ENZIMAS DEL VINO: POTENCIAL Y

PRACTICAS

1 INTRODUCCION
El vino, una palabra que evoca emociones en millones de personas en todo el mundo, se considera
una forma de cultura y estilo en muchas partes y representa una parte importante de los ingresos
brutos de muchos países. En 2014, la producción mundial de vino fue de 271 mil millones de litros
(271 millones de hectolitros) y el consumo fue de 234 mil millones de litros
(http://www.bkwine.com) que indica un exceso de oferta del 15% al 20% que llevó a una feroz
competencia en el mercado. El mercado del vino es testigo de algunos cambios novedosos, como
la demanda de productos premium, ultra premium (Pretorius, 2000) y vinos de bajo contenido
alcohólico. Estos factores le dan a la industria del vino una fuerte orientación de mercado que a su
vez abre el campo de investigación e innovación hacia mejoras de calidad y cambios varietales
para atraer consumidores. La mayoría de estas mejoras dependen de la aplicación de enzimas de
los tipos deseados y de su calidad catalítica. Se pueden aplicar enzimas para facilitar muchas de las
prácticas del vino, como la liberación de jugo, color y aromas varietales, clarificación del jugo y
estabilización del vino antes del embotellado. Aunque las enzimas nativas de la uva y los microbios
naturales (levaduras, hongos y bacterias) se añaden naturalmente al mosto y al vino en las
diferentes etapas de producción, la mayoría de ellos son poco eficaces en las duras condiciones
fisicoquímicas durante la vinificación. Por tanto, la adición de enzimas exógenas es importante.
Actualmente, La tecnología del vino también está expuesta a aplicaciones de enzimas activas en
frío en diferentes etapas para retener y mejorar el perfil aromático. Sin embargo, la consideración
más importante en la aplicación de enzimas es la capacidad de cada enzima para resistir las duras
condiciones fisicoquímicas en etapas específicas de aplicación durante la vinificación.
 2 CONDICIONES FISICOQUÍMICAS DURANTE ETAPAS
IMPORTANTES DE LA VINIFICACION
2.1 VINO TINTO
El vino tinto se produce a partir de uvas tintas. El primer paso, la maceración, consiste en triturar
los frutos para obtener un producto llamado mosto, que contiene pulpa, piel y semillas rotas. El
estilo del vino desarrollado a partir de este mosto tiene, por tanto, una variedad de características
específicas inherentes de las tres partes mencionadas de la fruta. Una dosis recomendada de SO 2
libre se agrega en esta etapa para inhibir el crecimiento de microbios indeseables. Un período de
incubación de uno a dos días del mosto a temperaturas frías (15-20 °C) llamado remojo en frio,
generalmente se sigue para retrasar el inicio de la fermentación y facilitar la liberación del color
(principalmente antocianinas y taninos) de la piel (la fase de contacto con la piel) antes de la
producción de etanol. Se sigue extrayendo el color y los taninos de pieles durante la fermentación.
La cantidad de color también depende del pH y la concentración de SO 2: un pH más bajo significa
más color, mientras que un SO 2 más alto significa menos color ya que este último blanquea las
antocianinas monoméricas. Los taninos, que son los compuestos astringentes de tamaños
variables, pueden condensar y polimerizar para formar moléculas más grandes de menor
astringencia y color amarillo-marrón. Los taninos ahora pueden formar complejos con pigmentos,
que son menos sensibles a los cambios en pH y SO 2 concentraciones y capaz de provocar
estabilidad de color en el vino.

2.2 VINO BLANCO

El jugo de uva limpio sin piel ni semillas (fuentes de antocianinas y taninos) se usa para hacer vino
blanco. Luego se deja reposar el jugo de uva durante algún tiempo para facilitar la sedimentación
de los sólidos. El jugo claro de la parte superior se lleva a otro tanque (trasiego) para iniciar la
fermentación. Por lo general, la fermentación se realiza a bajas temperaturas para evitar el
deterioro, ya que el jugo de uvas blancas no contiene sustancias conservantes. Las prácticas
comunes de envejecimiento para los vinos blancos incluyen “batonnage”, es decir, la mezcla de
células de levadura muertas con vino para agregar una característica cremosa y de nuez al vino, y
el envejecimiento en barrica (hecho en roble) en pequeñas barricas para impartir una gama de
sabores en vino. Por último, la eliminación de las proteínas que causan la turbidez generalmente
mediante la adición de bentonitas, y ácido tartárico y/o manteniendo la temperatura
constantemente baja (estabilización en frío) se puede seguir. Por tanto, se puede concluir que:

a. El pH al que se producen los vinos tintos es inferior al pH al que se producen los vinos
blancos producido. Por lo tanto, aunque las enzimas ácidas serían deseables para ambos
vinos, son esenciales para el vino tinto.
 b. La fermentación del vino blanco se realiza a temperaturas más bajas y, por lo tanto,
enzimas activas en frío son más deseables para el vino blanco, aunque también son
buenas para el vino tinto.
c. El SO2 es agregado en la mayoría de las etapas de la elaboración del vino blanco, aunque
se usa menos generosamente durante la elaboración del vino tinto. Se utiliza siempre tras
la finalización de la fermentación maloláctica de estos vinos. Por tanto, las enzimas
resistentes/tolerantes a SO2 serían deseables en general, pero más específicamente para
el vino blanco.
d. Las proteínas inestables que precipitan en botellas son comercialmente indeseables y el
problema existe más con el vino blanco. Estas proteínas generalmente se eliminan con
bentonita. Debido a que la bentonita precipita las proteínas, también precipitaría la(s)
enzima(s) para ser utilizado durante la produccion reduciendo así la actividad
sustancialmente. Por tanto, se utilizarían enzimas antes de la adición de bentonita.
e. Debido a que los taninos reaccionan con las proteínas, los vinos que contienen mayores
cantidades de taninos se tienen que tratar con gelatina para eliminar el exceso de taninos
antes de añadir enzimas.
f. La actividad de la cinamil esterasa (CE), cuya fuente puede ser por la contaminacion por
microbios (Brettanomyces bruxellensis) o las propias enzimas del vino, cataliza el primer
paso del proceso de dos pasos para la síntesis de vinil-fenoles; este último reduce el
carácter afrutado y, en casos extremos, añade olores desagradables en los vinos blancos.
Por tanto, son deseables enzimas libres de CE.

