USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO VIRTUAL

Valdés, Krisly 4-789-783; Mayra Valdés 4-811-1835

Química Clínica I QM-300, Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Ciencias Naturales y
Exactas, Universidad Autónoma de Chiriquí. David, Chiriquí, República de Panamá.
E-mail: Krisly.valdes@unachi.ac.pa; Mayra.valdes@unachi.ac.pa

Resumen

En este laboratorio se pudo comprender y observar con ayuda del espectrofotómetro virtual como
es su funcionamiento. Un espectrofotómetro utiliza un arreglo de prismas, espejos y aberturas para
seleccionar la luz de una longitud de onda dirigida hacia el compartimiento de muestra y luego de
detector; es muy importante que como tecnólogos tengamos el conocimiento y experiencia para
poder manejar este tipo de equipo de forma correcta de importancia clínica. El simulador de
espectrofotometría virtual fue de gran ayuda para poder observar la cantidad de procedimientos
que se pueden llevar a cabo con la ayuda del espectrofotómetro.

Objetivo La absorción de las radiaciones ultravioleta,

• Adquirir un conocimiento
correcto sobre el funcionamiento
simulado del espectrofotómetro
en un laboratorio virtual.
• emplear correctamente los
procedimientos
espectrofotométricos para
utilizar la función de barrido o de
escaneo.
• Determinar mediante el
espectrofotómetro virtual los
desconocidos.
• Comparar cada longitud de onda
en la que se absorbe cada color a
través del espectrofotómetro en
un laboratorio virtual.
Introducción
El espectrofotómetro es un instrumento que
permite comparar la radiación absorbida o
transmitida por una solución que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una
que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.
visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las moléculas, y es característica para cada
sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte
de la energía es absorbida; la energía radiante
no puede producir ningún efecto sin ser
absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas
absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan
pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de
onda no absorbidas.
La espectrofotometría proveniente del sol, es
decir la radiación ultravioleta-visible usa
haces del espectro electromagnético y
radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm,
principalmente de 200 a 400 nm y usa haces
de luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es
de gran utilidad para caracterizar las
soluciones en la región ultravioleta y visible
del espectro.
Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le
conoce también como rango de uv cercano, la
espectrofotometría visible solamente usa el
rango del campo electromagnético de la luz
visible, de 400 a 800 nm. A este tipo de
técnicas se conoce en conjunto como técnicas
físico-bioquímicas , en relación a la
espectrofotometría se tiene una ley muy
importante la ecuación de beer-lambert
it/io=10-klc donde it , es la intensidad de luz
que sale de la cubeta y que va a llegar a la
celda fotoeléctrica o detector donde es
captada, medida y transformada en unidades
de absorbencia o de densidad óptica, io es la
intensidad incidente , k es la capacidad de la
muestra para la captación del haz del campo
electromagnético, l es la longitud de la cubeta
de espectrofotometría en cm, y c es la
concentración de la muestra ya ubicada en la
cubeta.
La ecuación simplificada de la ley de Beer-
Lamber comprende a la mínima ecuación que
relaciona la concentración, la absorbancia de
la muestra y el factor de calibración. El factor
de calibración relaciona la concentración y la
absorbencia de los estándares. (química.es,
2022)
Los espectrofotómetros UV-VIS son utilizados
habitualmente por una gran variedad de
industrias con fines diversos. Desde la
industria de la alimentación, empresas y
entidades encargadas del control de las aguas
residuales, entidades de salud pública,
empresas y laboratorios dedicados al control
