PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIALES

1. 1 pastilla de caldo de pollo

2. Gelatina sin sabor (30 g)
3. Agua destilada
4. Solución de hipoclorito al 0,5%
5. 5 recipientes de postre
6. Jarra mediana (que se pueda usar para calentar)
7. Guantes
8. Tapabocas
9. Bata
10. Servilletas
11. Velas (al menos 6)
12. Vinipel
13. Nevera

PROCEDIMIENTO

1. Desinfectar completamente el área de trabajo con solución de hipoclorito al 0,5%.

2. Desinfectar todo el material con solución de hipoclorito al 0,5%.
3. Medir 250 mL (1/2 tasa) de agua destilada y ponerla en un recipiente
(preferiblemente tipo jarra) junto con el caldo de pollo y 30 g de gelatina sin sabor.
4. Poner a calentar la mezcla hasta que hierva por 10 minutos, asegurándose que la
mezcla quede homogénea.
5. Servir el medio aún caliente en los recipientes previamente desinfectados bajo
condiciones estériles (trabajar con varias velas alrededor) y cerramos rápidamente
a medida que se va sirviendo.
6. Dejar reposar hasta que solidifique.
7. Almacenar en frío los recipientes (en posición invertida) hasta su uso,
envolviéndolos en papel vinipel

AISLAMIENTO DE CULTIVOS MIXTOS A PARTIR DE MUESTRAS DE AGUA

MATERIALES

Materiales y equipos

1. Muestra de agua
2. Jeringas de 5 mL
3. Recipientes de plástico con tapa de 5 oz (como los de salsas, parecidos a los vasos
aguardienteros)
4. 3 recipientes con medio de cultivo previamente preparado
5. Alambre dulce grueso (para hacer el asa de rastrillo)
6. Caja para guardar las muestras sembradas.
7. Guantes
 8. Tapabocas
9. Bata
10. Servilletas
11. Velas (al menos 6)
12. Marcadores

PROCEDIMIENTO

Muestra de agua:

1. Desinfectar completamente el área de trabajo con solución de hipoclorito al 0,5%.

2. Desinfectar todo el material con solución de hipoclorito al 0,5%.
3. En condiciones estériles (trabajar con varias velas alrededor) preparar las diluciones
de la muestra (marcar previamente los frascos de 5 Oz)
4. Tomar 1 mL con una jeringa y transferirlo a un recipiente con 9 ml de solución salina
estéril 0,9% (dilución 10-1).
5. De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta
10-3.
6. Agitar de forma constante los recipientes.
7. Tomar 0.1 mL con una jeringa de la dilución seleccionada y colocarla en el centro
de la superficie del medio de cultivo para el crecimiento (Ver Figura 3). Marcar los
recipientes con los datos de la muestra y dilución correspondiente.
8. Extender la alícuota en la superficie de la placa con el asa de rastrillo elaborada
previamente esterilizada (pasándola por la flama de la vela permitiendo su
enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por toda la superficie del medio
(Ver Figura 1).
9. Incubar las placas de forma invertida a 37ºC en ausencia de luz (Buscar un sitio que
mantenga cercanas las condiciones de temperatura).
10. Después de un periodo de incubación (de 3 a 7 días, dependiendo de las
condiciones de incubación), contar el número de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ mL de agua.

Cálculos
1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.
2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/mL

UFC NC
=
mL 𝐹𝐷 ∗ 𝑉
.
Donde:
UFC/ mL = unidades formadoras de colonias / mL de agua.
NC= número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra
con la que se inocula la caja (10-1 a 10-3).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 mL.

11. Hacer la descripción de las características culturales de los cultivos obtenidos (Ver
Figura 2)
Figura 1. Técnica de siembra por extensión en placa.

Fuente: Bonilla et al., 2016

Figura 2. Características culturales de las colonias creciendo sobre placas con agar
nutritivo.

Fuente: Rojas, A.
a. Tamaño: Grande (diámetro mayor a 1mm), mediano (diámetro aproximado a 1 mm),
pequeño (diámetro inferior a 1 mm), y puntiforme.
b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.
c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado,
espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso).
d. Elevación: Plana o aplastada (no elevación), elevada (convexa baja, convexa
cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada).
e. Superficie: Lisa o rugosa.
f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.
g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translúcido.
h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran
el medio; piocianina (azul verdosa y factor de virulencia en P. aeruginosa), pigmentos
fluorescentes y pigmentos no difundibles confinados a las colonias.
i. Hemólisis: Parcial (Alfa, parcial aclaración de la sangre alrededor de las colonias, con
decoloración verde del medio; borde de células rojas intacta), total (Beta, zona de completa
aclaración de sangre alrededor de las colonias, debida a la lisis de las células rojas), y no
hemólisis (Gamma, no hay cambio en el medio circundante a la colonia; no hay lisis ni
decoloración de las células rojas de la sangre).

OBTENCIÓN DE CULTIVOS AXÉNICOS O PUROS

Técnica de siembra agotamiento, aislamiento o de estría cruzada

PROCEDIMIENTO

1. Desinfectar completamente el área de trabajo con solución de hipoclorito al 0,5%.

2. Tomar un recipiente con medio de cultivo, se manipula el asa de argolla o punta
redonda (previamente elaborada) y esterilizarla por flameado directo a la llama (y
enfriada en un lateral del medio, procurando no dañarlo) y con ella se recoge una
pequeña muestra de la colonia que se desea aislar, para colocarlo en un área
periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo.
3. El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del medio
(procurando no dañarlo).
4. Realizar una estría partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos
presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe
procurar que, en cada sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor
separación.
5. Repetir el paso 3 y 4, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando
solo tocar con el asa la estría inmediatamente anterior, con el objetivo de ir
reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla.
6. Finalmente esterilizar el asa antes de descartarla.
7. Hacer 2 siembras (con colonias diferentes cada una).
8. Incubar invertidas las cajas a 37±2°C en ausencia de luz (Buscar un sitio que
mantenga cercanas las condiciones de temperatura).
9. Revisar los recipientes a las 24 horas o más según las condiciones de incubación.
10. Verificar la pureza del cultivo (Ver Figura 4).
Figura 3. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros
microorganismos emulsionables como las levaduras.

Fuente: Rojas, A.

Figura 4. Cultivo puro.

Fuente: https://images.app.goo.gl/WAc7dVYdCxpLY65XA