3 ENZIMAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCION DE VINOS

3.1 Pectinasas
Las pectinasas son el nombre genérico dado a un conjunto de enzimas, cada una de las cuales
cataliza la hidrólisis de formas específicas de pectina.

3.1.1 Clasificacion
Como las pectinasas son el grupo más importante de enzimas procesadoras de alimentos, también
son las más estudiadas. Se clasifican en base a su modo de acción, preferencia de sustrato y
naturaleza de los productos, como se ve en Cuadro 6.1.

3.1.2 Roles
Hidrólisis de sustancias pécticas: las paredes celulares de las células vegetales contienen pectinas
que deben modificarse durante ciertas etapas de crecimiento (Whitaker, 1990) y durante la
maduración de los frutos. Para lograrlo, las células vegetales son capaces de sintetizar pectinasas.
Además de las enzimas endógenas, la uva obtiene diversas pectinasas producidas por la microflora
asociada que ingresa al mosto y al vino con las uvas. Entre la microflora, Botrytis cinerea, que
causa la pudrición gris en la uva, es de primordial importancia. Extracción y clarificación del jugo:
las pectinasas rompen las paredes celulares y facilitan así la liberación del jugo y el color. Si se
aplica antes del prensado, las enzimas producen una pulpa con buenas características de
prensado. La aplicación posterior al prensado provoca la reducción de la viscosidad del jugo de uva
y la agregación de las partículas nubosas en moléculas más grandes, lo que facilita su
asentamiento y eliminación. A menudo, la combinación de pectinasas, celulasas y hemicelulasas
(llamadas en conjunto enzimas maceradoras) resulta más eficaz que las enzimas pectinolíticas
puras en la extracción de jugo y grado de sedimentación. Extracción de pigmentos y fenoles: el
tratamiento del mosto de uva tinta con pectinasas suele acelerar la liberación de pigmentos y
fenoles. Tambien se ha reportado que la enzima incrementa la intensidad de una cierta variedad
de aromas y sabores, y magnifica las caracteristicas astringentes (Pretorius, 2000). Formación de
metanol: un efecto indeseable del uso de pectinasas en la vinificación es el aumento de los niveles
de metanol en el producto. Cabe señalar que el metanol también es aportado naturalmente por
las pectinasas endógenas en el vino debido a la acción de las pectin-metil esterasas (PME), un
componente del complejo de pectinasas. Debido a que la pectina muy metilada es un sustrato
pobre para las poligalacturonasas, la actividad de PME para desmetilar la pectina para su posterior
degradación es esencial. La PME de esta manera parece ser un "mal necesario". Se ha sugerido
que ciertos factores como la variedad de uva, la cepa de levadura y las prácticas de obtención
utilizadas pueden afectar la formación de metanol (Nicolini y col., 1994). Por lo tanto, es un
desafío para los productores de vino garantizar que la actividad de la PME se produzca sin permitir
que los niveles de metanol se eleven por encima de los límites permitidos (400 mg/L es el límite
máximo de metanol recomendado por la Organización Internacional de la Viña y el Vino, OIV).

Aunque las condiciones de pH (3-4) mantenidas durante el proceso de vinificación son

generalmente favorables para las enzimas pectolíticas endógenas (el pH óptimo varía entre pH 2 y
8), las temperaturas que se mantienen durante la vinificación y otros factores como el dióxido de
azufre (SO2), los taninos, el alcohol y la bentonita son inhibidores de esta. Por tanto, generalmente
se considera necesaria la aplicación de preparaciones comerciales de pectinasas.

3.1.3 Caracteristicas deseadas

a. Bajo pH (3-5) y temperatura óptimos (10-20 °C).
b. Resistente a SO2, taninos y bentonita.
c. Idealmente, capaz de actuar sobre pectina metilada con actividad PME insignificante.

3.1.4 Pectinasas comerciales y sus características

Las pectinasas son las preparaciones enzimáticas más importantes y de uso común que se aplican
en el vino para facilitar la extracción de jugo, color, taninos y compuestos saborizantes. El hongo
(Aspergillus sp.) es la principal fuente de preparaciones de pectinasas comerciales disponibles
(Alkorta y col., 1994); algunos de ellos se dan en Cuadro 6.2.
3.1.5 Ingeniería genética para generar levadura pectinolítica
Sobreexpresión del gen de la poligalacturonasa en Saccharomyces cerevisiae: el gen PGU1 que
codifica la poligalacturonasa se clonó con éxito, se secuenció a partir de S. cerevisiae IMI-8b
(Blanco et al., 1998) y expresado como copia adicional en muchas cepas de S. cerevisiae con el
resultado de una mayor actividad enzimática en las cepas recombinantes. Se utilizaron plásmidos y
se descubrió que los antecedentes genéticos de las cepas eran de vital importancia para la
expresión de PGU1. Expresión heteróloga de genes de pectinasa en S. cerevisiae: los genes pelE y
peh1 codificando pectato liasa y poligalacturonasa de Erwinia chrysanthemi, y Erwinia carotovora,
respectivamente, se expresaron como inserciones en varios casetes de expresión. Estos casetes
contenían promotores, señales de secreción y secuencias terminadoras de fuentes bacterianas y
de levadura (Laing y Pretorius, 1993a). Por ejemplo, las fuentes de señales de inicio de la
transcripción fueron los promotores de la alcohol deshidrogenasa del gen I de la levadura (ADH1),
α-factor (MFαS) y genes de α-amilasa (AMYl) bacteriana (Bacillus amyloliquefaciens), mientras que
la fuente de la secuencia de terminación de la transcripción fue el gen de la triptófano sintasa de
levadura (TRP5). Las secuencias líderes que controlan la secreción de MFαS, B. amyloliquefaciens
α-amilasa, E. chrysanthemi pectato liasa (gen pel1), y E. carotovora poligalacturonasa (gen pehE)
se utilizaron como fuentes de señales de secreción. Así, los casetes construidos ADHlp-MFαS-peIE-
TRP5T (PEL5) y ADHlp-MFαS-pehl-TRP5T (PEH1) fueron utilizados para expresarse (Laing y
Pretorius, 1993b) y coexpresarse en S. cerevisiae. Se encontró que la coexpresión aumentaba la
hidrólisis de pectina sinérgicamente. El esfuerzo fue impulsado por la construcción de otro
constructo (END1) albergando el gen de la endo-β-1,4-glucanasa (Endl) y su exitosa coexpresión
con PEL5 y PEH1 en cepas de levadura de vino de S. cerevisiae (Van Rensburg y col., 1994).
Asimismo, el gen de la endopoligalacturonasa de hongos (Aspergillus niger) bajo el control del
promotor ADH1 también se expresó con éxito en S. cerevisiae (Lang y Looman, 1995). La levadura
de vino pectolítica recombinante también se construyó mediante la introducción de casetes de
expresión que contienen el gen PelA de Fusarium solani F. sp. pisi fusionado con el promotor del
gen de actina de S. cerevisiae en cepas de levadura de vino (González-Candelas et al., 1995). Otra
cepa pectinolítica de S. cerevisiae fue generado usando S. cerevisiae PGU1 bajo el promotor
constitutivo PGK1 (del gen de la 3-fosfoglicerato quinasa) en un proceso integrador dirigido a una
región aguas arriba prescindible del locus de acetolactato sintasa (ILV2), que determina la
resistencia al sulfometuronmetilo. Aunque se descubrió que la aplicación de esta cepa
recombinante mejoraba el rendimiento del vino tinto en un 7% y la intensidad del color hasta
cierto punto, el rendimiento no estaba a la par con lo que se logró con las enzimas ( Fernández-
González et al., 2005).

