UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE QUÍMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA ORGÁNICA

GUÍA DE PRÁCTICA DEL

LABORATORIO DE BIOQUIMICA
CÓDIGO: Q07209

ESCUELA DE QUÍMICA

Autora: Dra. Melissa Rabanal A.

Lima- Perú

2019
 ÍNDICE

Página

Información general del curso 03

Bibliografía y sistema de evaluación 04

Normas de seguridad en el laboratorio 05

Unidad I: Proteínas y métodos potenciométricos 11

Práctica 1: Aminoácidos y proteínas 26

Práctica 2: Determinación del punto isoeléctrico 36

Práctica 3: Titulación potenciométrica 41

Unidad II: Métodos espectrofotométricos 47

Práctica 4: Espectro de absorción y determinación de la longitud de onda 53

Práctica 5: Determinación de la creatina y glucosa 62

Práctica 6: Determinación del glucógeno hepático 78

Unidad III: Métodos enzimáticos 86

Práctica 7: Determinación de triglicéridos y colesterol total 91

Práctica 8: Propiedades catalíticas de la catalasa 96

Práctica 9: Fermentación alcohólica y láctica 101

Unidad IV: Vitaminas y organismos fotosintéticos 108

Práctica 10: Vitaminas y organismos fotosintéticos 119

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 INFORMACIÓN GENERAL DEL CURSO

1. Curso: Laboratorio de Bioquímica.

2. Código del curso: QO 7209
3. Escuela Académico Profesional: Química
4. Sumilla: Capacitar al alumno en las diferentes áreas de la bioquímica como
aminoácidos y proteínas, análisis de carbohidratos por espectrofotometría, análisis
enzimáticos y moléculas reguladoras del organismo como las vitaminas, hormonas
entre otras moléculas.
5. Año Académico: 2019 – II
6. Director del departamento: Dr. Julio Santiago
7. Profesores responsables del laboratorio:
Dra. Melissa Rabanal
Ph. D. Fred García
Mg. Juan Carlos Woolcott
8. Horarios: A elegir.
9. Laboratorios: Sala A y B, ubicados en el tercer piso de la FQIQ.
10. Horas de laboratorio: 4 horas a la semana.
11. Programa del Curso:
Unidad I: Proteínas y métodos potenciométricos
Práctica 1: Aminoácidos y proteínas
Práctica 2: Determinación del punto isoeléctrico
Práctica 3: Titulación potenciométrica
Unidad II: Métodos espectrofotométricos
Práctica 4: Espectro de absorción y determinación de la longitud de onda
Práctica 5: Determinación de la creatina y glucosa
Práctica 6: Determinación del glucógeno hepático
Primer examen
Unidad III: Métodos enzimáticos
Práctica 7: Determinación de triglicéridos y colesterol total
Práctica 8: Propiedades catalíticas de la catalasa
Práctica 9: Fermentación alcohólica y láctica
Unidad IV: Vitaminas y organismos fotosintéticos
Práctica 10: Vitaminas y organismos fotosintéticos
Segundo examen

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 BIBLIOGRAFIA

1. Plummer, D. “Bioquímica Práctica”, editorial Mc Graw Hill Interamericana, Colombia,

1981.
2. Lehninger, D.L., Nelson, M.M. “Principios de Bioquímica”, Editorial Omega, S.A.,
España, 1995.
3. Bohinski, R.C. “Bioquímica”, editorial Addison-Wesley Iberoamericana, S.A, EEUU,
1991.
4. Horton H.R., Moran L.A., Scrimgeour K.G., Perry M.D. y Rawn J.D. “Principios de
Bioquímica”, editorial Prentice Hall, México, 2008.
5. Campbell M.K. y Farrell S. “Bioquímica”, editorial Cengage Learning S.A., México,
2009.
6. Díaz J. y Hicks J.J. “Bioquímica”, editorial Interamericana Mc Graw-Hill, México, 1995.
7. Roskoski R. “Bioquímica”, editorial Mc Graw Hill Interamericana, México, 1997.

SISTEMA DE EVALUACIÓN

El promedio de la nota de laboratorio se determina de la siguiente manera:

PL = (PE x 0.4) + (PP x 0.3) + (PI x 0.2) + (HL x 0.1)

Donde:

PL: Promedio de Laboratorio

PE: Promedio de Exámenes

PP: Promedio de Pasos

PI: Promedio de Informes

HL: Habilidad en el Laboratorio.

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 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. INSTRUCCIONES BÁSICAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS

La finalidad es garantizar la protección del personal docente, alumnado y personal de
apoyo, contra los riesgos originados por la manipulación de sustancias químicas y la
operación de equipos e instrumentos.
Su alcance comprende a todas las personas involucradas en las prácticas de laboratorio,
trabajos de investigación o producción; así como al personal responsable de los
almacenes de materiales y reactivos.

1.1. PROTECCIÓN PERSONAL

a) Utilizar guantes, lentes de seguridad y el mandil de protección es obligatorio siempre
que trabaje en un laboratorio. El mandil de preferencia debe ser de algodón, con
botones a presión y con mangas largas.
b) Siempre que sea necesario se debe utilizar una máscara de protección.
c) Trabajar siempre con el cabello recogido, sobre todo si es largo.
d) Antes de salir del laboratorio, lavarse las manos escrupulosamente.
e) No use sandalias ni pantalones cortos en el laboratorio.

1.2. DE LAS PROHIBICIONES

Se prohíbe los siguientes aspectos:
a) Succionar y llenar las pipetas con la boca.
b) Comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
c) El uso de pulseras o joyas, lentes de contacto por que se amplifican riesgos oculares.

1.3. PREVENCION DE LOS INCENDIOS Y EXPLOSIONES:

a) Al terminar los experimentos, cierre todas las válvulas de agua, desconecte los
equipos eléctricos, así como la llave general de energía eléctrica.
b) Antes de iniciar cualquier trabajo, controlar las planchas de calentamiento.
c) Evite la presencia de sustancias volátiles cerca de las cocinillas eléctricas con
resistencias visibles.
d) El calentamiento y los reflujos de solventes orgánicos deben hacerse con mantas o
planchas de calentamiento, nunca con mecheros o cocinillas de resistencia
eléctricas.
e) Considerar que algunos compuestos químicos explotan por efectos del calor o shock
mecánico; por ejemplo: acetileno, acetiluros metálicos, ácidos, los azo y diazo,
cloratos y percloratos, haluros de nitrógeno, peróxidos orgánicos, etc.
f) Si se produce fuego que no puede controlar, aléjese del peligro, de aviso y active la
alarma. Toda persona que escuche la alarma de incendio debe evacuar el edificio.

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g) Si el fuego es pequeño y controlable, use extintor para controlar y extinguir el fuego.
En caso de fuego en un recipiente pequeño tapar el recipiente con una luna de reloj,
un trapo húmedo o con una rejilla de cerámica.

1.4. DE LOS DERRAMES:

a) Para el caso de derrame pequeño de líquidos:
a. Confinar el derrame en un área pequeña.
b. Si se trata de un ácido inorgánico neutralizar soda o carbonatos.
c. Si se trata de una base inorgánica neutralizar sulfato ácido de sodio.
d. Si se trata de otros compuestos usar material no reactivo como arena seca o
arcilla.
b) Para el caso de derrames mayores de líquidos, avise al profesor y si está preparado
realice las siguientes acciones:
a. Si se trata de ácido o bases inorgánicas, usar grandes cantidades de agua; si es
que el agua no causa un daño mayor.
b. Si se trata de líquidos con vapores no tóxicos y miscibles en agua, limpiar con
absorbente de algodón (toalla), posteriormente lavar el absorbente con
abundante agua.
c. Si se trata de líquidos con vapores tóxicos.- Protegido con una mascarilla,
absorbe el líquido con un absorbente de algodón (toalla), traslade el absorbente
dentro de un recipiente hacia una campana extractora, donde lo transferirá a un
recipiente de residuos líquidos peligrosos.
a. Para el caso de derrames de sólidos, barrer el sólido con una brocha y luego
colocarlo en el recipiente de desechos químicos sólidos.

1.5. PRIMEROS AUXILIOS

a. Si se salpica la piel con ácidos, lávese inmediatamente con agua abundante y
aplíquese una disolución de bicarbonato sódico.
b. Si una sustancia lo salpica sobre los ojos, enjuáguese inmediatamente con agua
abundante y después con una solución de bórax. Si persisten las molestias, consulte
al médico.
c. Cuando se ingiere un ácido fuerte, se puede neutralizar con leche de magnesia o su
equivalente.
d. Cuando se ingiere una base fuerte, se puede neutralizar con jugo de naranja o con
vinagre.
e. Cuando se haya ingerido una sustancia venenosa o tóxica, inducir al vómito.

Para neutralizar el efecto de una sustancia venenosa o tóxica, debe administrarse un

antídoto. El Antídoto: es una sustancia que se suministra para hacer inofensivo un
veneno o para retardar su acción.

