PRÁCTICA Nro. 06
PRUEBAS SEROLÓGICAS NO TREPONEMICAS
INTRODUCCIÓN:
SÍFILIS: es una infección sistémica de evolución crónica, con períodos asintomáticos,

causada por Treponema pallidum. Es un patógeno exclusivo del hombre, quien es su
único reservorio. Se adquiere por contacto directo con una lesión de sífilis reciente, por
vía transplacentaria y raramente por transfusión de sangre. T. pallidum penetra a través
de mucosa sana o piel erosionada y rápidamente disemina en el organismo, por lo que
desde etapas precoces la infección es sistémica.
Las pruebas serológicas no treponémicas como el VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory) o RPR (Rapid Plasma Reagin) son fáciles de realizar, tienen escaso costo
económico, son útiles para el diagnóstico y esenciales para controlar la respuesta al
tratamiento, para lo cual se necesita que el estudio sea cuantitativo. Resultan reactivas
después de 14 a 20 días de aparecido el chancro.

Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.
1.- El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para
detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos, del tipo reagina, producidos por el
individuo ante una infección sifilítica.
 En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo VDRL, agitar
constantemente por 5 minutos y observar al microscopio con objetivo 10X la floculación
formada.
 Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, colocando
una gota del suero diluido más una gota del reactivo VDRL.
Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.
2. El RPR es una prueba de floculación diseñada para detectar reagina en el suero de

pacientes con sífilis de manera rápida. La muestra se mezcla con una suspensión que
posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón.
38
 En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo RPR, agitar
constantemente por 5 minutos y observar floculación visible.
 Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, colocando
una gota del suero diluido más una gota del reactivo RPR.
Negativo: No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo: Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.
39
1.- Defina que es una reacción serológica directa e indirecta

- DIRECTA: Son las que se basan en el principio de la reacción antígeno - anticuerpo
investigan la presencia del antígeno, da lugar a una manifestación macroscópica. Esta
prueba incluye precipitación y aglutinación.
- INDIRECTA: También se basan en la reacción antígeno - anticuerpo, investigan la huella
que dejó el antígeno al pasar por una respuesta inmune puesta en evidencia por el
hallazgo de anticuerpos específicos contra el agente o alguno de sus componentes y que,
indirectamente permite suponer que el agente en cuestión estuvo presente en el huésped
en algún momento.
2.Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación
- AGLUTINACIÓN: Cuando un antígeno particulado reacciona con su anticuerpo
específico (divalente por lo menos) se observa la formación de grumos o agregados
de estas partículas, esto se conoce como aglutinación. En estas reacciones el
determinante antigénico está sobre la superficie de una partícula o de una célula.
- PRECIPITACIÓN: La reacción de precipitación ocurre cuando se combina un

anticuerpo, por lo menos divalente, con un antígeno soluble y esto conlleva a la
formación de agregados que precipitan. Como las reacciones de precipitación son
fácilmente observables "in vitro", éstas resultan pruebas serológicas muy útiles,
especialmente para medir concentraciones de anticuerpos. Para que la
precipitación ocurra en forma máxima se necesita que tanto el antígeno como el
anticuerpo estén en concentraciones óptimas, cuando cualquiera de los
reaccionantes está en exceso no se pueden formar grandes agregados antígeno-
anticuerpo.
3. Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.
- Es un método semi-cuantitativo que permite determinar concentraciones relativas

de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución aglutinante. Se da cuando el
Antígeno es soluble y se necesita un soporte de látex para que se pueda generar la
reacción.
4. Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas

enel laboratorio.
- Es una reacción serológica indirecta
5.Diga porqué las pruebas de VDRL y RPR son consideradas no treponémicas.

