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1.

INTRODUCCIN

Las enzimas se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su
funcionamiento. Desde el punto de vista bioqumico son protenas que actan como
aceleradores de las reacciones qumicas, de sntesis y degradacin de compuestos. Una de las
caractersticas ms sobresalientes de las enzimas es su elevada especificidad. Esto quiere decir
que cada tipo de enzima se une a un nico tipo de sustancia, el sustrato, sobre el que acta.

La produccin de enzimas implica la fuente de obtencin de las mismas, as, existen tres
orgenes principales que son: animal, vegetal y microbiano. Tanto la animal como la vegetal son
limitadas por las inclemencias externas como el clima, la fuente de alimentacin, variedad de
los suelos, entre otras; lo cual la produccin microbiana brinda ventajas de ndole
biotecnolgico como: la obtencin rpida y controlada en reactores enzimticos.

Las enzimas en cuanto a su extraccin las podemos clasificar en dos grandes grupos:
intracelulares y extracelulares. En las primeras es obligatorio el rompimiento celular, para lo
cual existen diversos mtodos qumicos, fsicos y enzimticos, para las enzimas extracelulares
tan solo se requiere la separacin de la biomasa con el sobrenadante de la fermentacin.

El mtodo de purificacin realizada se basa en la precipitacin fraccionada con sulfato de


amonio. Al obtener un extracto crudo se toma en cuenta que las protenas se encuentran en
solucin acuosa a una baja salinidad. Al incrementar la concentracin de sales en la solucin
incorporando lentamente sulfato de amonio, la protena comienza a ceder enlaces inicos con
los iones sulfato y amonio, y sustituye los sitios de intercambio que comparta con el agua y as
la protena disminuye su solubilidad y precipita.

El objetivo de la prctica es entender los pasos de purificacin as como el anlisis de los


resultados de protenas totales y actividad enzimtica para decidir que fraccin utilizar para los
siguientes etapas de purificacin.
2. CLCULOS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

S2

S1
+S.A.
V= 2.7 ml

ECH (se descarta


el sedimento). V= 3 ml
Valcuota= PP2
+S.A.
100L

V= 3.5 ml
PP1
Valcuota= V= 0.4 ml
200L

V= 0.245 ml

Preparacin de muestras para el anlisis


Se tom un volumen Vi de cada muestra y se procedi a diluir en una
proporcin 1/3 dando como volumen final Vf. La muestra PP se diluy en una
proporcin 1/5.

Dilucin 1/3
Vi Vf
ECH 200 L 600 L
S1 100 L 300 L
PP1 245 L 735 L
S2 200 L 600 L
PP2 400 L 2000 L

Tabla de absorbancias

Blanco ECH S1 PP1 S2 PP2 (1/5)


Determinacin 0 0.040 0.047 0.073 0.025 0.110
Protenas (Biuret)
Determinacin de 0.163 0.280 0.269 0.357 0.083 0.481
la Actividad
enzimtica

I. Determinacin de protenas
A partir de la curva de calibracin realizada en la prctica anterior se van a determinar
la cantidad de protenas en cada muestra.

Abs vs mg% protena


0.12

0.1
f(x) = 0x + 0
0.08 R = 1

0.06
Abosrbancia
0.04

0.02

0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
mg% protena

Absorbancia mg% protena


ECH 0.040 32.5
S1 0.047 38.33
PP1 0.073 60
S2 0.025 20
PP2 0.110 90.83

ECH
32.5 mg. Protena---------------- 100 ml

X = 0.975mg. Protena--------- 3 ml (Volumen del tubo)

0.975mg. Protena---------0.1 ml (muestra)

En la muestra diluida(X) hay 9.75 mg/ml de protena.

Entonces en la muestra (3X) hay 29.25 mg/ml de protena.

S1
38.33 mg. Protena---------------- 100 ml

X = 1.15mg. Protena--------- 3 ml (Volumen del tubo)

1.15mg. Protena---------0.1 ml (muestra)

En la muestra diluida(X) hay 11.5 mg/ml de protena.

Entonces en la muestra (3X) hay 34.5 mg/ml de protena.

PP1
60 mg. Protena---------------- 100 ml

X = 1.8 mg. Protena--------- 3 ml (Volumen del tubo)

1.8 mg. Protena---------0.1 ml (muestra)

En la muestra diluida(X) hay 18 mg/ml de protena.

Entonces en la muestra (3X) hay 54mg/ml de protena.

S2
20 mg. Protena---------------- 100 ml

X = 0.6mg. Protena--------- 3 ml (Volumen del tubo)

0.6mg. Protena---------0.1 ml (muestra)

En la muestra diluida(X) hay 6 mg/ml de protena.

Entonces en la muestra (3X) hay 18 mg/ml de protena.

PP2
90.83 mg. Protena---------------- 100 ml

X = 2.725 mg. Protena--------- 3 ml (Volumen del tubo)

2.725 mg. Protena---------0.1 ml (muestra)

En la muestra diluida(X) hay 27.25 mg/ml de protena.


Entonces en la muestra (5X) hay 136.25 mg/ml de protena.

II. Determinacin de Actividad Enzimtica

Absorbancia
Blanco 0.163
o Clculo de las ECH 0.280 mol/L de p-
Nitrofenolato) Se tomaran
producido en 2las
S1 0.269
absorbancias
minutos PP1 0.357 netas
S2 0.083
PP2 (1/5) 0.481
A=.l.c
Donde:
= 18400 L.mol-1.cm-1
l = 1 cm
c=A/ .

Muestras Concentracin
(mol/L)
ECH 15.2
S1 14.62
PP1 19.4
S2 4.51
PP2 26.14
Entonces:

ECH

15.2moles ----------------- 1000 ml


X = 0.029moles ----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)

X = 0.029 moles ----------------- 0.05 ml de muestra


Y = 0.58 moles -----------------1 ml muestra

En la muestra diluida(X) hay 0.58moles/ml.