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Antídoto universal: esta mezcla se preparar con dos partes de carbón activado, una de
óxido de magnesio y una de ácido tánico. Se homogeniza totalmente y se guarda en
seco. Para administrar se disuelven 15g en medio vaso de agua caliente. Si es necesario,
se practica un lavado estomacal.
“Cuando la piel haya estado en contacto con una sustancia venenosa o haya sufrido
alguna quemadura, después de lavar la zona afectada aplique un emoliente”

Emoliente: Sirve para quitar el dolor de los tejidos y membranas inflamadas. Se

administra después de eliminar el veneno.

1.6. ACCIDENTES EN EL LABORATORIO

A.- INCENDIOS
En cualquier tipo de incendio, se debe cerrar inmediatamente toda llave de salida de
gas. Si la llama es pequeña, puede ser apagada con una toalla húmeda o caso contrario
se debe usar un extinguidor de anhídrido carbónico.
➢ Fuego en Ropas: Inmediatamente se debe cubrir con una tela no inflamable.
➢ Incendio de reactivos: Cuando hay incendio de frascos o vasos se debe
inmediatamente tapar la boca de estos, ya sea con una plancha de asbesto o con
una tela húmeda.

B.- CORTES
Muchas veces son producidos por roturas de vidrio como pueden ser de termómetros u
otros. Se debe lavar la herida con agua y jabón, luego aplicar un antiséptico y colocar
una venda.

C.- QUEMADURAS
➢ Ácidos en los ojos: Se debe lavar inmediatamente la parte afectada con bastante
agua de caño, luego con una solución de bicarbonato de sodio al 2%. Seque y eche
dentro del ojo una gotita de aceite de oliva.
➢ Álcalis en los ojos: Lave inmediatamente la parte afectada con bastante agua de
caño, luego con solución saturada de ácido bórico. Seque y eche dentro del ojo una
gotita de aceite de oliva.
➢ Álcalis en la piel: Lávese con bastante agua de caño, luego con una solución de ácido
bórico. Seque y aplique picrato de butesín. Si no hubiera picrato de butesín puede
reemplazarlo con glicerina.
➢ Ácidos en la piel: Igualmente lave con bastante agua de caño y luego con
bicarbonato de sodio diluido. Seque y aplique picrato de butesín.
➢ Fenol en la piel: Se debe lavar con alcohol al 50% ó con una solución de agua de
bromo al 0.5%. Seque y aplique vaselina o picrato de butesin.

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➢ Bromo: Lave con agua del caño. Luego aplique glicerina, limpie la glicerina y aplique
picrato de butesín. También se puede aplicar solución concentrada de Tiosulfato de
sodio.
➢ Agua hirviendo: Aplique sal de mesa sólida en la parte afectada. Agréguele unas
gotas de agua para lograr su adherencia. Enjuague después de 15 minutos.

1.7. PICTOGRAMAS DE SEGURIDAD

Normativa CLP2.

Pictograma Clases de peligro

Peligro de corrosión:
➢ Los que atacan y destruyen los metales.
➢ Los que queman la piel y/o los ojos en caso de contacto
o de proyección

Gases a presión
Son gases a presión que dentro de un recipiente pueden:

➢ Explotar bajo los efectos del calor: gases

comprimidos, licuados o disueltos.
➢ Los gases licuados refrigerados pueden provocar
quemaduras y heridas por frío.

8
 Peligro para la salud
Estos productos químicos pueden ser:

➢ Tóxicos a grandes dosis.

➢ Irritantes para los ojos, la nariz, la garganta o la piel.
➢ Pueden causar alergias en la piel.
➢ Pueden causar somnolencia o vértigos.

Peligro de explosión
El producto puede explotar en contacto con una llama,
una chispa, electricidad estática, por calor, por un choque,
fricción. Ejemplos de ellos, pueden ser:
➢ Materiales explosivos.
➢ Algunos peróxidos orgánicos.

Peligro de incendio
El producto puede inflamarse:

➢ En contacto con una llama, una chispa, electricidad

estática.
➢ Por efecto del calor, fricción.
➢ En contacto con el aire
➢ En contacto con el agua emiten gases inflamables

Productos comburentes
El producto puede provocar o agravar un incendio o
provocar una explosión en presencia de productos
inflamables

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Peligro para la salud
Estos productos se clasifican en una o más de estas
categorías:

➢ Cancerígenos, mutágenos y tóxicos para la reproducción

humana.
➢ Alteran el funcionamiento de ciertos órganos como el
hígado, sistema nervioso, entre otros.
➢ Causan graves daños a los pulmones y pueden ser
mortales si entran en el tracto respiratorio.
➢ Causan alergias respiratorias.
➢ Estos productos pueden ejercer su toxicidad por vía
oral, cutánea o por inhalación.

Peligro de toxicidad aguda

Estos productos son tóxicos, incluso a dosis bajas.

➢ Pueden causar efectos muy diferentes en el cuerpo:

náuseas, vómitos, dolor de cabeza, pérdida del
conocimiento u otros trastornos que pueden causar la
muerte.
➢ Estos productos pueden ejercer su toxicidad por vía
oral, cutánea o por inhalación.

Peligro para el medio ambiente

Son productos que pueden causar efectos nocivos sobre
los organismos del medio acuático

10
 UNIDAD I: PROTEINAS Y METODOS POTENCIOMETRICOS

Los aminoácidos constituyen una clase especialmente importante de compuestos

bifuncionales debido a que son las unidades estructurales que conforman las proteínas.
Sus dos grupos funcionales son uno básico (amino) y otro ácido (carboxilo). Los
aminoácidos forman enlaces amida entre dos unidades y este tipo de unión se denomina
también enlace peptídico y los compuestos resultantes péptidos. El enlace peptídico
puede ser reconocido en el laboratorio mediante el ensayo del Biuret, donde se forma
un complejo entre iones Cu+2 y los pares de electrones libres de los nitrógenos del grupo
peptídico, según:

Las proteínas son un tipo especial de polipéptidos, constituidas fundamentalmente por

unos 20 aminoácidos diferentes. Se trata de moléculas grandes, cuyo peso molecular
oscila entre 6 000 y 1 000 000 (entre 50 y más de 8 000 unidades de aminoácidos por
molécula).
Las proteínas se caracterizan por adoptar cuatro distintos tipos de estructura que son:
- Primaria: Secuencia de aminoácidos en la cadena peptídica de la proteína.
- Secundaria: Interacción de grupos de una misma cadena proteica o de cadenas
adyacentes mediante puente de hidrógeno entre los pares de electrones libre del
oxígeno carbonílico y el hidrógeno amínico. Da origen a dos tipos de estructuras
secundarias: α-hélice y hoja plegada (o β-laminar).
- Terciaria: Es un tipo de estructura supramolecular originada por puentes disulfuro,
puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas y fuerzas de Van der Waals que
ocurren entre las cadenas laterales de aminoácidos alejados en la secuencia de la
cadena peptídica, pero cercanos espacialmente debido al enrollamiento que
experimenta la misma. Producto de este tipo de estructura, las proteínas pueden ser
globulares o fibrosas, lo cual afecta sus propiedades.
- Cuaternaria: Se produce por asociación de dos o más cadenas polipeptídicas
(protómeros) originando proteínas más complejas.

11
Los cuatro tipos de estructuras presentes en las proteínas se muestran en la siguiente
figura.

Estructura primaria de las proteínas en donde se puede observar la interacción de los

puentes disulfuros.

Estructura secundaria de las proteínas de la α-helice.

12
 Estructura secundaria de las proteínas de la hoja plegada.

El grafico ubicado en la derecha muestra cómo

están conformados las dos formas de estructura
secundaria en la matriz extracelular.

Estos gráficos muestran la estructura terciaria de las proteínas. Cabe señalar, que el grafico de
la derecha muestra todas sus interacciones que hay en la estructura terciaria de las proteínas.

13
 Estructura cuaternaria de las proteínas.

Las proteínas sufren cambios en su estructura debido a la acción de agentes físicos

(calor, radiación, etc.) o químicos (solventes, ácidos, bases y soluciones salinas). Estos
agentes afectan las interacciones entre las cadenas proteicas y alteran las estructuras
secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. Sin embargo, la estructura primaria
(secuencia de aminoácidos en la cadena peptídica) sólo puede destruirse mediante
hidrólisis química.
A los cambios en las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria se les denomina
“desnaturalización” y generalmente son procesos irreversibles que muchas veces
provocan la coagulación (precipitación) de la proteína, aunque hay algunos casos en que
estos procesos pueden ser reversibles.

14
 METODOS POTENCIOMETRICOS
Para manejar los métodos potenciométricos es necesario saber el concepto de pH.
El pH se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidronio, tal
como lo muestra la siguiente formula:

pH = - log [H3O+]

La letra p significa “el logaritmo negativo de”, así por ejemplo pKa, es el logaritmo
negativo de la constante de acidez (Ka).
Es una medida de la acidez o alcalinidad de un medio, expresada en valores del 0 al 14.

Aumento de la acidez Aumento de la alcalinidad

NEUTRO

El rango de la escala de pH ha sido determinado por la disociación del agua, cuyo

constante de disociación es 1 x 10-14.
El agua es un electrolito débil y anfiprótico, la siguiente ecuación muestra su disociación
con otras moléculas de agua:

H2O (l) + H2O (l) H3O+ (ac) + OH- (ac)

Está última ecuación puede simplificarse y escribirse de la siguiente manera:

H2O (l) H+ (ac) + OH- (ac)

La constante de equilibrio (Keq) es:

15
Y el valor del producto iónico del agua a 25 ºC, se representa por:

[H+] [OH-] = 1 x 10-14

El valor del producto iónico del agua expresa la relación entre la concentración de los
iones H+ y OH- en soluciones acuosas.