Mencione que pruebas serológicas son del tipo treponémicas.
- Determinan anticuerpos reagínicos que se detectan con un antígeno: cardiolipina-lecitina
altamente purificado. A pesar de que las pruebas no treponémicas son relativamente
específicas, no son exclusivas para la sífilis y por tanto, pueden producirse reacciones
falsas positivas. Las pruebas no treponémicas que se usan en la actualidad se dividen en 2
grupos, según la forma en que se detecten los complejos antígenos-anticuerpos; así
tendremos pruebas no treponémicas de fijación del complemento (como la de Kolmer) y
pruebas no treponémicas de floculación. Estas últimas resultan más fáciles de realizar y se
usan más cada día en Estados Unidos y en otras partes del mundo, 11 entre ellas
podemos citar: la Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y las pruebas reaginas
rápidas o Rapid Plasma Reagin (RPR). En la actualidad, la prueba serológica no
treponémica más utilizada es la VDRL. Se trata de una prueba bien controlada, fácil de
realizar y que se puede cuantificar con exactitud. Los resultados de la VDRL se describen
como positivos o reactivos, débil reactivo y negativas o no reactivas.
40
41
42
6.- Coloque fotos de material usado en la práctica
43
7. Coloque fotos de resultados de la práctica
44
PRÁCTICA Nro. 10
PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO
PARA ARTRITIS REUMATODEA
INTRODUCCIÓN:
FACTOR REUMATOIDEO Y ARTRITIS REUMATOIDEA; es un Síndrome crónico de

origen desconocido; se caracteriza por la inflamación simétrica de las articulaciones. Los
factores reumatoideos generalmente de tipo IgM reaccionan con las fracciones Fc. de
las IgG. El factor reumatoideo de tipo IgM se detecta en presencia de Gamma-
inmunoglobulina o fracción II de Cohn (que actúa como antígeno) adsorbida sobre un
soporte inerte de látex poliestireno. El antígeno se une a los FR (anti - IgG) produciendo
una aglutinación de las partículas de látex poliestireno, visible macroscópicamente.
LA PROTEINA C-REACTIVA (PCR); es una proteína sanguínea que forma parte de las
denominadas Proteínas de Fase Aguda que tiene la propiedad de precipitar los
polisacáridos somáticos de los neumococos. La PCR comúnmente se encuentra
aumentada en artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre
reumatoidea activa, infarto agudo del miocardio, luego de una operación quirúrgica y de
transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR indica la intensidad de la
enfermedad y la respuesta del paciente a un tratamiento dado. La PCR se detecta en
suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de
látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las
partículas de látex, visible macroscópicamente.

- Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.
1.- ARTRITEST:
 Diluir una muestra de suero 1: 20 con buffer glicina. En una placa de vidrio
colocar separadamente el suero diluido 1 gota (50 uL) y una gota de reactivo
de látex-globulina. Mezclar con un palillo descartaba hasta obtener una
suspensión uniforme,
 Inmediatamente disparar el cronómetro, balanceando suavemente la placa de
vidrio observando el resultado dentro de los dos minutos.
 Para la titulación de los sueros se hacen diluciones en tubos, colocando 1,9
mL de buffer glicina en el primer tubo y 1 mL en los restantes.
45
 Agregar 0,1 mL de suero al tubo Nº 1 mezclando, luego transferir 1 mL de la

dilución al tubo Nº 2, y así se continua con el resto de los tubos. Se obtienen
diluciones de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc.
Negativo: No se ve aglutinación.
Positivo: Aglutinación dentro de los dos minutos.
Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce aglutinación.
2.- PROTEÍNA C – REACTIVA
 Preparar una muestra diluida 1:20 de suero en un tubo de ensayo, mezclando

1 gota (50uL) del suero con 1 mL. de buffer glicina. Luego, en una placa de
vidrio mezclar una gota (50 uL) del reactivo de látex y una gota (50 uL) del suero
diluido.
 Inmediatamente poner en marcha el cronómetro, balanceando suavemente la
placa de vidrio por tres minutos. Observar la aglutinación sobre un fondo negro
y por encima de un haz luminoso.
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas de: 1:40,
1:80, 1:160, etc.
Negativo : No hay aglutinación

Positivo : Aglutinación que aparece a los tres minutos.
Título : Inversa de la máxima dilución en la que se observa
aglutinación.
46
47
2.- Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación
3.- Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.
4.- Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas en
el laboratorio.
48
49
6.- Coloque fotos de resultados de la práctica
50
PRÁCTICA Nro. 11
PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO
ANTIESTREPTOLISINA Y Streptococcus pyogenes
INTRODUCCIÓN:
ANTIESTREPTOLISINA-O (AS0) es la medición de anticuerpos anti-Estreptococo

betahemolíticos del tipo A (Streptococcus pyogenes). Esta bacteria produce una enzima
llamada estreptolisina O, que puede destruir los hematíes y el cuerpo reacciona contra ella
produciendo anticuerpos específicos antiestreptolisina O. La presencia de títulos altos de
antiestreptolisinas O ó ASLO, indican una infección por la bacteria Estreptococo beta
hemolíticos del tipo A, que puede producir una glomerulonefritis, una fiebrereumática, una
endocarditis bacteriana o una escarlatina.
-Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico.
1.- ANTIESTREPTOLISINA-O (ASO)