3.1.6 Pectinasas activas en frío

Se cree que la aplicación de un proceso en frío (15-20 °C) es ventajosa en la industria del vino, ya
que aumenta la producción y retención de compuestos volátiles, mejorando así el perfil aromático
de los vinos (Sahay et al., 2013). Las pectinasas adecuadas para el proceso de vino frío deben ser
activas al frío y tolerantes al ácido, además de la tolerancia a otros factores. Por lo tanto, las
enzimas pectinolíticas activas en frío son necesarias para la industria del vino tanto para la
extracción (jugo y color) como para la clarificación (Sahay et al., 2013). A pesar de estas ventajas,
se encuentran disponibles algunos informes sobre el aislamiento y caracterización de pectinasas
activas en frío (Singh y col., 2012; Martín y de Ambrosini, 2013; Merín y de Ambrosini, 2015; Sahay
et al., 2013). Se ha encontrado que las pectinasas activas en frío de bacterias Bacillus sp.
polimetilgalacturonasa, tiene actividad predominantemente en condiciones de crecimiento ácidas
y de baja temperatura, mientras que los niveles más altos de actividad de pectato liasas se
encontraron a 60 °C. Las enzimas estaban activas en condiciones enológicas; es decir, a 20 °C, con
un pH de 3.6, y mostraron 15% y 30% de la actividad máxima a 5 y 10 °C, respectivamente ( Martín
y de Ambrosini, 2013). En condiciones similares, las pectinasas (PME, exoPG y endoPG) de las
levaduras psicrotróficas Cystofilobasidium capitatum SPY11 y Rhodotorula mucilaginosa PT1
mostraron 50% -80% de actividad (Sahay et al., 2013). Las pectinasas activas en frío de cepas de
Aureobasidium pullulans han reportado que permanecen activas en concentraciones de glucosa,
etanol y SO2 que se encuentran habitualmente en la vinificación (Merín y de Ambrosini, 2015).

3.2 GLUCANASAS
Las glucanasas son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de los glucanos. Los glucanos
constituyen una amplia variedad de carbohidratos principalmente debido a la rica diversidad de
monosacáridos y posiblemente de sus numerosos estéreo y regioespecíficos isómeros (Laine,
1994), dando lugar a moléculas complejas y ramificadas simples y lineales (Varki, 2009). También
hay flexibilidad en los vínculos entre los componentes básicos que pueden ser de tipo α (α-
glucanos) o β ( β-glucanos). El carbono participante también puede variar, por lo que existe la
posibilidad de vínculos adicionales, nombrados α-1,3, α-1,4, α-1,6 o β-1,3, β-1,4, β-1,6. También
existe la posibilidad de tipos mixtos de vínculos, por ejemplo, β-1,3-1,4, y los bloques de
construcción pueden disponerse en forma lineal (por ejemplo, paramilón que consta de un enlace
β-1,3 por lo que se llama β-1,3-glucano) o patrón ramificado (por ejemplo, escleroglucano que
contiene un enlace β-1,3-1,6). La celulosa es el glucano más abundante que consta de D-glucosa
unida por enlaces β-1,4 glicosídicos.

3.2.1 Clasificacion
Como existen varios tipos de glucanos, en la naturaleza se encuentran diferentes enzimas para
hidrolizar estos glucanos. En los sistemas tradicionales, las enzimas se clasifican en función del tipo
de reacción que catalizan. La comisión de enzimas también proporciona un código, llamado
número EC (enzyme commission), basado en estos criterios. Si cualquier enzima cataliza más de un
tipo de reacción, llevará más de un número EC. Del mismo modo, si más de una enzima presenta
reacciones similares, compartirían el mismo número de EC. Tal situación conflictiva existe en el
caso de las glucanasas, ya que muchas de ellas exhiben una amplia especificidad de sustrato y
algunas exhiben más de un tipo de actividad enzimática, por ejemplo, hidrolasa (EC 3.2.1) y
transglicosidasa (EC 2.4.1). Por lo tanto, se ha desarrollado un programa informático para aplicar
una clasificación de glucanasas basada en secuencias (www.cazy.org). Las familias se diferencian
por las similitudes de las secuencias de aminoácidos y los pliegues corolarios. Por lo general, los
miembros de la familia exhiben mecanismos similares (retención o inversión), excepto los
miembros de GH97, que exhiben mecanismos tanto de retención como de inversión. La familia de
enzimas GH4 y GH109 que exhiben catálisis dependiente de NAD podría hidrolizar tanto α- y β-
glucósidos. En total, hay 120 familias (GH1-GH125), y las enzimas se denominan CAZyme
(carbohydrate active enzyme, enzima activa de carbohidratos). Para fines prácticos, las
clasificaciones tradicionales también pueden ser útiles en las que las glucanasas se agrupan en tres
categorías, que son, (1) endoglucanasas (EC3.2.1.4), que hidrolizan los enlaces glicosídicos
internos, producen oligosacáridos al azar, (2) exoglucanasas, también conocidas como
celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91), hidrolizan los enlaces glicosídicos secuencialmente a partir de
residuos de glucosa que producen el extremo no reductor y, (3) β-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que
cortan el enlace entre las glucosas en la celobiosa. Además, en los dos primeros grupos, el tipo de
enlaces que escinden las enzimas también puede usarse para caracterizar una glucanasa. Algunas
de las glucanasas caracterizadas sobre esa base se dan en Cuadro 6.3.