Aplicando el Log y multiplicando por -1 a la ecuación anterior:

- Log [H+] + - Log [OH-] = -Log (1 x 10-14)

pH + pOH = 14

pH = 7, pOH = 7 y pKw = 14

Por ende, un incremento en la [H+], hace que el pH disminuye y el pOH incrementa y por
el contrario, un incremento en la [OH-], hace que el pH aumente y el pOH disminuya.

La siguiente tabla muestra las concentraciones tanto en ácido [H+] como base [OH-] de
un pH de 0 a 14. Cabe señalar, que como son funciones logarítmicas cuando el pH
disminuye, por ejemplo, de 5 a 4, eso significa que al [H+] aumenta 10 veces, es decir de
10-5 a 10-4.

El pH de la mayoría de las células y fluidos corporales está entre 7,2 y 7,4, y a este pH es
conocido como pH fisiológico. Las actividades biológicas de las células o sus
constituyentes dependen del medio en que se encuentren.

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pH [H+] (mol/L) pOH [OH-] (mol/L)

0 100 14 10-14

1 10-1 13 10-13

2 10-2 12 10-12

3 10-3 11 10-11

4 10-4 10 10-10

5 10-5 9 10-9

6 10-6 8 10-8

7 10-7 7 10-7

8 10-8 6 10-6

9 10-9 5 10-5

10 10-10 4 10-4

11 10-11 3 10-3

12 10-12 2 10-2

13 10-13 1 10-1

14 10-14 0 10-0

17
Determinación potenciométrica del pH

El pH de una solución se determina en un equipo llamado POTENCIOMETRO o pH-metro,

el cual es un voltímetro, el cual mide una diferencia de potencial que se mide cuando
hay una señal eléctrica entre dos soluciones de diferente concentración de iones
hidronio separados por una membrana delgada. Está diferencia de potencial es
directamente proporcional al a diferencia de pH de las dos soluciones y la respuesta se
da en pH o de milivoltios.

Cabe señalar, que existe cierto margen de error en la lectura del potenciómetro, cuyos
valores son superiores o inferiores a la escala de pH de 1 a 12. Cuando la muestra es
superior a 12, se le llama “error alcalino”, ya que el electrodo de vidrio es algo permeable
a los iones sodio. Si el Na+ está presente en una disolución a medirse, el pH disminuye
de acuerdo a la concentración de iones sodio presente en la muestra, debido a que el
electrodo detecta las concentraciones de iones H+ y Na+. Así, la concentración de iones
H+ va a mostrar ser mayor de la que realmente es.

Un potenciómetro consta de un electrómetro y de electrodos.

Electrómetro.- Es un dispositivo que mide diferencias de potencial pequeñas en un

circuito de resistencias altas.

Electrodos. - Los electrodos pueden ser de tres tipos:

18
1. Electrodos de referencia interna, electrodo indicador o electrodo de vidrio.-
Es un electrodo de membrana de vidrio que separa dos soluciones aun pH conocido.
El primer electrodo interior contiene una solución de HCl 0,1 M y el otro electrodo
mide el pH de la muestra, a partir de esta diferencia de potencial se obtiene el pH de
una muestra.

En este electrodo de vidrios están hechos de un tubo grueso de borosilicato, en cuyo

extremo posee un orificio de alrededor de 0,1 mm de diámetro, el cual es permeables
a los iones H+ pero no a otros cationes o aniones.

Electrodo de vidrio para medir el pH de una solución.

Otros tipos de electrodos indicadores incluyen:

- Metálicos como el Platino.

- Indicadores de membrana, que no solo incluyen al electrodo de vidrio sino también al
electrodo de membrana líquida, de estado sólido o precipitado y los sensores de gases.

2. Electrodo de referencia externa o electrodo de calomet saturado (ECS).- La

función del electrodo de referencia externa es mantener el potencial eléctrico
constante. El electrodo más usado es el electrodo de calomel saturado, es un
electrodo de Hg y de calomelanos, que son sales de Hg2Cl2 y por otra parte tiene una

19
 solución de KCl, del cual dependerá el potencial. Este electrodo también tiene un
tubo hecho de vidrio que es impermeable a los iones H+.

La siguiente reacción muestra el proceso:

Hg2Cl2 + 2 e- 2 Hg+ + 2 Cl-

El contacto eléctrico entre el electrodo de referencia y el electrodo de la muestra, se

mantiene unido mediante un puente salino de KCl. Está unión está hecha de una
membrana fibrosa o cerámica colocada al fondo del electrodo de referencia o lateral
para el caso de electrodo combinados.

Usualmente se utiliza una solución saturada de KCl para mantener constante la

concentración del ion cloruro, si la humedad relativa disminuye y hay una
evaporación, el exceso de cloruro precipita fuera de la solución. Por el contrario, si
hay una humedad alta, se disuelve el cloruro adicional.

Si se desea trabajar a temperaturas altas, el Hg - Hg2Cl2 se reemplaza por Ag - AgCl.

En ambos casos el KCl sirve de contacto entre estas sustancias y la muestra.

Otros tipos de electrodos de referencia pueden ser el Electrodo normal de hidrógeno

(ENH) en el cual se miden potenciales de óxido-reducción y también se puede utilizar
el electrodo Hg- HgSO4, libre de cloruro.

3. Electrodo combinado.- Como su nombre lo indica, es un electrodo que contiene al

electrodo de referencia y al externo.

Los potenciómetros están estandarizados con respecto a una solución de pH conocido,

entre los más comunes son:

- Ftalato monobásico de potasio 0,050 M pH 4,01 - 4,02

- Fosfato de potasio monobásico 0,025 M pH 6,84 - 6,86
Fosfato de sodio dibásico 0,025 M
- Tetraborato de sodio 0,01 M pH 9,06 – 9,18

20
Cabe señalar, que la relación entre el voltaje medido y el pH depende de la temperatura,
por eso hay que ajustar el pH-metro a la temperatura de la muestra que se desea medir.

Aplicaciones

Las aplicaciones son amplias, por ejemplo en la industria de la manufactura metal-

mecánica, controlan la calidad del producto. En la industria del caucho, el pH tiene un
rol importante en la polimerización y coagulación y en la preparación de las soluciones
stock del jabón. En la industria del papel, el pH del papel influye en la elasticidad como
en su impresión a la hora de absorber la tinta. En la industria del azúcar, el pH es
controlado en varias etapas de la producción, mejorando no solo el proceso sino
también los costos de producción. En la agricultura, el pH del suelo es importante en la
fertilidad, por ejemplo, el maíz y el trigo crecen más a un pH de 6 a 7, por ende a ese pH,
hay un mayor rendimiento y en la medicina, el pH juega un rol importante, por ejemplo
el pH de la acidez en el estómago para curar o evitar las úlceras, el pH de la piel, del
músculo y de otros fluidos corporales también es importante para el metabolismo
humano.

21
 SISTEMAS AMORTIGUADORES

Introducción

Las soluciones amortiguadoras, llamadas también tampones o buffers, son soluciones

que impiden los cambios bruscos de pH de una solución, ya sean estos ocasionados por
adición de ácidos o bases.

Las soluciones tampones están formadas por un ácido y su base conjugada o por una
base débil y su ácido conjugado. Generalmente, se mezclan ácidos o bases débiles
mezclados con sus bases o ácidos conjugados, respectivamente en proporciones de 1:1,
para lograr un mayor efecto del sistema buffer.

Estos sistemas buffer son importantes ya que muchos mecanismos de la célula

funcionan a valores cercanos a la neutralidad y nuestro organismo cuenta con un
sistema amortiguador intracelular y extracelular. Por ejemplo, un sistema amortiguador
intracelular es el par conjugado H2PO4-1/HPO4-2 y actúa en la sangre, y un sistema
amortiguador extracelular es el par conjugado H2CO3/HCO3-. Ambos sistemas participan
en la regulación del equilibrio ácido-base.

Mecanismo de acción de los sistemas buffer

Para comprender el mecanismo de acción de los sistemas buffer o sistemas de

amortiguadores, primero veamos conceptos de disociación de electrolitos fuertes y
débiles.