 Llevarlosreactivosylamuestraatemperaturaambiente. AgitarelReactivoAantes
de usar, vaciando previamentelapipetadelgotero.
 En unodelos sectoresdelimitados dela placaadjunta alequipo colocar: 1 gota
del Reactivo A(25ul)másla muestraycontroles25ul.
 Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una
suspensiónuniforme enlasuperficie delimitada delaplaca.
 Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y
observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos.
Negativo: suspensión homogénea.

Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1
a 4 +.
Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible
macroscópicamente.
51
2.- Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación
3.- Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.
4.- Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas en
el laboratorio.
52
53
6.- Coloque fotos de resultados de la práctica
54
PRÁCTICA 11
HIPERSENSIBILIDAD TIPO 1: SHOCK ANAFILACTICO
INTRODUCCIÓN
La anafilaxia es un síndrome de aparición brusca y afectación pluri sistémica cuya incidencia se

conoce con toda precisión. La anafilaxia constituye una reacción inflamatoria de instauración
generalmente inmediat causada por la liberación masiva de mediadores inflamatorios (histamina,
prostaglandinas, serotonina, factor activador de plaquetas, leucotrienos) de leucocitos basófilos y
mastocitos, como consecuencia de la unión de anticuerpos tipo inmunoglobulina E (IgE) frente
a determinados antígenos. Tales mediadores son causantes de manifestaciones clínicas que
según la vía de acceso y el grado de difusión intracorporal del alérgeno (sustancia extraña),
pueden adoptar una forma localizada como la rinitis o el asma,o generalizada como el eritema,
diaforesis, palidez o cianosis, vasodilatación sistémica, hipotensión, shock, etc.
La unión Ag.-Ac. (Anticuerpo tipo IgE) es uno de los mecanismos fisiopatológicos más importantes
que se involucran en el desarrollo de la anafilaxia, por lo cual los modelos que desarrollan las
reacciones de hipersensibilidad tipo1 asociadas a esta interacción han cobrado vital
importancia en la evaluación preclínica de sustancias con efectos anti anafilácticos.
En la producción del choque anafiláctico experimental existen dos periodos marcados. El

primero llamado “Sensibilizante” es producido por la inyección de un antígeno generalmente,
albúmina de huevo, por vía intraperitoneal o subcutánea, seguida de un periodo de latencia que
permitirá al anticuerpo formado fijarse en los tejidos. El segundo periodo o desencadénate es
producido dos atres semanas después de la sensibilización con una dosis de antígeno mayor e
inyectado por vía venosa. El cobayo es el animal más usado para la demostración de anafilaxis,
debido a que permite visualizar con claridad todas las manifestaciones de esta reacción.
La serie de manifestaciones que serán observadas en el cobayo dependeránprincipalmente de

dos factores pato-genéticos: contracción de la musculatura lisa y aumento de la permeabilidad
capilar; y las manifestaciones externas consistirá en un cuadro caracterizado por:
Intranquilidad, disnea, dificultad para respirar, rascado del hocico, trastornos esfinterianos, etc.
OBJETIVO
1. Demostrar al alumno una de las manifestaciones más dramáticas de la combinación

antígeno- anticuerpo (Reacciones de Hipersensibilidad-I).
MATERIALES
 Ovoalbúmina
 Cobayo
 Mechero y asa bacteriológica, en anillo
 Solución salina fisiológica estéril
 Agujas hipodérmicas N°21
 Jeringasde 5 ml
 Equipo de disección
 Algodón
 Alcohol yodado
55
PROCEDIMIENTO
1. Dosis sensibilizante: Inyectar 1.mL de una solución al 50% de albumina de huevo