3.2.2 Roles
Para un enólogo, el glucano más importante es el β-1,3-1,6 glucano (Dubourdieu y col., 1981),
secretado por Botrytis cinerea cuando infecta las uvas y la levadura durante la fermentación y el
añejamiento. Este glucano muestra una masa molecular muy alta y una estructura química
compuesta de enlaces β-d-l,3 unidos a glucosa, con enlaces cortos β-d-l,6 (Dubourdieuet al., 1981).
La levadura libera glucanos junto con muchos compuestos deseables como manoproteínas,
aminoácidos, péptidos de baja masa molecular y nucleótidos, que tienen un efecto positivo en la
sensación en boca del vino. Otro glucano de interés es β-1,3–1,2 un glucano liberado por las
bacterias del ácido láctico que se descomponen, como Pediococcus. Estos glucanos son de
naturaleza muy viscosa, lo que afecta negativamente a la filtrabilidad y clarificación del vino.

3.2.3 Características deseadas

a. Que tengan pH (3-5) y temperatura óptimos (10-20 ° C) bajos.
b. Resistente a SO2 y taninos; preferiblemente a la bentonita
c. Alta actividad de β-1,3–1,6 glucanasa.

3.2.4 Glucanasas comerciales

Las glucanasas de vino (β-1,3-1,6 glucanasa) se producen aplicando Trichoderma harzianum. Las
preparaciones comerciales de glucanasas para la vinificación se muestran en Cuadro 6.4.

3.2.5 Ingeniería genética para generar levadura glucanolítica

Se han hecho intentos para generar una cepa glucanolítica de S. cerevisiae por expresión
heterologa de el gen de la endo-β-d-1,3–1,4 glucanasa (beg1) desde B. subtilis bajo su propio
promotor y secuencias señal (Hunchliffe, 1985). Niveles intracelulares más altos de expresión de β-
glucanasa, fueron encontrados cuando el gen se ligó a un vector 2.1 μ basado en un promotor
ADH1 y transformado en la levadura (Cantwell y col., 1986). En otro intento, el gen de endo-β-d-
1,4 glucanasa (carboximetilcelulasa), de la bacteria Cellulomonas fimi, se expresó en levadura de
vino (Skipper y col., 1985). La levadura recombinante mostró un mayor nivel de secreción si la
región aguas arriba de la secuencia codificante de esta enzima contenía el líder señales del gen de
la toxina “killer” K1 de la levadura. Por otro lado, la coexpresión de genes que codifican
endoglucanasa y exoglucanasa de C. fimi en S. cerevisiae se descubrió que permite que la levadura
recombinante degrade el papel de filtro y la madera de álamo pretratada (Wong y col., 1988). El
objetivo de todos estos intentos, sin embargo, no parece superar específicamente el efecto del β-
1,3–1,6 glucano durante la vinificación.

3.2.6 Glucanasas activas en frío

Una biblioteca metagenómica de microbios aislados de la superficie de la alga feofícea
Ascophyllum nodosum se ha informado que produce endo-β-1,4-glucanasa activa en frio (Martin
et al., 2014). Los genes que codifican β-1,3-glucanasa basica y β-1,3-1,4-glucanasa acida, clonados
de una bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes S85, se ha encontrado que producen enzimas
con 14% -35% de actividad residual a - 4 °C (Yaish y col., 2006). Otra bacteria gastrointestinal
Paenibacillus sp. Cepa YD236, aislada de las heces de Bos frontalis, producio el gen pglue8
codificando endoglucanasas activas en frío que podrían hidrolizar el β-D-glucano de la cebada,
CMC-Na, almidón soluble, laminarina y glucano de levadura negra, óptimamente a pH 5,5 y 50 °C,
y retener 78,6%,41,6% y 34,5% de actividad máxima cuando se analizan a 20, 10 y 0 °C,
respectivamente (Dong et al., 2016). Una endo-1,4-β-glucanasa adaptada al frio, con 42 kD de
masa molecular, también se ha purificado de Citrobacter farmeri A1, una bacteria simbiótica de
Reticulitermes labralis, mostrando actividad a pH 6.5–8.0 y temperaturas 30–40 °C con >50% de
actividad residual incluso a 5 °C (Bai et al., 2016). Un prometedor gen de endo-β-1,4-glucanasa
(CaCel) se ha clonado de Cryptopygus antarcticus que codifica enzimas que funcionan de manera
óptima a pH 3,5 y retienen el 80% de su actividad a 0-10 °C (Song et al., 2017).

3.3 GLUCOSIDASAS
Las glucosidasas (EC 3.2.1 O-glucósido hidrolasas) son enzimas clave del metabolismo de los
carbohidratos. Catalizan la escisión de enlaces O-glucósidicos en carbohidratos y biopolímeros que
contienen carbohidratos (Sova et al., 2013).

3.3.1 Clasificación
Para un bioquímico, las palabras glucanasas y glucosidasas son confusas, ya que ambas categorías
de enzimas están incluidas en la amplia clase de CAZyme (enzimas activas de carbohidratos). El
autor sigue sistemas modernos y, por lo tanto, sugiere referirse a CAZy ( www.cazy.org) para
detalles. De varias glicosidasas, β-glicosidasas (también llamado β-D-glucósido glucohidrolasa) y EC
3.2.1.21, catalizan la hidrólisis del β- enlaces glucosídicos, como alquilo y arilo β-glucósidos, β-
oligosacáridos unidos, así como varios oligosacáridos, con la liberación de glucosa (Béguin, 1990),
importante para la vinificación.