Los electrolitos fuertes son aquellos que en disolución acuosa se disocian

completamente en partículas en sus iones. Por ejemplo:

HCl H+ + Cl-

Los electrolitos débiles tienen una disociación parcial y son los más usados en la
bioquímica. Por ejemplo:

CH3COOH H+ + CH3COO-

22
El poder amortiguador se da a través de reacciones reversibles que se establecen en el
equilibrio y que se basa en las reacciones de disociación. Por ejemplo, si tomamos el
mismo cado del ácido acético y le añadimos su base conjugada se tendrán el siguiente
sistema de reacciones:

CH3COOH H+ + CH3COO-

Alta concentración Muy baja concentración

NaCH3COO Na+ + CH3COO-

Disociación total Alta concentración

Podemos resumir, el sistema buffer formado por CH3COOH/NaCH3COO con la siguiente

ecuación:

CH3COOH H+ + CH3COO-
Acido débil Base conjugada

Alta concentración Alta concentración

Si adicionamos una base a este sistema, por ejemplo NaOH, los iones OH- reaccionan
con los hidrógenos del ácido, formando H2o y desplazando el equilibrio hacia la derecha,
tal como lo muestra la siguiente reacción:

CH3COOH + OH- + Na+ H2O + CH3COO- Na+

Si por el contrario, le adicionamos un ácido, como el HCl, los iones hidrógeno reaccionan
con la parte aniónica de la base conjugada, los iones acetato, formando ácido acético y
desplazando el equilibrio hacia la derecha, tal como se muestra en la siguiente reacción:

CH3COOH CH3COO- + H+ Cl-

23
Ecuación de Henderson-Hasselbach

Está ecuación es importante para calcular el pH de los sistemas buffer.

HA(ac) H+ + A-

Despejando la [H+]:

Aplicando el –Log a la ecuación anterior y reemplazando pH=-log[H+] y pKa=-logKa y

reemplazando en la ecuación, se llega a la ecuación de Henderson-Hasselbach:

Si la concentración del ácido es igual al de su base, entonces:

pH = pKa + log1

pH = pKa

Estas ecuaciones sirven para:

- Calcular el valor del pKa de un ácido conociendo la proporción de las especies del
amortiguador y el pH de la solución.
- Calcular el pH de un par conjugado ácido-base conjugada conociendo los valores del
pH y pKa.

24
La eficiencia de un sistema buffer está relacionada con dos factores:

1. La concentración del sistema buffer o amortiguador es la suma de las

concentraciones del ácido y de su base conjugada:
[Buffer] = [ácido] + [base conjugada]
2. Si la relación de concentraciones entre la base conjugada y su ácido es cercana o 1,
el valor del pH es igual al valor del pKa del Sistema y la capacidad amortiguadora es
máxima, ya que al tener la misma cantidad de ambos components proporciones la
misma cantidad de iones ácidos o básicos para mantener el pH a diferentes
condiciones.
Si la concentración del ácido es mayor al de la base conjugada, el buffer tendrá mayor
efecto amortiguador sobre los iones hidroxilos.

Importancia de los sistemas buffer

Los tampons tienen importancia biológica in vitro como in vivo. Por ejemplo, la sangre
es un buffer ideal para conservar los valores en un rango tan estrecho como pH 7,2 a
7,4. Si el pH descendiera a 7, se produciría acidosis y puede llevar a la muerte del ser
humano. Si por contrario, el pH subiría a 7,6, se produciría la contracción generalizada
de todos los músculos, que también llevarían a la muerte del ser humano.

Durante el metabolismo, hay producción de ácidos o de bases, que inclinan el pH al lado

ácido o básico, por eso los amortiguadores presentes como en la sangre y riñones son
los que mantienen el pH y el buen funcionamiento del organismos.

25
 PRÁCTICA Nº 1: AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

OBJETIVOS:
- Identificar los grupos químicos que componen las proteínas y sus grupos
funcionales, usando reacciones sobre el enlace peptídico, grupos terminales α-
aminoácido o al α-carboxilo.
- Reacciones químicas para los α- aminoácidos libres o radicales laterales.

PRINCIPIOS TEÓRICOS

a) Reacción de biuret sobre el enlace peptídico

Las proteínas ó polipéptidos en solución alcalina en presencia de CuSO4 forman
compuestos complejos de cobre, de color azul-violeta con matices rojizo o azulado, la
intensidad depende no solamente del número de enlaces peptídicos sino también si está
asociado a otros grupos como: -CSNH2, -C(NH2)NH2, -CH2-NH2, -CNH-NH2, -CHOH-CH2-
NH2, -CHNH2 y -CH2OH.

Dos moléculas de la forma dienolica de Biuret reaccionan con Cu(OH)2 formando un

complejo, en el cual los enlaces de coordinación entre el par de electrones de los átomos
de nitrógeno de los grupos imino:

Calentamiento

+ NH3

Los complejos de esta forma poseen fundamentalmente un color rojo, cuyo λmáx es de
520-535 nm. Si se forma complejos de cobre con 2 o 3 átomos de nitrógeno, la λmáx es
entre 540-580 nm y 615-670 nm, respectivamente. Por eso, los colores de las soluciones
varían desde azul hasta rojo con predominio de violeta.

En medio fuertemente alcalino, los grupos que forman parte de los enlaces peptídicos
pasan a la forma enolica, en la que los iones Cu+2 formando un complejo coloreado, tal
como se muestra en el siguiente gráfico:

26
Cabe señalar, que con los aminoácidos libres generalmente dan reacción negativa, a
excepción de la histidina, serina, treonina, asparragina, los cuales en solución y a
concentraciones altas pueden formar un complejo coloreado.

b) Reacción de ninhidrina sobre el grupo alfa-amino

El método se basa en la interacción de la Ninhidrina con el grupo α-amino de los
aminoácidos, péptidos y proteínas dando un complejo de color azul o azul-violeta.

Estas moléculas en presencia de la Ninhidrina y con calor producen la desaminación

oxidativa del grupo α-amino de los aminoácidos y péptidos y, además, se produce la
reducción de la molécula de la Ninhidrina. Como resultado de esta interacción es la
formación de la base de Schiff, luego se descarboxila y se descompone a aldehído y
aminodicetohidrindeno.

El compuesto aminodicetohidrindeno se condensa con una molécula más de ninhidrina,

el compuesto obtenido se enoliza dando un color azul-violeta llamado “Purpura de
Ruheman”.

27
 ↔

Cabe señalar, que el aminoácido prolina cuando reacciona con la ninhidrina da un

complejo de color amarillo.

c) Reacción de xantoproteica sobre el anillo aromático de aminoácidos cíclicos

En esta reacción química los anillos aromáticos de los aminoácidos reaccionan con el
HNO3 concentrado dando como resultado un compuesto de derivados del nitrógeno de
color, los cuales en medio alcalino forman estructuras quinoideas de color anaranjado.

Está reacción es típica para los aminoácidos como la fenilalanina, tirosina, triptófano, los
cuales contienen un anillo aromático en su estructura.

28
d) Reacción de millón sobre la tirosina
La tirosina, que es un aminoácido aromático, o la proteína que lo contiene cuando
reacciona con el reactivo de millón, que es una mezcla de nitratos y nitritos de mercurio
I y II, disueltos en ácido nítrico, forman una sal de mercurio de nitrotirosina de color
rojo-púrpura.

Cabe señalar, que está reacción también es positiva para los compuestos fenólicos.

e) Reacción de Hopkins-Cole (Adamkiewicz) sobre el triptófano

Está reacción es específica para identificar la presencia del aminoácido triptófano.
Cuando el ácido glioxílico reacciona con dos moléculas del triptófano en medico ácido
como el ácido sulfúrico forma por condensación al formaldehido un compuesto de color
rojo-violeta.

29
f) Reacción de Foly sobre aminoácidos que contienen al átomo de azufre

Los aminoácidos que contiene el átomo de azufre como la cisteína reaccionan en medio
alcalina para dar NaS. Este último con Na2PbO2 (plumbito de sodio) da un precipitado de
PbS de color negro.

30
g) Reacción de aminoácidos que contiene azufre con nitroprusiato de sodio
Al igual que la reacción anterior, este método también sirve para reconocer a los
aminoácidos que tienen al átomo de azufre en su composición, el cual reacciona en
medio básico para formar NaS, el cual en presencia de Na2(Fe(CN)5NO) nitroprusiato de
sodio nos da un complejo coloreado de color violeta.

h) Reacción de SAKAGUCHI sobre la arginina

Los aminoácidos que contienen una estructura como las guanidinas como la arginina se
pueden identificar al reaccionar con el α-naftol en presencia de un oxidante como el
NaBrO (hipobromito de sodio) formando un compuesto quinonimina naftilarginina de
color anaranjado.

31
Los derivados Quinonimina como las Naftoquinoniminas, en el cual el átomo de
hidrogeno del grupo imino está sustituido por un radical alquilo o arilo siempre está
coloreado de un color amarillo-rojizo. Cabe mencionar la posibilidad de formarse un
compuesto más complejo como consecuencia de la oxidación de los grupos amino ( –
NH) del residuo guanidínico y del núcleo benzólico del α-naftol.

i) Reacción de Pauly sobre la histidina

La histidina reacciona con el p-sulfobenzoldiazonio en presencia del ácido sulfanilico y
nitrito de sodio para formar un compuesto complejo de color rojo-guinda.

32
 MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
- Tubos de ensayo
- Pipetas de 1 mL y 5 mL
- Probetas 10 mL
- Baño de agua
- Termómetro
- Pinzas para tubos de ensayo
- Reactivo de Ninhidrina

Reactivos
- Ácido nítrico concentrado
- NaOH 10% y20%
- Reactivo de Millón
- Ácido acético glacial
- Ácido acético
- Acetato de plomo 5%
- Nitroprusiato de sodio al 5%
- Alfa naftol al 0.2% en alcohol
- Hipobromito de sodio
- Ácido sulfanilico al 1%
- Ácido clorhídrico al 5%
- Urea al 40%
- Nitrito de sodio al 0.5%
- Carbonato de sodio al 10%
- Sulfato de cobre al 0.04%, 0.5%
- Cloroformo
- Huevos
- Soluciones de Glicina, alfa-alanina, beta-alanina al 1%
- Soluciones de fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina, hidrocloruro de cisteína,
metionina, acido aspártico y glutámico, alfa-alanina, beta-alanina, lisina, arginina,
glicina y prolina al 0.01%.