Entonces en la muestra (3X) hay 1.74 moles /ml.

S1

14.62 moles ----------------- 1000 ml


X = 0.028 moles ----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)

X = 0.028 moles ----------------- 0.05 ml de muestra


Y = 0.56 moles -----------------1 ml muestra

En la muestra diluida(X) hay 0.56moles /ml.


Entonces en la muestra (3X) hay 1.68 moles /ml.

PP1
19.4 moles ----------------- 1000 ml
X = 0.037 moles ----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)

X = 0.037 moles ----------------- 0.05 ml de muestra


Y = 0.74 moles -----------------1 ml muestra

En la muestra diluida(X) hay 0.74moles /ml.


Entonces en la muestra (3X) hay 2.22moles /ml.

S2

4.51 moles ----------------- 1000 ml


X = 0.0085 moles----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)

Muestra Actividad (UE/ml) X = 0.0085 moles


ECH 0.87 ----------------- 0.05
ml de muestra
S1 0.84
Y = 0.17 moles
PP1 1.11
-----------------1 ml
S2 0.255
muestra PP2 2.485
En la muestra diluida(X) hay 0.17moles /ml.
Entonces en la muestra (3X) hay 0.51 moles /ml.

PP2

26.14 moles ----------------- 1000 ml


X = 0.0496 moles ----------------- 1.9 ml (Vol. del tubo)

X = 0.0496 moles ----------------- 0.05 ml de muestra


Y = 0.9933 moles -----------------1 ml muestra

En la muestra diluida(X) hay 0.9933moles /ml.


Entonces en la muestra (5X) hay 4.97 moles /ml.

Clculo de la actividad de fosfatasa cida

Resumen de Purificacin

Actividad Volumen Protena Protena Actividad Actividad Rendimiento Factor de


(UE/ml) total (mg/ml) total total especfica (%) purificacin
(ml) (mg) (UE) (UE/mg)
ECH 0.87 3.7 29.25 108.225 3.219 0.0297 100% 1

S1 0.84 3.1 34.5 105.4 2.604 0.0247 81.36% 0.83

PP1 1.11 0.245 54 13.23 0.272 0.02 8.44% 0.67

S2 0.255 2.7 18 48.6 0.6885 0.014 21.39% 0.47

PP2 2.485 0.4 136.25 54.5 0.994 0.018 30.87% 0.61

3. DISCUSIONES
La purificacin de las protenas como las enzimas tienen un protocolo basado en la
experiencia y tomando mucho en cuenta el criterio en el procedimiento. Ya que los
resultados dependen mucho de las decisiones que tomamos en cada uno de los pasos
en la purificacin, como las respectivas diluciones y la aplicacin de determinadas
concentraciones de reactivo. Los resultados para la determinacin de protenas es una
determinacin menos especfica que la determinacin para la actividad y la
determinacin de las unidades enzimticas. Para la determinacin de las protenas se
uso la tcnica usando el reactivo de biuret (Quezada. 2007), para la cual se determin
que inicialmente haba 108.225mg en la muestra inicial de extracto (ECH), a partir de la
cual no se perdi mucho, ni vari drsticamente en los resultados de purificacin.
Para la determinacin de la actividad enzimtica se utilizo la reaccin con p-
nitrofenilfosfato en cada una de los pasos de purificacin siguiendo en cada paso la
distribucin de las unidades enzimticas, cabe indicar que en esta prctica no se
pretende obtener una purificacin eficiente, sino entender los pasos de purificacin y
como analizarlos y decidir que fraccin utilizar para los siguientes pasos. La purificacin
se realiz mediante la tcnica de 'salting-out, en la cual se utilizan sales neutras
(Weatherley. 1994), la protena no es desnaturalizada y la actividad enzimtica se
recupera. La causa de la precipitacin se debe a que cuando la sal es agregada las
regiones hidrofobicas son expuestas a la superficie de la protena, entonces estas
regiones interactan con otras regiones similares en otras protenas resultando en una
aglomeracin, de esta forma, formando agregados, precipitaran ms fcilmente (Harris
et al. 1995). Con el primer paso de la purificacin en la cual se le agrego sal hasta una
saturacin del 30%, luego de la centrifuga se observo mayor actividad en el
sobrenadante, en al cual se perdi aproximadamente 0.6 UE, luego de saturar el
segundo remanente al 80% se observ que casi todas las enzimas precipitaron, pero las
unidades enzimticas que se perdieron fueron casi de 1 UE, el que haya precipitado
quiere decir que para una fuerza inica mayor a la que sufre con un 80% de saturacin,
esta precipita; pero an se pueden observar protenas en el sobrenadante, que pueden
soportar esta saturacin.

4. CONCLUSIONES
- La enzima precipita a una saturacin con sulfato de amonio al 80%.
- Con estos pasos de purificacin se perdieron muchas unidades enzimticas,
logrndose rescatar menos del 50%.
- El factor de purificacin disminuyo a menos de la unidad para cada paso
implicando poca actividad especfica.
- La purificacin fue muy pobre ya que es probable que hayan muchas protenas
diferentes a la enzima en el precipitado final.

5. BIBLIOGRAFIA

- Quezada Mora, Silvia. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para bioqumica.


Editorial EUNED. Costa Rica. 131pp.

- Weatherley, L.R. 1994. Engineering Processes for Bioseparations. Butterworth-


Heineman, Oxford, p.73-90; 202-216.

- Harris, E. L. V., Angal, S. 1995. Protein purification methods. A practical approach. 6


edition. Oxford University Press. EEUU, p. 151-156.