3.3.2 Roles
Los precursores del aroma de muchas variedades de uvas no se expresan debido a su enlace con
las moléculas de azúcar. Estos pueden liberarse de forma natural y lenta durante el añejamiento
del vino, o liberarse intencionalmente mediante el uso de enzimas enológicas durante la
vinificación. Los compuestos volátiles que pueden liberarse de los precursores de aroma
glicosídicos son principalmente terpenos, C13 norisoprenoides, derivados bencénicos, fenoles
volátiles y compuestos C6. Los componentes de azúcar en estos compuestos son glucósidos o
diglucósidos o con menos frecuencia triglucósidos. Todos contienen un resto glucosidico, pero en
di- o triglucósidos, y además de glucosa, otros monosacáridos, como α-L-arabinofuranosa, α-L-
ramnopiranosa, β-D-xilopiranosa, o β- apiofuranosa, puede estar presente. Las glicosidasas, que
están involucradas con la escisión enzimática de los glicósidos disacáridos, incluyen α-L-
arabinofuranosidasa, α-L-ramnopiranosidasa, β-D-xilopiranosilo, β-apiofuranosyl, y β-D-
glucopiranosidasa (también llamada β-D-glucosidasa). Los compuestos aromatizantes ligados a
disacáridos se hidrolizan en dos pasos: primero, dependiendo de los precursores, los enlaces
glicosídicos se escinden mediante un α-L-arabinofuranosidasa, α-L-ramnosidasa, o una β-D-
apiosidasa; el segundo implica la liberación de los monoterpenoles por β-glucosidasa (Sánchez-
Torres et al., 1996). Los propios precursores del aroma se convierten lentamente en la forma
aromática libre con el tiempo a través de la hidrólisis, lo que garantiza la longevidad de estos
estilos de vino. Sin embargo, los vinos con una vida útil corta requieren la adición de enzimas
exógenas para una liberación más rápida de aromas. Porque las cepas de S. cerevisiae poseer poco
o nada de actividad de β-glicosidasa (Dubourdieu y col., 1988), y los compuestos aromáticos en las
uvas pueden estar vinculados a varios tipos de componentes del azúcar, por lo que se requieren
diversos tipos de glicosidasas exógenas para liberar los compuestos aromáticos. Impulsado por
esto, muchas levaduras que no son saccharomyces como Hanseniaspora valbyensis,
Brettanomyces anomalus (Fla y col., 2005), y especies de Candida (Gunata y col., 1990) se han
explorado en busca de glicosidasas que pueden ser adecuadas para la liberación de aromas
específicos de una variedad especifica (Laffort y col., 1989). Las glucosidasas son inhibidas por la
glucosa y, por tanto, solo pueden utilizarse en vinos acabados con un azúcar residual <20 g/L.
Algunas actividades de β-glicosidasa pueden separar el azúcar de la antocianina, dejando la
aglicona inestable que se transforma espontáneamente en una forma incolora. Por lo tanto, es
importante que cualquier enzima utilizada para la producción de vinos tintos o rosados no tenga
actividad antocianasa. El Cuadro 6.4 describe algunas glicosidasas disponibles comercialmente y
sus características.

3.3.3 Características deseadas

a. pH (3-5) y temperatura óptimos (10-20 ° C) bajos.
b. Resistencia a SO2, taninos y etanol (9% -16%).
 c. Poseer β-glicosidasa más otras actividades deseables de glicosidasa.
d. Libre de actividad antocianasa.
e. Resistente a la inhibición de la glucosa.

3.3.4 Ingeniería genética

La expresión heteróloga del gen de Trichoderma longibratum que codifica β-1,4 glucanasa en S.
cerevisiae se ha descubierto que aumenta la intensidad del aroma del vino producido por levadura
recombinante (Pérez-González y otros, 1993). Las cepas de S. cerevisiae que contienen genes
heterólogos ABFI (α-L-arabinofuranosidasa) y BXLI ( β- d-xilosidasa) se han desarrollado
posteriormente (Margolles-Clarketal., 1996). Otra cepa recombinante de levadura de vino ha sido
desarrollada por la coexpresión de α-L-arabinofuranosidasa y una β-glucosidasa de Aspergillus
awamori y Saccharomycopsis fibuligera, respectivamente, que podrían producir vino con niveles
más altos de monoterpenos como citronelol, linalol, nerol y α-terpineol en comparación con el
vino elaborado con un tratamiento enzimático comercial (Zietsman et al., 2011). Una cepa de
levadura que expresa un gen monoterpeno-sintasa de la planta Vitis vinifera reporto que produce
aroma por conversión catalítica de un precursor universal difosfato de geranilo en monoterpenos
(Cordente et al., 2012). Un esfuerzo integral para construir dos casetes de genes de
expresión/secreción de levadura, que son, (1) un casete de genes de pectinasa (pPPK) que
comprende el gen de endo-poligalacturonasa (pelE) de E. chrysanthemi, y el gen de pectato liasa
(peh1) de E. carotovora y (2) un casete génico de glucanasa/ xilanasa (pEXS) que comprende el
gen para endo-b-1,4-glucanasa (end1) de Butyrivibrio fibrisolvens y el gen para endo-b-1,4-xilanasa
(xynC) de A. niger. Las levaduras de vino transformadas produjeron actividades de pectinasa,
glucanasa y xilanasa durante la fermentación de los jugos de uva Pinot Noir, Cinsaut y Muscat
d'Alexandria, mostrando así potencial para mejorar la claridad, la intensidad del color y la
estabilidad y el aroma del vino al mismo tiempo (van Rensburg et al., 2007).

3.3.5 Glicosidasas activas en frío

La glicosidasa activa en frío que muestra una actividad residual del 5% a 0 ° C y en un amplio rango
de pH (5,5-10,9), con una actividad siete veces mayor con glucósido que con galactósido, se ha
purificado a partir de Paenibacillus sp. (Shipkowski y Brenchley, 2005). β-Glicosidasa de bacterias
Shewnella sp. G5, aislado del contenido intestinal del organismo bentoico marino Munida
subrrugosa, reporto que exhibe una alta actividad a 4 y 20 °C (Cristóbal et al., 2008). El gen que
codifica β-glicosidasa activa en frio (bgl1C), clonado de una bacteria de aguas profundas
Exiguobacterium oxidotolerans A011, reporto que produce enzimas que retienen el 61% de
actividad a 10 °C (Chen y col., 2010). Una β-glucosidasa tolerante a la glucos de Pseudomonas
lutea BG8 exhibe actividad en un amplio rango de pH (5-10) (Tiwari et al., 2014).