33
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Reacción de Biuret sobre el enlace peptídico

En un tubo de ensayo se colocan 2 mL de la solución de aminoácido o proteína del huevo
y se agregan 3 mL de NaOH al 10%. Agregar gota a gota la solución de CuSO4 al 0,5%, la
formación de un compuesto de color violeta indicará reacción positiva.

b) Reacción de Ninhidrina sobre el grupo alfa-amino

Colocar en un tubo de ensayo 5 mL de la solución de albúmina y 0,5 mL de la solución
de ninhidrina al 0,1%. Llevar a baño maría hasta la aparición de un color purpura, luego
agregar 1 gota de CH3COOH y 1 mL de CHCl3 . Agitar y observar cambio de color violáceo
característico con los aminoácidos.

c) Reacción de Xantoproteica sobre el anillo aromático de aminoácidos cíclicos

Colocar 3 mL de la solución de albumina o aminoácido y 1 mL de ácido nítrico
concentrado. Luego se lleva a baño maría suave, en donde se observa un precipitado de
color amarillo, que luego se disuelve.
Enfriar y añadir gota a gota de hidróxido de amonio hasta el cambio de color a
anaranjado.

d) Reacción de Millón sobre la tirosina

Agregar 1 mL de la solución de albumina o aminoácido. Se le agrega 6 gotas del reactivo
de millón, calentar en baño maría hasta la aparición de un color rojo purpura que
indicará reacción positiva.

e) Reacción de Hopkins-Cole sobre el triptófano

Agregar 1 mL de la solución de albumina o aminoácido. Agregar 10 gotas de ácido
acético glacial, calentar suavemente hasta disolución del precipitado.
Enfriar y agregar cuidadosamente por las paredes del tubo alrededor de 1 mL de ácido
sulfúrico, se formará un anillo coloreado en las dos capas.

f) Reacción de Foly sobre aminoácidos que contienen azufre débilmente unido

como en la cisteína
En un tubo de ensayo agregar 10 gotas de la solución de Pb(CH3COO)2 y gota a gota
NaOH hasta la disolución del precipitado formado al inicio.
Agregar 1 mL de la solución de albumina o aminoácido. Calentar hasta ebullición durante
dos minutos y observar la formación de un precipitado de color negro.

34
g) Reacción de aminoácidos que contiene azufre con nitroprusiato de sodio
Agregar 1 mL de la solución de albumina o aminoácido. Agregar 2 mL de NaOH y llevar a
baño maría por 3 minutos y enfriar.
A cada tubo se agregan 2 a 3 gotas de Na2(Fe(CN)5NO) y observar la aparición de un color
rojo violeta que indicará reacción positiva.

h) Reacción de SAKAGUCHI (características de las guanidinas como la arginina)

Agregar 1 mL de la solución de albumina o aminoácido. Agregar 2 mL de NaOH al 10% y
unas gotas de solución alcohólica de alfa naftol al 0.2%. Agitar y añadir 0,5 mL de la
solución de NaBrO y mezclar. Inmediatamente adicionar 1 mL de urea al 40% mostrando
un color naranja-rojizo característico de la reacción.

i) Reacción de Pauly (características de la histidina)

A 1 mL de la solución de 1% del ácido sulfanilico en HCl al 5%, agregar 2 mL de la solución
de KNO2 al 0.5%. Agitar fuertemente la mezcla y añadir 2 mL de la solución de albumina
o aminoácido, agitar y añadir 6 mL de Na2CO3 al 10% mostrando un color rojo intenso.

35
 PRACTICA Nº 2: DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO

OBJETIVOS
- Determinar el punto isoeléctrico de la caseína y la gelatina.

PARTE TEORICA
Cuando las proteínas se calienten en medio básico o acido estos se hidrolizan para dar
aminoácidos. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos donde un átomo de hidrogeno ha
sido reemplazado por un grupo amino -NH2. Si el grupo amino está en el siguiente átomo
de carbono unido al acido carboxílico, se llama α-aa. El aminoácido más sencillo es la
glicina, que tiene dos átomos de hidrogeno, un grupo amino y un grupo carboxilo unido
al mismo átomo de carbono.

El grupo amino es suficientemente básico, que en solución acuosa el H del COOH se a

unido al grupo amino, dando como resultado un ión carboxilato R-COO- y un ion amonio
R-NH3+. Está molécula neutra se llama Zwitterion, ion de carga neta cero resultados de
una carga positiva y una carga negativa.

Zwitterion

Está forma Zwitterion de los aminoácidos da el carácter anfótero de los aminoácidos, es

decir, de su capacidad para actuar como ácidos o como bases y de su capacidad para
reaccionar con ácidos o con bases correspondientes. Las titulaciones potenciométricas
permiten el estudio de estos grupos con el objetivo de encontrar el mecanismo químico
de las proteínas como sistemas amortiguadores.

Cuando uno coloca la solución iónica de los aminoácidos en los electrodos, este crea una
diferencia de potencial y hay un desplazamiento del potencial si se le agrega un ácido o
una base, tal como se explica en los siguientes casos:

36
1. Al disolver una muestra solida de glicina en agua, el pH será neutro o cerca a la
neutralidad y no habrá desplazamiento hacia ningún electrodo.

2. Si agregamos acido a un Zwitterion, el H+ se une al -COO-, quedando la molécula

cargada positivamente y se dirige al cátodo.

3. Si añadimos base a un Zwitterion, capta el H+ del NH3+ y la molécula queda cargada

negativamente migrando al ánodo.

La disociación como acido y como base es diferente, y se van modificando según el

medio en que se encuentren, llegando el momento en que ambas cargas son iguales a
un determinado pH, a lo que se lo conoce como Punto isoeléctrico (pI).

El punto isoeléctrico se define como el pH en el cual el aminoácido se encuentra en su

carga cero y cuya solubilidad es la menor.

Carga +1 Carga 0 Carga -1

Migra al cátodo No migra Migra al ánodo

El pI puede calcularse a partir de la media de los valores de pKa del par de grupos
disociados.

𝑝𝐾1 + 𝑝𝐾2
𝑝𝐼 =
2

37
Cuando en un aminoácido hay varios valores de pKa, se toman los valores más cercanos
con la especie de carga cero. Por ejemplo, tenemos los valores de pKa del ácido
aspártico.

pK1= 1,9 pK2= 3,7 pK3=10

Carga +1 Carga 0 Carga -1 Carga -2

Entonces, su punto isoeléctrico será:

1.9 + 3.7
𝑝𝐼 = = 2.8
2

38
 MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
- Varillas de vidrio
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Pipetas 2, 5 y 10 mL,
- pH metro

Reactivos
- Soluciones de caseína y gelatina 1%
- Ácido acético al 0.01%, 0.1% y 1 %
- Acetato de sodio 0.1 M
- Alcohol etílico 96%
- Agua destilada

39
 PARTE EXPERIMENTAL

a) DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA

Se toman 8 tubos de ensayo, a cada uno se le agrega agua, CH3COOH y una solución
caseína según las proporciones indicadas en la tabla. El pI se determina por el máximo
grado de turbidez (pH 4,7).

Nº tubo Agua CH3COOH CH3COOH Sol. De caseína pH de la mezcla

(mL) 0,01 M, mL 0.1 M, mL al 1% en mL
1 8.4 0.6 - 1 5.9

2 7.8 1.3 - 1 5.6

3 8.8 - 0.3 1 5.3

4 8.5 - 0.5 1 5

5 8 - 1 1 4.7

6 7 - 2 1 4.4

7 5 - 4 1 4.1

8 1 - 8 1 3.8

b) DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA GELATINA

Se toman 6 tubos de ensayo, a cada uno se le agrega agua, CH3COOH y una solución
caseína en proporciones indicadas en la tabla. Agitar y agregar 2 mL de alcohol o
acetona. Después de 30 minutos de determinará el punto isoeléctrico, el cual se
determinará por el máximo grado de turbidez.

Nº Agua CH3COOH CH3COOH CH3COONa Sol. De pH de la

tubo (mL) 0,1 M, 1 M, mL 0.1 M, mL Geltaina al 1%, mezcla
mL mL
1 3.8 0.8 - 2 2 5.6
2 3.5 0.5 - 2 2 5.3
3 3 1 - 2 2 5
4 2 2 - 2 2 4.7
5 - 4 - 2 2 4.4
6 3.2 - 0.8 2 2 4.1

40
 PRACTICA N° 3: TITULACION POTENCIOMETRICA

OBJETIVOS
- Comparar la titulación potenciométrica de los sistemas buffer sobre el ácido
fosfórico (ácido poliprótico) y el aminoácido glicina.
- Determinar los valores de pKa y pI.