de la calidad ambiental, hasta la industria de
los materiales, hacen uso de medidas
mediante espectrofotometría UV-VIS para el
control de la calidad de sus productos o
servicios. (Laboratorios EYCO, 2021)
Materiales
• Espectrofotómetro virtual.
• Pipeta y botellas lavadoras virtuales.
• Reactivos y soluciones de color
virtuales.
Metodología
• Determinación de desconocidos.
1. Inicie el programa e introducir su
código asignado #.
2. Encienda el instrumento haciendo
clic en el botón en la parte delantera
izquierda.
3. Manipular este mando para ajustar la
transmitancia a 0,0.
4. Preparar una solución patrón de
colorante rojo, haga clic en la flecha al lado
del rectángulo de color rojo en la parte
superior de la página, a continuación, haga
clic con el ratón en la botella lavadora para
poner la solución de colorante rojo en la
celda # 1. Registre la concentración de esta
solución de colorante rojo (ppm).
5. Prepare una solución de colorante
azul en la celda # 2. Se registrará la
concentración de esta solución azul.
6. Haga clic en la celda # 1 para colocar
la solución de color rojo en el
compartimento de cubetas.
7. Haga clic en SCAN. Los datos
observados se abrirán en una ventana gris.
Cierra esa ventana.
8. Haga clic en el compartimento de la
celda o en una de las células para volver.
Célula # 1 a la gradilla.
9. Haga clic en la celda # 2 para colocar
la solución de color azul en el
compartimento de cubetas.
10. Haga clic en SCAN. Aparecerán los
datos observados para la célula # 1 y # 2.
11. Inspeccionar los datos para
seleccionar una longitud de onda (WL1) a la
que la absorbancia del colorante rojo es
fuerte y que de que el colorante azul es
insignificante, a continuación, una longitud
de onda (WL2) a la que la absorbancia del
colorante azul es fuerte y de que el colorante
rojo es insignificante.
12. Ajuste la longitud de onda al valor
que haya elegido para WL1. Haga clic en la
celda # 0 (agua destilada) para colocarlo en
el compartimento de cubetas. Operar la
perilla que se encuentra a la derecha en la
parte frontal para establecer la absorbancia
de esta solución a 0.000.
13. Coloque cada una de las células en el
compartimiento de la celda y registre sus
valores de absorbancia a WL1.
14. Vuelva a ajustar la longitud de onda
al valor que haya elegido para WL2. Poner
célula # 0 en el compartimento de cubetas.
Establecer la absorbancia de esta.
15. Coloque cada una de las células en el
compartimiento de la celda y registrar sus
valores de Absorbancia a WL2.
16. Calcular las concentraciones de
colorante rojo y azul en las soluciones
desconocidas.
17. Haga clic en "resultados de
comprobación" y ver cómo se ha hecho. Si
hay errores, vuelva a revisar sus cálculos
• Verifique resultados
1. De la concentración (ppm) de
colorante azul en la Muestra # 4.
2. De la concentración (ppm) de
colorante rojo en la Muestra # 5.
3. De la concentración (ppm) de
colorante azul en la muestra # 5.
• Comparando Espectros.
1. Haga clic en el vertedor de
soluciones (dump solutions).
2. Preparar una nueva solución de
colorante rojo de volúmenes iguales de
colorante rojo y agua.
3. Preparar una nueva solución de
colorante azul de volúmenes iguales de
colorante azul y agua.
4. Preparar una solución mixta de
volúmenes iguales de colorante rojo y
colorante azul.
5. Coloque cada una de estas
soluciones en el compartimiento de la celda
y haga clic en SCAN.
6. Con los resultados de las tres
exploraciones que se muestran en la ventana
de gris, seleccione copiar en el menú Edición.
7. Abra una hoja de cálculo o un
procesador de texto y pegar los datos.
8. Utilice el programa de hoja de
cálculo para crear e imprimir un gráfico de
los datos. Si esto no es posible, use papel
cuadriculado para crear el gráfico.
Resultados
A- Determinación de desconocidos
Fig.1. Espectrofotómetro virtual usado para
las determinaciones
 600 0.007
610 0.002
620 0.001
630 0
640 0.001
650 0.004
660 0.005
670 0.014
680 0.021