3.4 GLUCOSA OXIDASAS

La glucosa oxidasa (GOX, EC 1.1.3.4) es la enzima que cataliza la conversión oxidativa de la glucosa
en ácido glucónico.
3.4.1 Roles
Se ha observado una tendencia creciente hacia los vinos de bajo contenido alcohólico en el
mercado mundial. Los factores que conducen a esta tendencia pueden atribuirse a una legislación
más estricta sobre la conducción bajo los efectos del alcohol y la conciencia de los riesgos para la
salud derivados del consumo excesivo de alcohol (Room et al., 2005). Se dice que los vinos de bajo
contenido alcohólico tienen todos los beneficios (Stockley y Høj, 2005) sin la toxicidad; por tanto,
la demanda de tales vinos ha aumentado a costa de los vinos de alto contenido alcohólico. Los
vinos con bajo contenido de alcohol se clasifican como de alcohol reducido (1,2% a 5,5% –6,5%
v/v), de bajo contenido alcohólico (0,5% –1,2% v/v) y vinos desalcoholizados (no superior al 0,5%
v/v) (Gladstones, 2000). Las técnicas para producir vinos de bajo contenido alcohólico incluyen
diversos tratamientos físicos como ósmosis inversa, destilación y destilación osmótica,
procesamiento de gradiente térmico, separación de membranas y extracción de membranas,
pervaporación. La evaporación de película delgada a presión reducida elimina el exceso de alcohol
del producto o redirige más azúcares de uva a glicerol u otros productos cuando se aplican
enzimas como GOX y catalasa para que haya menos azúcar disponible para la fermentación en
etanol (Malherbe y col., 2003). Sin embargo, todos los métodos fisicoquímicos para la
desalcoholización fueron criticados por reducir la calidad sensorial del vino terminado
(d'Hauteville, 1993) y elevar el costo total de producción (Pickering y col., 1998). Un experimento
inicial de la posible aplicación de GOX en la producción de vino con bajo contenido de alcohol
mostró algunos resultados alentadores, como la reducción del alcohol en un 36% -40% ( Pickering y
col., 1999a) y una mayor estabilidad frente al pardeamiento después de 6 meses de
envejecimiento en botella, frente a un vino control. El vino tratado con GOX, aunque mostró una
modificación en el sabor, se encontró que la sensación en la boca y las características del aroma en
general no estaban alteradas (Pickering y col., 1999c), salvo la reducción de la intensidad de
algunos aromas específicos como consecuencia de la exposición a una mezcla de zumo enzimático-
aire. Otro experimento similar se realizó con éxito limitado (Biyela et al., 2009). Las
preocupaciones importantes planteadas contra los vinos tratados con GOX son (1) la producción
de un nivel más alto de compuestos de carbonilo que mejoran sus atributos de unión al dióxido de
azufre (Pickering y col., 1999b), lo que requiere el uso de más dióxido de azufre para estabilizar
microbios (Pickering y col., 1999a), y (2) perfiles aromáticos más pobres en los vinos terminados.
La aplicación de GOX para obtener vinos de bajo contenido alcohólico requeriría, por tanto, un
refinamiento de técnicas y GOX con propiedades catalíticas adecuadas. El cuadro 6.4 describe los
GOX disponibles comercialmente y sus características.

3.4.2 Características deseadas

a. pH (3-5) y temperatura óptimos (10-20 ° C) bajos.
b. Alta actividad de glucosa oxidasa.
c. Poco o ningún efecto sobre el sabor y aroma del vino.
3.4.3 Glucosa oxidasa activa en frío
Apenas hay informes sobre glucosa oxidasa activa en frío.

3.5 UREASA ÁCIDA

La ureasa ácida (EC 3.5.1.5) es una enzima que hidroliza la urea en amoníaco y dióxido de carbono
en condiciones ácidas, como sigue:

NH2CONH2 + 2H2O  CO2 + 2NH3

3.5.1 Roles
La urea da lugar al carbamato de etilo después de reaccionar con etanol. El carbamato de etilo es
un compuesto cancerígeno conocido para algunos animales y probablemente también para los
seres humanos. Por tanto, se recomienda que la concentración de urea no supere el límite de 1
mg/ml en el vino para evitar la formación de carbamato de etilo (Varga et al., 2011). El vino por
diversos medios recibe urea en concentraciones variables. Algunas de las formas importantes
incluyen (1) la conversión metabólica de la arginina, un aminoácido importante presente en el jugo
de uva, en varios productos por la levadura del vino S. cerevisiae (Monteiro y col., 1989); la urea es
el producto intermedio secretado en el mosto, (2) el uso no juicioso de fertilizantes que contienen
urea poco antes de la cosecha, (3) la adición nutrientes que contienen urea al medio de
fermentación del vino para evitar fermentaciones lentas o lamidas, y (4) uso de cepas de S.
cerevisiae que muestran una mayor actividad formadora de urea. Aunque una de las alternativas
suaves para reducir los niveles de urea en el vino es el uso de una cepa de levadura con baja
producción de urea; un método controlable más eficazmente es el uso de una enzima adecuada.

3.5.2 Características deseadas

a. pH (3-5) y temperatura óptimos bajos (10-20 °C).
b. Alta actividad enzimática.

3.5.3 Ureasa ácida comercial

La aplicación de preparados comerciales de la ureasa ácida en el mosto para controlar la
concentración de urea en el vino se ha defendido anteriormente (Ough y Trioli, 1988).
Recientemente, la OIV ha permitido que esta práctica reduzca los niveles de carbamato de etilo en
los vinos, allanando el camino para una intensa investigación para explorar enzimas con mejores
características catalíticas. Para cumplir con los regímenes regulatorios, las técnicas de ureasa ácida
de células enteras (Esti et al., 2007) o técnicas de inmovilización aplicando una matriz adecuada
(Eupergit C250L o chitopearls BCW-30003 y BCW-3010) y también se han desarrollado enzimas
purificadas para eliminar la urea de los vinos (Andrich y col., 2010).