PARTE TEORICA
En la titulación potenciométrica de los aminoácidos nos podemos encontrar con tres
tipos de aminoácidos:

1. Un aminoácido que presente un monoamino monocarboxilo. En medio acuosa

presenta un pH cercano a la neutralidad. Al inicio de la titulación se obtendrá una
especie iónica positiva por la adición de una solución ácida de HCl 0.1 M. El siguiente
grafico de N° de moles añadidos de NaOH vs el pH en la formación de dos sistemas
amortiguadores de la glicina.

Gráfico de Curva de titulación de la glicina, que muestra la variación de pH de una solución de

glicina con NaOH 0.1 M y los valores de pK1 de 2,34, pK2 de 9,6 y por ende su pI es de 5,97.

41
2. Un aminoácido monoamino dicarboxílico, como por ejemplo, el ácido glutámico.
A la solución acuosa del ácido glutámico, a pesar de presentar pH acido, cuando se le
adicionar una solución básica, el pH disminuye tras obtener especies protónicas,
dando como resultado una curva con tres sistemas de amortiguadores, un sistema
amortiguador a pH básico y dos sistemas amortiguadores a pH ácido.
Estos corresponden a los dos grupos ácidos carboxílicos presentes en este
aminoácido.

Curva de titulación del ácido glutámico. Se muestra la variación del pH de una solución del
ácido glutámico con NaOH 0.1 M con tres sistemas de amortiguadores.

42
3. Un aminoácido diamino monocarboxilo, cuya especie protonada tiene una carga +2.
Cuando al aminoácido se le adiciona una solución ácida de HCl 0.1 M, la curva de
titulación nos muestra tres sistemas de amortiguadores, dos sistemas buffer a pH
ácido y un sistema buffer a pH básico.

Cabe señalar, que los pI de los aminoácidos muestran la naturaleza de los grupos
ionizables.

Gráfico de la curva de titulación de la histidina, que muestra tres sistemas buffer.

43
 MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
➢ Potenciómetro
➢ Bureta 50ml
➢ Pipetas graduadas y volumétricas
➢ Vasos de precipitación de 50, 100 y 150 ml.

Reactivos
➢ Hidróxido de sodio 1 M
➢ Ácido fosfórico 1 M
➢ Glicina 0.025 M
➢ Buffers de pH 4 y 7
➢ Agitador magnético y magneto
➢ Agua destilada

44
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Titulación potenciométrica del H3PO4 1 M

En un vaso de precipitado colocar 20 ml H3PO4 1 M y 20 ml de agua destilada. Colocar el
vaso en un agitador magnético con su magneto para homogenizar la solución. Con el
potenciómetro previamente calibrado, tome el pH inicial de esta solución.

De una bureta, dejar caer 1 ml de la solución de NaOH 1N suavemente, luego de un

tiempo de 30 segundos para la homogenización y volver a medir el pH. Agregar mL a
mL de NaOH, anotando el pH de la solución en cada caso.

Grafique los datos obtenidos en una hoja de papel milimetrado o en el Excel, el pH los
mL de NaOH 1N añadidos en cada caso. Unir los puntos y observar curva de titulación.
Identifique las especies iónicas que se forman y ubíquelas en el gráfico.

Además, en el gráfico identificar los rangos de pH de los distintos sistemas

amortiguadores, especificando las especies involucradas formadas durante la titulación.
Determinar los valores de pKa1, pKa2 y pKa3 y comparar los datos experimentales con
los teóricos.

b) Titulación potenciométrica de la glicina

Colocar 10 ml de glicina 0,025 M en un vaso de precipitado de 50 ml y añadir 10 ml de
agua destilada, colocarlo en un agitar magnético con un magneto y tomar el pH inicial
de la solución.

Agregar una solución de HCl 0,1 M suavemente y siempre con agitación constante y
disminuirla a un pH de 1,3, en este punto se ha obtenido la especie protónica más
positiva.

Con el electrodo sumergido en la solución, añadir NaOH 0,1 M desde una bureta ml a
ml, siempre en agitación constante. Espere un tiempo de 30 segundos hasta que se
estabilice la lectura del potenciómetro y anotar la lectura de pH. Continuar con el mismo
procedimiento anterior, anotando lectura por cada adición de 1ml de NaOH 0.1 M hasta
llegar a pH 12.

Graficar en papel milimetrado o en un Excel, el pH vs los ml de NaOH 1 N adicionados.

Unir los puntos ploteados y determinar en la gráfica: Las especies iónicas formadas y su
carga neta, el sistema de amortiguadores formados, cuántos y cuáles y el punto
isoeléctrico.

45
Valores teóricos de la glicina:

pKa1 pKa2 pl

2,4 9.8 6.1

Reacciones producidas de la disociación de la Glicina:

𝑝𝐾1+𝑝𝐾2
𝑝𝐼 = 2

46
 UNIDAD II: METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS

Ley de Fotometría
Para hacer los cálculos en fotometría es importante tener en cuentas las leyes de
Lambert y la ley de Beer.

Ley de Lambert:
Lambert dice que cuando un haz de luz monocromática de
intensidad “Io” incide o atraviesa sobre una solución coloreada,
parte de está radiación es absorbida transmitiéndose otra
intensidad “I1”, menor a la incidente. La diferencia de
intensidades del rayo emergente con el incidente es
proporcional a la longitud de la trayectoria recorrida por el haz. “Io- I1” α “l”

Ley de Beer:
Beer dice que cuando una luz monocromática de intensidad “I o”
incide o atraviesa sobre una solución coloreada, parte de está
radiación es absorbida transmitiéndose otra intensidad “I1”,
menor a la incidente. La diferencia de intensidades del rayo
emergente con el incidente es proporcional a la concentración
de la solución que lo atraviesa. “Io- I1” α “c”

La capacidad de absorción de la luz de un cuerpo es selectiva para un determinado grupo

de radiaciones dejando pasar otras. La selectividad está dado por seleccionar a los
electrones de la molécula que están en cierto nivel energéticos y pasarlos a orbitales
más externas que las que normalmente ocupan. Distintas longitudes de onda
proporcionan distinto nivel o cantidad de energía, luego, para excitar determinado
número de moléculas será necesario incidir determinada longitud de onda. A esta luz se
lo conoce como LUZ MONOCROMATICA, ósea luz de una solo longitud de onda.

Al relacionar los postulados de la Ley de Lambert y Beer:

Io- I1 = ε.l.c

𝐼𝑜
𝐿𝑜𝑔 = ε.l.c
𝐼1

Reemplazando:

A = ε.l.c

47
Donde:
A = absorbancia. Proporción de luz absorbida = Log (Io/I1).
I0 = Intensidad del rayo que incidente.
I1 = Intensidad del rayo emergente.
l = Longitud de la trayectoria del haz (cm)
ε = constante de proporcionalidad o absortividad.

La constante de proporcionalidad o absortividad (ε) depende de las unidades en que

estén expresada la concentración de la sustancia. Cuando la sustancia está expresada
en M (mol/L), la ε se llama absortividad molar.

La absorbancia, también es igual al Log (To/T1), lo que también se conoce como densidad
óptica o extinción, la cual es directamente proporcional a la concentración de la
sustancia e inversamente proporcional a la luz transmitida o transmitancia (T):

A = - Log T = 2- Log T(%)

El rango de absorbancia es de 2 a 0, mientras que el rango de transmitancia, que es

expresado en porcentaje, es de 100-0%. Los valores de transmitancia comprendidos de
20% y 70%, equivalente a valores de absorbancia de 0.7 y 0.16, respectivamente. Las
lecturas superiores a estos valores, tendrán un margen de error superior al 0.5%.

Desviación de la ley de Lambert & Beer

La ley de Lambert y Beer indica que existe una relación lineal entre la absorbancia y la
concentración de las sustancias, ya que los parámetros ε y l se mantienen constantes. A
mayor concentración, mayor es la absorbancia. Esto es aplicable dentro de ciertos
límites, fuera de ellos puede haber desviaciones para arriba o para abajo.

Gráfico de Absorbancia vs la longitud de onda, donde se muestra las desviación positiva y

negativa de la Ley de Lambert y Beer.

48
Estás desviaciones pueden ser químicas, policromáticas o radiaciones espúreas, tal
como se explican a continuación:

Por alteraciones químicas:

- Se trabaja a concentraciones superiores a las indicadas.
- Cuando la muestra reacciona con el solvente.
- Por cambio de pH del solvente.
- Por modificación de la temperatura.
- Reacciones ácido-base.
- Formación de complejos o polimerización.

Por radiación policromáticas:

- Cuando hay radiación policromática, usualmente hay un monocromador que
selecciona una longitud de onda.

Por radiación espúreas:

- Flexiones o partículas procedentes del monocromador y de los componentes
ópticos que llegan al detector sin pasar por la muestra.

Equipo de medición
Los equipos utilizados para la cuantificación de la luz absorbida son los colorímetros,
fotómetros y los espectrofotómetros.

La colorimetría es la medida de la concentración de una sustancia coloreada por

comparación con otra, es un método visual. La fotometría, es una medida comparativa
de intensidades luminosas mediante la atenuación variable de uno de los rayos o por
transformación de energía eléctrica. La espectrometría, que es una determinación
cualitativa y cuantitativa está en función de la longitud de onda.