Absorbancia vs Long de Onda

1
0.9 0.919
Fig. 2. Soluciones
0.8
Solución de color rojo: 10 volúmenes
0.7
Solución de color azul: 10 volúmenes
0.6
0.5
1. Gráfico de Absorbancia vs Longitud
de onda del escaneo de barrido de 0.4

la solución roja. 0.3

0.2
Longitud Absorbancia 0.1
de Onda 0
400 0 0 200 400 600 800
410 0.001
420 0.002 2. Gráfico de Absorbancia vs Longitud
430 0.01 de onda del escaneo de barrido de
440 0.028 la solución azul.
450 0.059
460 0.108 Longitud Absorbancia
470 0.166 de Onda
480 0.226 400 0.141
490 0.32 410 0.126
500 0.499 420 0.087
510 0.733 430 0.049
520 0.921 440 0.021
530 0.855 450 0.007
540 0.505 460 0.002
550 0.19 470 0
560 0.069 480 0
570 0.04 490 0.001
580 0.026 500 0.002
590 0.015 510 0.008
 520 0.017 420 0.002 0.085
530 0.028 430 0.01 0.048
540 0.045 440 0.026 0.022
550 0.071 450 0.061 0.008
560 0.134 460 0.109 0.002
570 0.232 470 0.165 0
580 0.346 480 0.225 0
590 0.44 490 0.321 0.001
600 0.561 500 0.497 0.004
610 0.76 510 0.733 0.009
620 0.985 520 0.921 0.016
630 1.084 530 0.856 0.028
640 0.956 540 0.505 0.044
650 0.666 550 0.191 0.073
660 0.367 560 0.072 0.134
670 0.158 570 0.042 0.233
680 0.055 580 0.026 0.346
590 0.015 0.44
600 0.006 0.561
Absorbancia vs Long de Onda 610 0.003 0.761
1.2 620 0.001 0.986
1.084 630 0 1.084
1
640 0.001 0.955
0.8 650 0.001 0.667
660 0.007 0.367
Absorvancia

0.6 670 0.015 0.157

0.4 680 0.023 0.053

0.2

0 Absorbancia vs Long de Onda

0 200 400 600 800
-0.2 1.2
Longitud de Onda 1.084
1
0.921
0.8
3. Gráfico de Absorbancia vs Longitud
absorbancia

de onda del escaneo de barrido de 0.6

la solución roja en comparación a la
0.4
azul.
0.2
Longitud Absorbancia Absorbancia
0
de Onda Rojo Azul
0 200 400 600 800
400 0 0.141 -0.2
410 0.001 0.125 Longitud de onda
 𝟎.𝟗𝟐𝟏
arojo(520nm): = 𝟎. 𝟎𝟕𝟔𝟕𝟓
(𝟏𝟐.𝟎𝒑𝒑𝒎)(𝟏 𝒄𝒎)
- -
ppm cm
4. Longitud de onda a la que se registra
la mayor y menor absorbancia en el
Crojo en el Desconocido 1 a WL1 (520 nm):
colorante rojo y azul
𝟎. 𝟐𝟒𝟕
WL1: Longitud de onda a la que la 𝐶=
(𝟎. 𝟎𝟕𝟔𝟕𝟓𝒑𝒑𝒎 − 𝒄𝒎 − 𝒙 𝟏𝒄𝒎)
absorbancia del colorante rojo es fuerte y
la del azul insignificante.
𝐶 = 3.22 𝑝𝑝𝑚
Color Rojo Longitud de onda: 520 nm

Absorbancia: 0.921 Crojo en el Desconocido 2 a WL1 (520 nm):

Color Azul Longitud de onda: 470 nm
𝟎. 𝟐𝟑𝟏
𝐶=
Absorbancia: 0.000 (𝟎. 𝟎𝟕𝟔𝟕𝟓𝒑𝒑𝒎 − 𝒄𝒎 − 𝒙 𝟏𝒄𝒎)

WL2: Longitud de onda a la que la 𝐶 = 3.01 𝑝𝑝𝑚

absorbancia del colorante azul es fuerte y
la del rojo insignificante. 8. Concentraciones del solución azul en
Color Azul Longitud de onda: 630 nm los desconocidos
Coeficiente de absortividad del colorante
Absorbancia: 1.084 azul:
Color Rojo Longitud de onda: 400 nm Aazul (630nm):
𝟏.𝟎𝟖𝟒
= 𝟎. 𝟏𝟎𝟖𝟒
(𝟏𝟎.𝟎𝒑𝒑𝒎)(𝟏 𝒄𝒎)
- -
Absorbancia: 0.000 ppm cm

CALCULOS Cazul en el Desconocido 1 a WL1 (630 nm):