vía intraperitoneal. Dejar reposar al cobayo por 21 días.
2. Dosis desencadenante: Después de los 21 días inyectar el doble de la dosis
sensibilizante, vía intracardiaca.
3. Observar los síntomas del choque anafiláctico e interpretar los resultados
4. Tan pronto como el animal deje de respirar, lleve a cabo la necropsia. Observe el
corazónylos pulmonesprimero, observeotros órganos brevemente ydescribacualquier
otro hallazgo positivo.
1. Anotar resultados de sus observaciones
SINTOMAS OBSERVACION
Intranquilidad,
Disnea
Dificultad para respirar
Rascado del hocico
Erizado pelos de nuca
OTROS:
NECROPSIA OBSERVACION
Corazón
Pulmones
Hígado
Riñones
Otros órganos
56
2. Esquematice y explique la fase sensibilizante y la fase desencadenante
57
3. Colocar sus fotos de la fase sensibilizante:
58
4. Colocar sus fotos de la fase desencadenante (síntomas y necropsia)
59
PRÁCTICA
Nro. 13 ELISA
Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas
INTRODUCCIÓN:
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo, en la cual una enzima
ligada a un complejo antígeno – anticuerpo es capaz de generar un producto detectable con
cambio de color. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número
de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo,
que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la
prueba; por lo tanto, como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene
conocer:
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa
necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado
enferma y que ya se ha recuperado, o que ha sido vacunado, puede seguir produciendo
anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que
éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería
el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren
en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén
infectadas por una cepa extraña.
En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre
antígeno-anticuerpo. En estos casos, normalmente, se lleva a cabo un western blot donde
se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección
en una muestra.
Las enzimas que componen el conjugado deben reunir condiciones como la temperatura de
catálisis semejante a la de la reacción antígeno-anticuerpo; dar productos colorados y
solubles al degradar el substrato; y no dar productos intermedios de catálisis. Las enzimas
más empleadas son la fosfatasa alcalina (con substrato p-nitrofenil fosfato o dietanolamina
en bufer carbonato pH 9,6) la peroxidasa (con substrato ortofenilendiamina) y la beta-
galactosidasa (son substrato o.nitrofenil-beta-galactosido)
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificación de un antígeno en solución (DIRECTO), la detección de un anticuerpo
(INDIRECTO) en una solución (por ejemplo enel clonaje de anticuerpos monoclonales) o la
determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo (INDIRECTO).
A continuación se describen los más comunes.
1. ELISA directo Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Principio: Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra
problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales
específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con
los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los
anticuerpos (2da. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para la enzima y luego una
60
sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color
en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de
negatividad, no aparecerá ningún color.
2. ELISA directo doble Sándwich “HADAS”.

Principio:
Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra problema
conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales específicos
del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se
han tapizado el soporte). (2da reacción Ag-Ac). Agregar anti-anticuerpos (contra el 2do. Ac)
conjugados con una enzima (3ra. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para la enzima
y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la
lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar.
En caso de negatividad, no aparecerá ningún color.
3. ELISA Indirecto
Principio: En el soporte se encuentra fijado el antígeno, se agrega la muestra que contiene

el anticuerpo que capta al antígeno fijado (reacción Ag-Ac). Se adiciona anti-anticuerpos
conjugados con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima usada y luego una sustancia
reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma
visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de negatividad, no
aparecerá ningún color.
4. ELISA Directo Competitivo
Principio: En el soporte se encuentran fijados los anticuerpos. Se agrega en forma

simultánea la muestra que contiene el antígeno problema y una concentración conocida
(comercial) del mismo Ag marcado con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima
usada y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Si la
muestra es negativa la lectura de color será mayor a que si la muestra contiene al antígeno,
Estas lecturas deberán ser confrontadas con la curva de calibración respectiva. Como puede
observarse, los dos antígenos agregados están compitiendo con el anticuerpo fijado en el
soporte. También puede utilizarse el ELISA competitivo para detectar anticuerpos.
5. ELISA Directo de inhibición
Principio: En el soporte se encuentran fijados los antígenos. Se agrega en forma simultánea

la muestra que contiene el antígeno, más un anticuerpo específico marcado con una enzima.
En este paso se establece una reacción de inhibición entre del Ag (muestra) con el Ac
marcado, impidiendo que este último se una al Ag del soporte. Con el lavado se eliminan el
anticuerpo no fijado al Ag del soporte y se determina la cantidad de anticuerpo marcado que
se ha inmovilizado. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de
anticuerpo marcado inmovilizado frente a la concentración de antígeno soluble añadida.
Puede emplearse también el inhibitorio indirecto.
Objetivo de la práctica:
1. Conocer las técnicas y el fundamento que se usan para los distintos ELISA.
61
II. MATERIAL Y MÉTODOS