49
Muchos métodos para el análisis cuantitativo de sustancias como la sangre, tejidos,
orina y otros materiales biológicos se basan en las sus soluciones coloreadas o la
transformación mediante reacciones químicos a ello. La intensidad de color puede
usarse como una mediad de la concentración de la sustancia.

Las partes de un espectrofotómetro son: La fuente luminosa, rejilla, el monocromador,

porta muestras, detector y amplificador.

Partes básicas de un espectrofotómetro típico.

Fuente luminosa: Las lámparas utilizadas son tubos de descarga de gases conteniendo
un determinado elemento en forma gaseosa o vapor. Por ejemplo, para el rango visible,
se usan las lámparas de filamento de Tungsteno o de Wolframio; mientras, que para el
rango del UV, se utilizan las lámparas de Hidrógeno y para el rango del IR, las lámparas
con filamento de Nerst.

Espejo colimador: Su función es reunir los haces luminosos y dirigirlos en bloque al

monocromador.

Monocromador: Su función es seleccionar un haz a una determinada longitud de onda

determinada, lo cual se hace manualmente.

En los fotocolorímetros, se utilizan filtros que son vidrios en color que solo dejan pasar
una fracción del espectro en los espectrofotómetros, mientras, que en el colorímetro
Beckam o Klett-Summnerson, se dispone de tres filtros para seleccionar el rango de
longitud de onda.

Porta muestras: Como porta muestras se usan normalmente cubetas o tubos de vidrio,
con las paredes lisas para evitar cualquier pérdida por difracción.

50
En el rango VISIBLE, se emplean cubetas de vidrio y en el UV, de cuarzo.

Se recomienda:
- Lavar bien las celdas con una mezcla crómica y luego se lava varias veces con agua
destilada, ya que cubetas sucias con grasa absorbente fuertemente en el UV.
- Al llenar la solución, tener cuidado de las burbujas de aire o partículas de polvo. Las
paredes exteriores se secan con un palo de lino limpio o papel suave.
- No tocar con las manos las paredes en la cual pasa el haz luminoso.
- Si la cubeta está húmeda y vas a medir, lavar con la solución a medir varias veces
previo a la lectura.
- Para secar la cubeta, se deja con la abertura hacia abajo sobre un trozo de papel de
filtro. Las cubetas no se deben secar en la estufa.
- Para el análisis de las muestras sólidas, primero deben disolverse y son liquidas deben
diluirse si su absorción es muy intensa.

Detector
La medida de la radiación que emerge después de atravesar la solución problema en el
rango visible se hace con fotoelementos o fotomultiplicadores.

La celda fotoeléctrica es un elemento que permite medir la intensidad de la energía

radiante. La corriente eléctrica generada es proporcional a la intensidad luminosa que
incide sobre su superficie activa.

Amplificador
La señal que sale del detector es ampliado por un sistema que se llama amplificador.

Escalas de medición
Los espectrofotómetros presentan dos escalas de medición: La Absorbancia o densidad
óptica que va de 0 a 2 y la escala de la Transmitancia que va de 0-100%.

Espectrofotómetro.

51
Operaciones básicas del espectrofotómetro
Usando el espectrofotómetro, puedes medir la absorbancia y transmitancia y
determinar la concentración de una sustancia, usando un STD conocido o un factor de
conversión.

Los pasos son los siguientes:

- Seleccionar el modo (A ó T)
- La longitud de onda
- Medir el blanco
- Medir las muestras

El término “blanco” se usa para calibrar el instrumento llevando al 100% de

transmitancia.

El blanco puede ser solvente puro, mezcla de solventes y puede ser incoloro o coloreado.
Se usará el blanco como agua destilada, siempre que la disolución de la muestra sea en
agua, teniendo cero de absorbancia. Si el color de una solución es el resultado de una
reacción química, el blanco debe ser todos los reactivos utilizados menos la muestra.

Debe tenerse en cuenta que la calibración se hace a una cierta , un cambio de  se

debe calibrar a 0 de absorbancia o 100% de transmitancia. Cabe señalar, que ambas
soluciones, el blanco y la muestra se analizan en las mismas condiciones de , intensidad
de luz y longitud de la celda, eliminando de esta manera todos los factores que
interfieren en la medida espectrofotométrica.

52
 PRACTICA Nº 4: ESPECTRO DE ABSORCIÓN- DETERMINACIÓN DE LA
LONGITUD DE ONDA OPTIMA

OBJETIVOS
- Determinar experimentalmente el  óptimo de absorción de una sustancia
coloreada.
- Preparación de curvas de calibración de soluciones coloreadas.

PARTE TEORICA:

1. Introducción
Todos los métodos ópticos, incluido la espectrofotometría, se basan en la interacción
entre la materia y energía luminosa, entendiéndose por esta última el espectro
completo de radiación espectromagnética.

La palabra fotometría deriva del latín “foto” que significa luz y “metria” que significa
medición, medición del espectro de luz. La luz o energía está compuesta por paquetes
de energía llamados fotones que se mueven ondulatoriamente:

Gráfico de las propiedades de una onda.

La Longitud de onda (λ), es la distancia entre las crestas de dos ondas de radiación
adyacente. La longitud de onda se mide generalmente en nm. El espectro
espectromagnético va desde 10-10 cm en los rayos X hasta 105 cm en el caso de las ondas

53
de radio. Las regiones del espectro electromagnético de mayor interés en la bioquímica
son:

➢ Región ultravioleta (UV) 10-7 a 10-6 cm (200-400 nm)

➢ Región visible (VIS) 4*10-6 a 10-4 cm (400-850 nm)
➢ Región infrarroja (IR) 8*10-3 a 3*10-2 cm (˃ 850 nm)

La Frecuencia (δ), es el número de oscilaciones por segundo. La energía (E) de una

radiación es proporcional a la frecuencia de esta.

E=hx …………………..(1)

Donde:
h = Factor de proporcionalidad o constante de Planck, equivale a 6.62 x 10 -34 J.s.
δ = Frecuencia. La frecuencia es inversamente proporcional a la longitud de onda de la
radiación.

=c/ ……………………(2)

c= velocidad de la luz en el vacío que equivale a 3 *1010 cm.s-1 y un poco más grande al
a pasar por sustancias transparentes.

Relacionando (2) en (1), se tiene:

Como h y c son constantes, la energía de una radiación es inversamente proporcional a

la longitud de una onda.

54
 Espectro electromagnético.

Todos los métodos ópticos se basan en cuatro tipos de interacción entre la luz y la
materia:

1. Absorción de luz por la materia.

2. Emisión de la luz por la materia.
3. Refracción de la luz por la materia.
4. Rotación de la luz linealmente polarizada por la materia.

En este capítulo vamos a ver la primera interacción descripta en la parte de arriba. Los
métodos espectrofotométricos cuantifican la cantidad de luz de determinada longitud
de onda que absorbe una solución. En el siguiente grafico muestro el espectro
electromagnético y sus características.

Espectro electromagnético.

55
En la espectrometría abarca está tres partes:

- Espectrometría visible de 400-700 nm.

- Espectrometría ultravioleta de 100-400 nm.
- Espectrometría infrarrojo:  700 nm

Espectro electromagnético, región amplificada del UV al IR.

Al interaccionar la materia con la energía puede suceder que o bien que las moléculas
comiencen a rotar, que los átomos de la molécula vibren con otros y que un electrón
de un átomo sea movido a un nivel de energía superior. El que suceda uno u otro tipo
de interacción depende de la intensidad de energía de la luz que incide sobre la
materia.

La energía de la radiación es mayor en los rayos X que en los rayos IR, la energía de las
microondas o del IR lejano son suficientes para provocar la rotación de una molécula,
pero para inducir a una vibraciones de un átomo se requiere la energía del IR medio.
Muchos de los análisis bioquímicos necesitan ser identificados y cuantificados mediante
técnicas colorimétricas.

El análisis espectrofotométrico, análisis cuantitativo, se basa en la medición de la

intensidad de la luz transmitida o absorbida por soluciones, ya sean coloreadas o
incoloras.

56
Cuando un rayo de luz en determinadas condiciones atraviesa un prisma de vidrio se
produce un fenómeno de dispersión y el rayo de luz que observamos homogéneo, se
descompone en una serie de radiaciones de distinta longitud de onda que van a
impresionar nuestra retina produciendo una apreciación de color.

Cada sustancia absorbe energía radiante, de una u otra longitud de onda, esto es
característica de todas las sustancias. Si la luz blanca atraviesa una solución conteniendo
un compuesto coloreado, algunas longitudes de onda serán absorbidas y otras
transmitidas. De esta interacción resulta el color.

Algunas sustancias pueden ser incoloras al ojo humano pero son capaces de absorber la
luz ultravioleta (400 nm) o luz IR (700 nm) y la cantidad de luz absorbida o
transmitida en estas regiones puede ser medido en un equipo llamado
espectrofotómetros que incluyan en el rango UV o IR.

El color que tiene una sustancia es por los colores complementarios, por ejemplo, la
hemoglobina tiene el color rojo, ya que absorbe los colores que lo complementan como
del verde y del azul, cuyas  que absorben son en el rango de 475-490 nm. Otro ejemplo
es una solución de sulfato de cobre es de color azul, tras el paso de una luz blanca
absorbe las radiaciones luminosas complementarias a está, en el rango de  de 490 y
700 nm que corresponden al verde y rojo, respectivamente y solo se transmiten las 
entre los 400-440 nm.