5. Absorbancia del desconocido #1
𝟎. 𝟎𝟎𝟎
𝐶=
• Absorbancia a WL1 (520 nm): (𝟎. 𝟏𝟎𝟖𝟒𝒑𝒑𝒎 − 𝒄𝒎 − 𝒙 𝟏𝒄𝒎)
0.247
𝐶 = 0 𝑝𝑝𝑚
• Absorbancia a WL2 (630 nm):
0.000 Cazul en el Desconocido 2 a WL1 (630 nm):

𝟎. 𝟏𝟐𝟗
6. Absorbancia del desconocido # 2 𝐶=
(𝟎. 𝟏𝟎𝟖𝟒𝒑𝒑𝒎 − 𝒄𝒎 − 𝒙 𝟏𝒄𝒎)
• Absorbancia a WL1 (520 nm):
𝐶 = 1.19 𝑝𝑝𝑚
0.231

FD = ½
• Absorbancia a WL2 (630 nm):
Máxima Máxima
0.129
absorbancia en el absorbancia en el
7. Concentraciones de la solución roja
rojo azul
en los desconocidos 520nm = 0.921 630nm = 1.084
Coeficiente de absortividad del solución roja:
 560 0.036
570 0.019
580 0.013
590 0.006
600 0.002
610 0.001
620 0
630 0
640 0
650 0.001
B- Comparando Espectros. 660 0.004
1. Soluciones 670 0.007
680 0.01
Solución #1: 10 volúmenes de solución roja
12.0 ppm + 10 volúmenes de agua destilada

Solución #2: 10 volúmenes de solución azul Absorbancia vs Long de onda

10.0 ppm + 10 volúmenes de agua destilada
0.5
0.461
Solución mixta: 10 volúmenes de solución
0.4
rojo 12.0 ppm + 10 volúmenes de solución
azul 10.0 ppm 0.3
absorbancia

2. Gráfico de Absorbancia vs Longitud 0.2

de onda del escaneo de barrido de la
0.1
solución roja + agua.
0
Longitud Absorbancia 0 200 400 600 800
de Onda -0.1
longitud de onda
400 0
410 0
420 0.001 3. Gráfico de Absorbancia vs Longitud
430 0.004 de onda del escaneo de barrido de la
440 0.013 solución azul + agua.
450 0.031
460 0.054 Longitud
470 0.082 Absorbancia
de Onda
480 0.113 400 0.071
490 0.161 410 0.061
500 0.248 420 0.044
510 0.366 430 0.023
520 0.461 440 0.009
530 0.428 450 0.004
540 0.252 460 0.001
550 0.097 470 0
 480 0 Longitud
Absorbancia
490 0.001 de Onda
500 0.002 400 0.069
510 0.003 410 0.063
520 0.01 420 0.045
530 0.013 430 0.028
540 0.021 440 0.023
550 0.037 450 0.035
560 0.067 460 0.055
570 0.117 470 0.084
580 0.172 480 0.113
590 0.22 490 0.16
600 0.282 500 0.25
610 0.379 510 0.37
620 0.494 520 0.469
630 0.54 530 0.443
640 0.477 540 0.274
650 0.332 550 0.131
660 0.184 560 0.103
670 0.08 570 0.138
680 0.027 580 0.186
590 0.229
600 0.285
Absorbancia vs Long de onda 610 0.383
620 0.493
0.6
0.54 630 0.541
0.5 640 0.477
0.4 650 0.335
660 0.185
absorbancia

0.3
670 0.086
0.2 680 0.039

0.1

0
0 200 400 600 800
-0.1
longitud de onda

4. Gráfico de Absorbancia vs Longitud

de onda del escaneo de barrido de la
solución rojo + azul.
 600 0.004 0.28 0.285
absorbancia vs Long de onda 610 0.001 0.381 0.383
0.6 620 0 0.493 0.492
0.541 630 0 0.54 0.541
0.5
0.469 640 0 0.477 0.478
0.4 650 0.001 0.334 0.336
absorbancia