3.5.4 Ingeniería genética

Cepa de levadura vitivinícola productora de ureasa: debido a que la cepa knock-out de arginasa
producida por deleción secuencial de CARI gen en la levadura de vino resultó ser comercialmente
inviable debido a su retraso en el crecimiento (Kitamoto y col., 1991), se hicieron esfuerzos para
diseñar cepas secretoras de ureasa. Un producto de fusión, que consta de las tres subunidades (α, β y
γ) del operón ureasa de Lactobacillus fermentum, y secuencias enlazadoras de ureasa de frijol,
insertadas entre las tres subunidades (Visser, 1999), fue construido y expresado bajo el promotor y
terminador PGKl de S. cerevisiae en dos levaduras. El constructo fue capaz de expresarse en S.
cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, en S. cerevisiae, sin embargo, la secreción de proteína fue
muy baja y tampoco mostró ninguna actividad enzimática (Visser, 1999). La ausencia de actividad
ureasa en células trasnformadas de S. cerevisiae se atribuyeron a la falta de productos génicos
accesorios; estos últimos están presentes solo en especies productoras de ureasa como S. pombe. En
otro enfoque, la cepa importadora de urea 522, construido por la expresión constitutiva del gen DUR3
que codifica la proteína integral de membrana responsable de la importación de urea a bajas
concentraciones, bajo el control del promotor y terminador PGK1 de S. cerevisiae en la cepa 522 de S.
cerevisiae, redujo la EC en un 81% en el vino Chardonnay (Dahabieh et al., 2009).

3.6 PROTEASAS ÁCIDAS

Las proteasas (proteína hidrolasas) catalizan la hidrólisis del enlace amida (péptido) en sustratos
de proteínas o péptidos. Las proteasas ácidas son enzimas que catalizan la degradación de
proteínas en condiciones ácidas.

3.6.1 Clasificación
a. Exopeptidasas (que pueden ser aminopeptidasas o carboxipeptidasas) y endopeptidasas,
sobre la base del sitio de acción.
b. Aspartil proteasas, cisteína proteasas, serina proteasas, treonina proteasas y zinc (metalo)
proteasas, sobre la base de la naturaleza de los residuos del sitio activo implicados.

3.6.2 Roles
Los vinos, especialmente los vinos blancos, se enfrentan a problemas de formación de turbidez
inducidos por la desnaturalización de las proteínas que se encuentran en cualquier momento
durante la vinificación o después del embotellado, que en última instancia reducen la calidad
estética del producto terminado. Las fuentes de tales proteínas pueden ser la uva, patógenos que
infectan la uva (proteína relacionada con la patogénesis, PRP) o levaduras. Las principales
proteínas responsables son proteínas similares a la taumatina (TLP), quitinasas, invertasas y β-
glucanasas. En la producción de vino blanco, por lo tanto, se requiere una práctica adicional para
prevenir la formación de turbidez de proteínas. La adición de bentonita, que es un compuesto
químicamente complejo que consiste en silicato de aluminio hidratado y cationes intercambiables
asociados, se usa generalmente para tratar este problema. Sin embargo, el método ha atraído
críticas como, (1) pérdida de aproximadamente el 10% del vino cuando se elimina con un
precipitado de bentonita, (2) procesamiento prolongado o período de sedimentación, (3)
reducción de la calidad debido a la dilución de los compuestos de color y sabor, (4) manipulación
manual obligatoria y (5) requerimiento de gastos adicionales en la eliminación de residuos de
bentonita. Por lo tanto, se han evaluado métodos alternativos para la eliminación de proteínas del
vino, pero con un éxito limitado hasta la fecha. Recientemente, el dióxido de circonio solo o en
combinación con bentonita, reporto ser efectivo en el manejo de la turbidez del vino ( Marangon
et al., 2011 ; Salazar et al., 2006). Asimismo, se ha descubierto que manoproteínas de levadura
específicas llamadas factores de protección de la turbidez (Haze protection factors, hpfs) reducen
el agregado de partículas que causan la turbidez y, posteriormente, los genes para hpfs ( YOL155c
y YDR055w) se han identificado y sobreexpresado en levadura de vino (Brown y col., 2007). Las
cepas recombinantes así manipuladas mostraron una formación de turbidez reducida. Si bien el
enfoque recombinante necesita más refinamiento, otras técnicas, como la ultrafiltración, se están
volviendo poco atractivas debido a problemas como la presencia de proteína residual en el
filtrado, los altos costos reportados y la posible pérdida de compuestos organolépticos ( Høj et al.,
2003). Del mismo modo, se ha encontrado que la pasteurización instantánea o períodos cortos de
calentamiento a 90 °C son perjudiciales para la calidad del vino (Tattersall et al., 2001). Por tanto,
una proteasa ácida adecuada tolerante a las condiciones favorables y que provoque la menor
pérdida de volumen de vino y eliminación del aroma proporciona una solución biológica
alternativa a este problema. Debido a que muchas proteínas del vino se originan en la uva en
respuesta a los ataques de patógenos fúngicos (proteínas de defensa o PRP), son inherentemente
resistentes a la proteólisis. La adición de proteasas resistentes como Aspergillopepsina II o
Aspergilloglutamic peptidasa (AGP o Proctasa) al jugo de uva clarificado antes de la pasteurización
rápida y fermentación se ha encontrado eficaz para producir vino estable ( Marangon et al., 2012).
En otro experimento, tratamiento de precalentamiento a 70 °C, en combinación con tratamientos
de proteasa a temperaturas óptimas, y tratamiento con aspartil proteasa de B. cinerea (BcAP8),
también se han encontrado eficaces en la reducción de la turbidez en los vinos blancos (Van
Sluyter et al., 2015). El cuadro 6.4 representa proteasas ácidas disponibles comercialmente para la
vinificación.

3.6.3 Características deseadas

a. Tolerante a condiciones vinícolas como baja temperatura (20 °C), pH (3-5) y etanol.
b. Lo suficientemente robusto como para degradar incluso proteínas resistentes a las
proteasas.

3.6.4 Proteasa activa en frío

Hay informes muy limitados disponibles sobre proteasas ácidas activas en frío. Una serina
proteasa activa en frío de la cepa Chrysosporium (A6) reporto que causa una degradación
significativa tanto de la quitinasa como de la taumatina a 60 °C (Nevalainen, 2011).