ELISA directo Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
1. Anticuerpo fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag que va marcado con enzimas
4. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador.
5. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en
fotocolorímetro.
ELISA directo doble Sándwich “HADAS”
1. Anticuerpo fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag
4. Agregar un anti anticuerpo que va marcado con enzimas
fotocolorímetro.
ELISA Indirecto
1. Antígeno fijado en el soporte
2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema (Reacción Ag-Ac)
3. Agregar anti-anticuerpo que va marcado con enzimas
fotocolorímetro.
ELISA competitivo para anticuerpos (Indirecto)
1. Antígeno fijado en el soporte.
2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema y simultáneamente el mismo tipo de
anticuerpos marcadas con una enzima.
4. Leer al fotocolorímetro: ausencia de color, color tenue, color intenso y confrontar la
lectura con la curva de calibración.
62
ELISA directo Sandwich “DAS”
ELISA directo doble Sandwich “HADAS”
63
III. TAREAS DE LABORATORIO
1. Con esquemas, explicar el fundamento de los distintos tipos de ELISA

mencionados.
64
PRÁCTICA 14
PRUEBAS RÁPIDAS INMUNOCROMATOGRAFICAS DE DIAGNÓSTICO

SEROLÓGICO
INTRODUCCIÓN
DIAGNÓSTICO DE EMBARAZO:
La apariciónde la hormona gonodotrofina coriónica ( hCG) enorinaysueropocodespuésde

la concepción y su posterior aumento rápido durante el principio de la gestaciónconviertena
esta hormona en un excelente marcadorpara ladetección precoz del embarazo.Laprueba
hCG de embarazo en un solo paso (Orina/Suero) es una prueba rápida que detecta
cualitativamente la presencia de hCG en una muestra de orina o suero con una
sensibilidad de 25mUI/ml.
La pruebautiliza una combinación de anticuerposmonoclonales y policlonales para detectar

selectivamente los niveles elevados de hCG en orina o suero. La prueba hCG de embarazo en un
solo paso (Orina/Suero) no muestra interferencias cruzadas con otras hormonas
glucoproteicas estructuralmente relacionadas, FSH, LHy TSH, en nivelesfisiológicos altos.
La prueba utilizadoslíneas paraindicar elresultado. La línea delapruebautiliza unacombinación

de anticuerpos que incluyen un anticuerpo monoclonal hCG para detectar selectivamente
niveles elevados de hCG. La línea de control está compuesta por anticuerpos policlonales de
cabra y partículas coloidales de oro. El ensayo se realiza añadiendo la muestra de orinao/suero
al pocillo de la placa y observando la formación de líneas de color.
El Ag en las muestras positivas reacciona con el conjugado de color del anticuerpo

específico anti-hCG para formar una línea de color en la región de la línea de la prueba
de la membrana. La ausencia de esta línea de color sugiere un resultado negativo. Para
servir como control del procedimiento, siempre aparecerá una línea de color en la región
de la línea de control, si la prueba se ha realizado correctamente.
PRUEBA RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICUERPOS HIV 1+2
El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE.UU. (CDC), destaca la

importancia de la utilización de pruebas rápidas dedetección del HIV para facilitar el accesoal
diagnóstico precoz en zonas de alta prevalencia, en individuos de alto riesgo o en zonas
donde otros métodos de diagnóstico como ELISA, Western Blot o amplificación de ácidos
nucleicos no estén disponibles.
También son de gran utilidad en el momento del parto, especialmente para el diagnóstico de
mujeres que no hayan sido controladas durante el embarazo. Por otra parte, estas pruebas
rápidasconstituyen una herramienta diagnóstica quepuededesempeñarunpapelimportante en
campañas de prevención y diagnóstico en entornos clínicos y no clínicos, facilitando de esta
manera, la detección precoz de la infección.
WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatográfico "in vitro", de lectura visual, para la
detección cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre
entera. La prueba consta de un cassette plástico que contiene:-una membrana de
nitrocelulosa sensibilizada con antígenos recombinantes para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36)
en la zona de prueba "T", conjugados a oro coloidal. La muestra y el buffer se agregan en
el pocillo de muestra "S" solubilizando y mezclándose con el conjugado de antígenos
recombinantes.
65
Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a través de la membrana de nitrocelulosa. Si la

muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarán un complejo con los
antígenos conjugados a oro coloidal. Este complejo se unirá posteriormente alos antígenos
inmovilizados en la zona de prueba"T" dela membrana de nitrocelulosa, formando así una línea
de colorrosa-rojo púrpura. La ausencia de dicha línea indica un resultado negativo. Como control
de procedimiento, la pruebaincluye unazonade control"C"decolorcelestequecambiaacolor
rosa-rojo púrpura tras el paso de la muestra. La ausencia de esta línea invalida los
resultados.
OBJETIVO:
1. Describir y comprender el procedimiento y fundamento de pruebas rápida del

tipo directo (Ags) e Indirecto (Acs).
DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO:
MATERIALES
 Muestra de suero y/o orina

 Test en tira
 Cronómetro
PROCEDIMIENTO
 Deje que la placa, la muestra de orina o suero y/ó los controles alcancen la temperatura
ambiente (15- 30°C) antes de realizar la prueba.
 Deposite 3gotas de orinaosuero (aproximadamente100μL) en el pocillo de la
placa (S) y ponga en marcha el cronómetro. Evite que queden retenidasburbujas
de aireen el pocillo de la placa(S).
 Espere hasta que aparezcan una o dos líneas coloreadas. Los resultados deberán
leerse a los 3 minutos cuando se analice orina oalos 5 minutos cuando se analice
una muestra de suero.
 NOTA: Una concentración bajadehCG podríadar lugar, despuésde unperiodo de
tiempoprolongado,ala aparicióndeuna débillínea en laregióndela prueba(T); por
tanto, no interprete después de 10minutos.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
 POSITIVO: Aparecen dos líneas coloreadas distintas. Una línea quedará en la

región de control (C) y otra línea quedará en la región de la prueba (T).
 NEGATIVO: Una línea coloreada aparece en la región de control (C). No aparece
ningunalínea coloreada en la región de la prueba (T).
 NO VÁLIDO: No aparece la línea de Control. Un volumen de la muestra
insuficiente o una técnica incorrectasonlasrazonesmásfrecuentes delfallodela
línea de control.
PRUEBA RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICUERPOS HIV 1+2
MATERIALES
 Muestra de suero y/o orina

 Test en tira
66

 Cronómetro
PROCEDIMIENTO
 Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente (18-30o C) antes de
utilizar.
 Agregar lamuestra (dos gotas) sobre la superficie absorbente del pocillo de
 Iniciar el cronómetro.
 Leer los resultados entre los 20 y 30minutos. No leer pasadolos 30minutos ya que
pueden obtenerse resultados erróneos.
 Algunas muestras positivas reaccionan inmediatamente mientras que otras lo hacen
máslentamente dentro del tiempo de lectura indicado.
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA PRUEBA
 El cassette cuenta con unalíneade colorceleste en la zona de control "C" que al

realizar el ensayo debe cambiar a color rosa-rojo púrpura. Este cambio de color
confirma que se ha agregado el volumen adecuado de muestra, que su migración
fueapropiaday que la realización del procedimiento fue correcta.
 Resultado Positivo (2 líneas): se observan 2 líneas de color rosa-rojo púrpura,
una en la zona de prueba "T" y otra en la zona de control "C". El resultado es
positivo, aunque las intensidades del color de las líneas "T" y "C" sean diferentes.
 Resultado Negativo (1 línea): se observa solamente una línea de color rojo-rosa
púrpura en la zona de control "C".
 ResultadoInválido: la ausenciadelalíneadecolor rosa-rojopúrpura enla zonade
control"C" invalida el resultado, aunque esté o no presente la línea de color
rosa-rojo púrpura en la zona de prueba "T".
67
ESQUEMA DE PRUEBA RAPIDA PARA DIAGNÓSTICO DEL EMBARAZO:

Explique su fundamento
68
COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA
69
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS
1. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Laboratorio de Análisis Biológicos.

Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. 9va.
Edición. 2019.
2. Mercado-Martínez, Pedro. Guía de Prácticas de Fisiología y Genética Bacteriana.
Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. 9va.
Edición. 2019.
3. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Manual de Prácticas de Laboratorio de
Inmunología. Universidad Autónoma de México. México 2015.
4. Rubio-Pedraza, Gonzalo. Manual de Prácticas de Inmunología Clínica. Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular e Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
de Murcia. España 2014.
5. Martínez-Romero, Aurora y Ortega-Sánchez, José. Manual de Laboratorio de
Inmunología Básica y Clínica. Como un suplemento de REDVET Revista electrónica de
Veterinaria (http://www.veterinaria.org/revistas/redvet). Abril, 2011
6. Paz-Morales, Ana y Gaitán-Fernández, Isabel. Manual de Prácticas de Laboratorio de
Inmunología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Mariano Gálvez. Facultad de
Ciencias Médicas y de la Salud. Guatemala 2013.
Enlaces:
 http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/tema-07.pdf
 http://anatobioterio.blogspot.com/2011/03/tecnicas-de-inoculacion.html
 http://www.uap.edu.pe/intranet/fac/material/04/20122BX040104234040104011/2012
2BX04010423404010401137640.pdf
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UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO - FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA

BIOSEGURIDAD Y SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO

El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos,

Nivel de Bioseguridad 2: En él se manejan agentes de peligro moderado hacia el

Nivel de Bioseguridad 3: Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clínicos

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

1. Requisito indispensable: Antes de realizar cada práctica leer cuidadosamente

1. Todo material biológico humano se manipula como si fuera potencialmente

protección, se desaconseja el pantalón corto o el calzado abierto.

1) Las salpicaduras o derrames en la piel intacta se deben lavar inmediatamente

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO INFECCIOSOS (RPBI)

Los RPBI se clasifican en:

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Se entiende por señalización de seguridad y de salud a la que referida a un objeto,

 La altura y posición de las señales deberá tener en cuenta su relación con el

4. Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios.

5. Señales de salvamento o socorro.

2. De forma sencilla esquematice el laboratorio con sus pictogramas y diga el

VÍAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar

Los animales de experimentación han proporcionado modelos para la realización de

La inoculación de sustancias es una práctica generalizada, y en el área de la

 Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y VENOPUNCIÓN (SANGRADO)

1. Inoculación y venopunción intravenosa en ratón y rata. Introduzca al ratón en

1. Inoculación intraperitoneal en ratón, rata o cobayo. Sujete al animal con la mano,

2. Inoculación subcutánea en rata, ratón o cobayo. Con la ayuda de unas pinzas,

3. Inoculación intramuscular. Se utiliza como una vía de administración sistémica,

FOTOS QUE MUESTRAN LAS VÍAS DE INCOCULACIÓN

INOCULACIÓN O SANGRADO INTRAVENOSA INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL

TAREA DE LABORATORIO: COLOCAR SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA

1. Anote los usos de la inoculación.

 Estudios de Inflamación; Sensibilización; Diagnóstico de flujo sanguíneo;

2. Anote los usos de la venopunción.

SISTEMA SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RH

En 1818, James Blundell, Fisiólogo Inglés, hizo la primera transfusión de hombre a

transfusión de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y transplantes de tejidos, también se

SISTEMAS SANGUÍNEOS ESTABLECIDOS

SISTEMA SANGUÍNEO ABO

 Portaobjetos. Rotulador para vidrio

Determinación del grupo hemático:

- Pertenece al tipo de reacción serológica por aglutinación, esta se produce por la

- La persona con el grupo sanguíneo A en la membrana de sus eritrocitos tiene

3. Explique porque el grupo “O” es considerado donador universal.

4. Explique porque el grupo “AB” es considerado como receptor universal.

5. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre grupo “A” y

6. Usando cuadrado de Punnet, establezca la descendencia entre un padre del grupo

COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA

TOMA DE MUESTRA PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Y PLASMA

El sistema hematopoyético (Hema = sangre, poyesis = producción, fabricación) es el

En la médula ósea roja de los huesos se encuentran las células hematopoyéticas

Se puede realizar un examen físico o químico de la sangre, para lo cual se la obtiene

La práctica tiene por objetivos:

1. Adiestrar al alumno en la extracción de muestras de sangre del antebrazo para

 Agujas especiales para adaptador.

2. Etiquetado de los tubos

Preparación del paciente

 Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la

Es utilizada para extraer pequeñas cantidades de sangre en determinaciones

5. Algunos anticoagulantes utilizados en el laboratorio

- Para adultos se usan más los de 20G (1.1mm) y 18G (1.3mm)

- Para hacer el torniquete que funcionará ayudando al trabajador de la salud a