660 0.004 0.182 0.187

0.3 670 0.007 0.08 0.085
0.2
680 0.01 0.028 0.038

0.1

0 absorbancia vs Long de onda

0 200 400 600 800
0.6
Longitud de onda 0.541
0.5
0.467
0.4

Absorbancia
5. Gráfico comparativo de la
0.3
absorbancia de las soluciones
0.2
Longit Absorban Absorban
Absorban
ud de cia cia 0.1
cia
Onda
0
400 0 0.069 0.069
0 200 400 600 800
410 0 0.061 0.063 -0.1
420 0.001 0.044 0.044 Longitud de onda
430 0.005 0.023 0.027 rojo+agua azul+agua rojo+azul
440 0.014 0.011 0.023
450 0.031 0.003 0.034 La solución roja+agua presento su mayor
460 0.055 0.001 0.056 absorbancia (0.461) los 520 nm
470 0.081 0 0.083
480 0.112 0 0.112 La solución azul+agua presento su mayor
490 0.16 0.001 0.159 absorbancia (0.54) a los 630 nm
500 0.249 0.002 0.251 La solución roja+azul presento su mayor
510 0.367 0.005 0.37 absorbancia (0.541) a los 520 nm
520 0.46 0.007 0.467
530 0.429 0.014 0.441
540 0.253 0.021 0.274
550 0.097 0.036 0.132
560 0.034 0.067 0.103
570 0.019 0.116 0.138
580 0.012 0.173 0.184
590 0.007 0.221 0.229
Discusión 0.000, igualmente se tomó el desconocido #2
(celda #5) y se procedió a escanear dando
Para la determinación de desconocido
como resultado a 520nm = 0.231 y a 630nm=
primeramente se preparó una solución roja y
0.129; lo cual con los resultados obtenidos
una azul, los cuales utilizamos para analizarlos
podemos saber que ambos desconocidos
y así obtener mediante un escaneo la longitud
contienen pequeñas cantidades de solución
de onda a la que el colorante tanto rojo como
tanto roja como azul por lo cual procedemos
azul presentaba la mayor absorbancia.
a calcular que concentraciones son las que
(Grafico A-3) El colorante rojo presento una
posee de cada solución esto con la ayuda de
absorbancia mayor a los 520 nm de longitud
la Ley de Lambert-Beer mediante la ecuación
de onda, mientras que el colorante azul
A=abC, donde a es el coeficiente de extinción
presento una mayor absorbancia a los 630 nm
o absortividad, b la longitud del camino y C la
de longitud de onda; esto se debe que la luz
concentración de la muestra. Esta ley expresa
visible representa una sección muy estrecha
la relación entre absorbancia de luz
de este rango con longitudes de onda entre
monocromática (de longitud de onda fija) y
400 nanómetros (nm) para la luz azul y
concentración de un cromóforo en solución
alrededor de 700 nm para la luz roja esto para
ya que a medida que la luz atraviesa un medio
cuando si el color azul y rojo se absorbieran
que la absorbe, la cantidad de luz absorbida
sin embargo en este proceso el azul y rojo es
en cualquier volumen corresponde a la
el color de luz que se refleja ya que en la
intensidad de luz que incide, luego se
región visible apreciamos el color visible de
multiplica por el coeficiente de la absorción.
una solución y que corresponde a las
Frecuentemente la intensidad de un haz de
longitudes de onda de luz que transmite, no
luz incidente declina significativamente a
que absorbe. El color que absorbe es el
medida que pasa a través del medio
complementario del color que transmite. Por
absorbente. (Cálculos), al utilizar la ley el
lo cual podemos mencionar que el color que
coeficiente de absortividad dela solución roja
se absorbe es el verde ya que este se absorbe
fue de 0.07675 ppm-cm- y el coeficiente de
entre 490nm - 580nm reflejando no el color
absortividad del colorante azul fue de 0.1084
rojo sino el color rojo – purpura; igual sucede
ppm-cm- . ya con estos datos calculamos las
con la solución azul de la cual podemos decir
concentraciones de solución roja en los dos
que el color que se absorbe es el naranja ya
desconocidos en donde las absorbancias
que la longitud de onda a la que se absorbe es
utilizadas fueron las calculadas a longitud de
entre 595nm – 650nm reflejando el color de
onda (520 nm) y un coeficiente de
luz azul verdoso.
absortividad de 0.07675 ppm-cm- con una
Luego de haber analizado las soluciones roja y longitud de camino(cubeta) de 1 cm; con lo
azul se procedió a determinación de los cual se obtuvieron 3.22 ppm de solución roja