3.7 LACASA
Las lacasas (EC 1.10.3.2, para-bencenodiol: oxidorreductasas de dioxígeno) son proteínas
multicupreas que usan oxígeno molecular para oxidar varios compuestos aromáticos y no
aromáticos, incluidos los fenólicos mediante un mecanismo de reacción catalizado por radicales
(Strong y Claus, 2011).
3.7.1 Roles
Las uvas viníferas son ricas en compuestos fenólicos que llegan hasta los vinos. Las uvas tintas son
incluso más ricas que las uvas blancas; el contenido total de polifenoles de los vinos tintos es (300–
5000 mg/L) aproximadamente diez veces mayor que el de los vinos blancos (60–200 mg/L) ( Eder y
Wendelin, 2002). Los compuestos fenólicos afectan las propiedades fisicoquímicas como el color,
el olor y el sabor; exhiben efectos antioxidantes, y algunos polifenoles poseen propiedades
anticancerígenas, antiinflamatorias, antibacterianas y antihepatotóxicas (Strong y Claus, 2011). Los
polifenoles, especialmente el resveratrol en los vinos tintos, y posiblemente los fenólicos no
flavonoides tirosol e hidroxitirosol en los vinos blancos (Zinnai et al., 2013), se cree que sirven
como eliminadores de radicales libres eficaces. Retrasan la eliminación de óxido nítrico de la
sangre y, por lo tanto, reducen la presión arterial y reducen el riesgo de problemas cardíacos y
accidentes cerebrovasculares. A pesar de los diversos beneficios para la salud que ejercen los
compuestos fenólicos, ellos mismos son extremadamente sensibles al oxígeno y se oxidan
fácilmente cuando se exponen al oxígeno o las enzimas oxidantes polifenoloxidasas, incluida la
tirosinasa, y lacasas a quininas, que a su vez reaccionan con polímeros de color oscuro. Estos
polímeros son insolubles en agua y precipitan del mosto y del vino, la lacasa de Botrytis, que se
obtiene de uvas infectadas por Botrytis cinerea, es extremadamente estable y continúa alterando
los compuestos fenólicos desde la etapa de mosto hasta el vino embotellado. Además, la
oxidación de compuestos fenólicos puede afectar negativamente a las propiedades sensoriales y
nutricionales del vino (Zinnai et al., 2013). Este fenómeno de oxidación que experimentan los
compuestos fenólicos en mostos y vinos que provoca alteraciones del sabor y distorsiones del
color se conoce como maderización. Este es un desafío para los enólogos sobre cómo lidiar con
esta paradoja fenólica. Las soluciones incluyen la eliminación de compuestos fenólicos con
polivinilpolipirrolidona (PVPP), bloquear oxidantes mediante la aplicación de dióxido de azufre,
evitar el contacto del mosto y el vino con el aire, etc. Una solución biológica para este desafío es el
uso de fenoloxidasas que se dirigen selectivamente a polifenoles específicos, causando un
pardeamiento oxidativo (Minussi y col., 2002), polimerizándolos y luego eliminándolos por
clarificación sin erosionar las propiedades antioxidantes del vino. Por ejemplo, el tratamiento de
un mosto tinto con lacasa de Trametes versicolor reduce las propiedades antioxidantes del mosto,
pero el tratamiento de mostos blancos con la misma lacasa no, por lo que el tratamiento de
mostos blancos con esta lacasa parece factible (Minussi y col., 2007). Una evaluación previa con
respecto al contenido de polifenoles, el color, la estabilidad de la turbidez y la calidad sensorial de
los vinos Riesling también sugiere que los vinos elaborados con mosto tratado con lacasa eran
mejores que los vinos sin mosto tratado, y que el primer vino necesitaba poca o ninguna adición
de SO2 para hacerlo estable y de mayor calidad (Maier y col., 1990). El hallazgo de que la lacasa de
Pyricularia oryzae oxida el resveratrol pero no cambia su capacidad antirradical ( Espn y Wichers,
2000) lo convierte en una potencial enzima de anti-maderización. Las lacasas también han
demostrado su potencial para ser aplicadas a las actividades subsidiarias en la producción de vino,
como (1) el tratamiento de tapones de corcho para la eliminación oxidativa de fenoles a fin de
evitar la evolución del mal sabor por tetracloroanisol en el vino embotellado (Sponholz, 2000), (2)
uso en biosensores para una estimación amperométrica rápida y confiable del contenido
polifenólico en vinos (Claus y Strong, 2010), (3) eliminación oxidativa de aminas aromáticas
nocivas para la salud como la tiramina (Claus y Strong, 2010), (4) tratamiento de aguas residuales
de destilerías con valores de pH ácido, alta demanda bioquímica de oxígeno (DBO) y demanda
química de oxígeno (DQO), y color oscuro debido a la presencia de compuestos fenólicos o
polímeros nitrogenados (melanoidinas) (Strong y Claus, 2011).

3.7.2 Características deseadas

a. pH (3-5) y temperatura óptimos bajos (10-20 °C).
b. Oxidación de polifenoles sin erosionar las propiedades antioxidantes.

3.7.3 Lacasa activa en frío

No se dispone en la literatura de informes de lacasa activa en frío (Mukhopadhyay et al., 2015).

4 CONCLUSIONES
Las preparaciones comerciales de enzimas procesadoras de uva/mosto como pectinasas,
glucanasas y glicosidasas están disponibles en combinaciones puras y diversas. Otras enzimas
como ureasas acidas, glucosa oxidasas, proteasas ácidas y lacasas se encuentran todavía en gran
parte al nivel de estudio. Las tendencias actuales en las industrias del vino enfatizan la variedad
que, a su vez, depende en gran medida del uso sensato de varias enzimas. Los problemas de
calidad como la actividad de metil-esterasa en las pectinasas, fuentes eficientes de diversos tipos
de β-1,3–1,6 y β-1,3-1,2 glucanasas y la inhibición de la glucosa en las glicosidasas necesitan un
esfuerzo concertado para encontrar soluciones eficaces. Las principales limitaciones en la
aplicación comercial a gran escala de otras enzimas potenciales incluyen la pérdida de sensación
de vino en la boca, aromas y resistencia microbiana, como en el caso de los vinos tratados con
glucosa oxidasa, baja eficiencia en la degradación del PRP como en el caso de las proteasas ácidas
y la oxidación de polifenoles sin reducir sus propiedades antioxidantes como en el caso de las
lacasas. Las cepas modificadas genéticamente que codifican varias enzimas, especialmente las
enzimas pectolíticas, parecen ser formas atractivas de garantizar la disponibilidad de enzimas
durante la vinificación. Pero su aplicación va de la mano de determinadas cuestiones como la
estabilidad de las cepas y la programación de la expresión de enzimas para evitar su contacto con
sustancias inhibidoras añadidas/producidas en el mosto/vino. La búsqueda de cepas productoras
de enzimas adecuadas de la biodiversidad ambiental aplicando enfoques microbiológicos o
metagenómicos parece ser la forma más importante y eficaz de encontrar una solución a muchas
de estas limitaciones.