desconocidos ya que conocíamos las en el Desconocido 1 a (520 nm) y 3.01 ppm de
longitudes de onda a la que las soluciones colorante rojo en el Desconocido 2 a (520
anteriores habían obtenido mayor nm). Luego calculamos las concentraciones de
absorbancia. Con el fin de determinar que la solución azul en los dos desconocidos en
absorbancia presentaban los dos donde las absorbancias utilizadas fueron las
desconocidos se tomó el desconocido #1 calculadas a longitud de onda (630 nm) y un
(celda #4) y se procedió a escanear dando coeficiente de absortividad de 0.1084 ppm-
como resultado a 520nm = 0.247 y a 630nm= cm- con una longitud de camino (cubeta) de 1
cm; con lo cual se obtuvieron 0.00 ppm de depende, fundamentalmente, de la
solución azul en el Desconocido 1 a (630 nm) estructura química de la molécula debido a
y 1.19 ppm de solución azul en el Desconocido que hay una gran cantidad de factores que
2 a (630 nm). Por último, procedemos a la originan variaciones en los valores de λmax y
verificación a través de los dados en el εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad
laboratorio virtual obteniendo resultados del solvente o moléculas vecinas y la
iguales (correctos). orientación de los cromóforos vecinos; y cada
uno afecta de forma particular. Al hacer la
En la comparación de espectro se realizó
comparación de espectros podemos decir a
dilución tanto de la solución roja como de la
través de la teoría que las elevaciones
solución azul utilizando 10 volúmenes tanto
marcadas en los gráficos se deben a la
de soluciones como del agua destilada
concentración que presenta cada una de las
obteniendo como resultados la mayor
soluciones y a las cuales estas son absorbidas
absorbancia en la solución roja + agua =
ya que la absorbancia de una solución es
(0.461) a los 520 nm y en la solución azul +
directamente proporcional a su
agua presento su mayor absorbancia = (0.54)
concentración lo cual nos dice que, a bajas
a los 630 nm(Grafico B-1 y B-2) El espectro de
concentraciones, el aumento de
absorción es una representación gráfica que
concentración se corresponde con un
indica cantidad de luz absorbida (ε) a
incremento lineal en la absorbancia (zona de
diferentes valores de λ. A partir de una
cumplimiento de la ley de Lambert-Beer).
solución diluida de un compuesto, cuya
absorbancia máxima entra dentro del rango Conclusión
de medida del espectrofotómetro, se verá el
• Ser responsables y cuidadosos
valor de absorbancia a diferentes longitudes
con mantenimiento y tratamiento
de onda frente a un blanco que contenga el
que se le debe dedicar al equipo
disolvente de la solución de la muestra a
de espectrofotómetro como
caracterizar. A partir del espectro de
encenderlo quince minutos antes
absorción se obtendrá el valor de λ al que el
de utilizarlo.
compuesto presenta la mayor absorbancia
• El espectrofotómetro es un
(λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer
instrumento muy útil para la
determinaciones cualitativas y cuantitativas
cantidad de procedimientos y es
del compuesto. Lo que nos indica como ya
bueno tener conocimientos
anteriormente hemos mencionado que la luz
básicos para poder manejar el
absorbida en la solución roja +agua destilada
equipo en un laboratorio clínico.
es verde mientras que en la reflejada es rojo
• Comprendimos que la
purpura; igualmente ocurre en la solución
absorbancia y longitud de onda
azul + agua destilada la luz absorbida es
no son conceptos con el mismo
naranja y la reflejada es azul verdoso. Luego
significado y cada una
de haber realizado esta preparación y
desempeña una función
analizado las muestras se procedió a colocar
diferente. también debes tener
cantidades iguales de volúmenes tanto de
en cuenta su resultado para
solución roja como de solución azul
poder interpretar de manera
obteniendo como resultados una grafica con
eficaz los resultados obtenidos
dos picos (Grafica B-3), esto debido a que el
por el equipo.
espectro de absorción de un cromóforo
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