Gráfico que muestra la radiación UV, Visible e IR con sus respectivas longitudes de onda.

57
Espectro de absorción de una sustancia coloreada

Cada sustancia tiene una determinada luz monocromática donde se produce la mayor
absorción de la luz que incide sobre ella. La curva Absorbancia vs , nos muestra la
variación de la absorbancia en función del , esto es conocido como Espectro de
absorción, y el pico más alto representa la longitud de onda de máxima absorción o
max.
A (Absorbancia)

 (Longitud de onda en nm)

58
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
➢ Micropipeta de 200,1000 uL
➢ Tips de 200, 1000 uL
➢ Tubos de ensayo
➢ Vasos de precipitado
➢ Pipetas graduadas y volumétricas
➢ Gradillas
➢ Fiolas de 100 mL
➢ Pipetas de 10 mL
➢ Espectrofotómetro

REACTIVOS
➢ Solución estándar de anaranjado de metilo (NM)
➢ Solución estándar de azul de bromofenol (ABF)
➢ Agua destilada

59
 PARTE EXPERIMENTAL

a) DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DE UNA SUSTANCIA

COLOREADA
A partir de una solución stock de azul de bromofenol (ABF) de 10%, preparar una
solución de trabajo pipeteando 4 ml en una fiola de 100 ml y homogenizar.
Encender el espectrofotómetro, dejar calentar 5 minutos y proceder a calibrar el equipo
con agua destilada a una longitud de onda de 440 nm.
Colocar una alícuota de la solución de trabajo en la cubeta del espectrofotómetro,
enjuagando la misma con la solución a medir.
Hacer la lectura en unidades absorbancia en el espectrofotometro. Repetir la lectura de
la absorbancia de la misma solución con las longitudes de onda desde 400 a 700 nm,
variando cada 10 nm y anotando en cada caso su absorbancia.
Repita los pasos anteriores utilizando el colorante anaranjado de metilo (NM). A partir
de una solución stock de 10 % de concentración.
En ambos casos, graficar Absorbancia (Eje Y) vs Longitud de onda (Eje X), luego unir los
puntos y determinar la máx.

b) CURVA DE CALIBRACION DEL AZUL DE BROMO FENOL Y ANARANJADO DE

METILO
A partir de las soluciones de trabajo preparadas en la experiencia anterior arme una
batería de tubos de acuerdos a las indicaciones de la tabla 1.
Leer las lecturas de en transmitancia a fin de minimizar el error de lectura y transformar
a absorbancia.

60
 Nº de Tubo Blanco 1 2 3 4 5
Sol. trabajo
de ABF o NM _ 2 4 6 8 10
stock (mL)
H2O destilada
(Ml) 10 8 6 4 2 0
Absorbancia

Concentración
(mg/mL)
mg%

ug/mL

mg/L o ppm

Grafique Absorbancia vs Concentraciones y unir los puntos con línea recta. Determinar
la absorbancia de una muestra de ABF o NM de concentración desconocida. Ubique la
absorbancia el eje y de la curva de calibración de ABF o NM y proyecte una línea que
corte la recta la recta baja al eje X y determine gráficamente la concentración de las
muestra.

Y = mx + b
R2 =0.99

Muestra problema
Absorbancia

Concentración

61
 PRACTICA Nº 5: DETERMINACION DE LA CREATININA Y GLUCOSA

OBJETIVOS

- Determinar la creatinina y glucosa.

PARTE TEORICA
a) Determinación de la creatinina
La determinación de creatinina se basa en la reacción entre la creatinina con el ácido
pícrico en medio alcalino, denominado Reacción de Jaffé, el cual da el ácido picrámico
de color naranja-rojizo.

La intensidad de coloración es directamente proporcional al contenido de creatinina

cumpliendo con la Ley de Lambert-beer hasta 40 mg/L.

La creatina es un derivado de los aminoácidos arginina, glicinia y metionina. El cuerpo lo

sintetiza en el hígado, riñones, páncreas y también puede obtenerse de la dieta rica en
carne y pescado. La creatinina está presente en el musculo, cerebro, sangre.

Es eliminado diariamente en la orina en cantidades constantes en cada persona.

Estructura de la creatina.

La determinación de creatina en la sangre es la prueba más utilizada para observar el

funcionamiento del riñón. Los valores normales de creatina en el suero son 0.4-1.4
mg/dL.

Debido a que su concentración en la sangre no varía, es importante para diagnosticar

nefropatías e insuficiencia renal. Cabe señalar, que solo en el embarazo estás cantidades
disminuyen por el incremento de la función renal.

62
 Gráfico que muestras los riñones y su conexión con el sistema urinario.

El siguiente grafico muestra la síntesis de la creatinina:

63
Reacción previa a la cuantificación de creatinina
Para la cuantificación determinación de creatina y de otros compuestos de la sangre
total, se hace una precipitación de las proteínas ya que estas interfieren en las
reacciones químicas, es por ello que se realiza la desproteinización, con lo cual además
de remover las proteínas, se logra:

- Disminuir la turbidez.
- Evitar la formación de precipitados.
- Obtener soluciones límpidos que absorben cierta radiación y reflejan otras.

Este método se basa en agregar un ácido y hacer un cambio brusco en el pH, el cual es
conocido como. “Desproteinización de Folin-Wu”. El desproteinizante es el ácido
túngstico (H2WO4) obtenido mediante la siguiente reacción:

Na2WO4.2H2O + H2SO4 H2WO4 + Na2SO4

b) Determinación de la glucosa
La Glucosa, aldohexosa, es el principal hidrato de carbono y es la molécula más
absorbida en el organismo humano.

La glucosa no se excreta, esta pasa libremente al filtrado glomerular donde alcanza la

misma concentración de la sangre. La glucosa es reabsorbida por el epitelio tubular. De
esta forma, el riñón disminuye la acumulación excesiva de la glucosa. Si la cantidad de
glucosa alcanza los niveles entre 140-200 mg/100 mL de sangre se produce la glucosuria.

Hay diferentes métodos para determinar la glucosa, algunos de ellos se basan en la

reducción de los iones Cu2+ a Cu+1, es el caso de los métodos de Folin Wu y Nelson
Somogyi.

El método que vamos a utilizar en el laboratorio es el método de Nelson- Somogyi.

Método altamente reproducible, que determina azucares reductores presentes en
concentraciones bajas entre 20 -180 ug/mL.

Este método se basa en la oxidación de la glucosa por los iones Cu2+ en medio alcalino y
posteriormente se forma un complejo coloreado de color azul verdosa por la adición del
ácido molíbdico y arsenioso. La intensidad del color es proporcional al contenido de
glucosa en la muestra. Las muestras y las soluciones STD son leídas a 540 nm. El siguiente
grafico resume la reacción química:

64
 Reducción
Oxidación
Reducción

Oxidación

Gráfico muestra la reacción de Nelson- Somogyi.

Para este análisis se preparan dos reactivos. Uno es el Reactivo de Nelson, en donde el
molibdato de amonio reacciona con el ácido sulfúrico y arseniato de sodio dando un
producto complejo de ácido molibdoarsénico ó molibdoarsenato de amonio de color
amarillo.

24 H+ + 3 NH4+ + 12 MoO42- + AsO43- (NH4)3 As(Mo3O10)4 + 12 H2O

Complejo amarillo

El segundo reactivo que se debe preparar en el laboratorio es el Reactivo de Somogyie,

en el cual usa una serie de reactivos, uno de ellos es el carbonato de sodio que se
disuelve en agua:

Na2CO3 + H2O NaHCO3 + NaOH

Este bicarbonato de sodio se mezcla con el carbonato de sodio para formar una solución
buffer que impide el cambio de concentración de los iones hidronio, asegurando el pH
alcalino en que se produce la reacción química.

Además, el tartrato de sodio y potasio reacciona en medio alcalino con el sulfato de

cobre pentahidratado formado un complejo cupo tartárico:

Cu+2 + 2 OH-1 Cu(OH)2

Cu(OH)2 + OH-1 Cu(OH)3

65
 Formación del complejo cupo tartárico.

Este complejo cupo tartárico es de color intensamente azul, estable y no precipita con
los álcalis. Este complejo es capaz de oxidar a los aldehídos y no a las cetonas.

Cabe señalar que el sulfato de sodio puede reaccionar con el carbonato de sodio dando
hidrocarbonato azurita, insoluble en agua:

3 CuSO4 + 3 Na2CO3 + H2O 3 Na2SO4 + Cu(OH)2(CO3)2 ↓ + CO2 ↑

Primero preparamos los reactivos para luego mezclarlo con la muestra. En un tubo de
ensayo se coloca la muestra de glucosa y luego se agrega el reactivo de Somogyi,
oxidando el azúcar a un pH 9 y formando el ácido D-glucónico y oxido de cobre.

Reacción entre el reactivo de Somogyi y un carbohidrato.

La reacción se produce en caliente para formar el Cu2O e hidrato cuproso que oscila
entre los colores rojo y amarillo. La presencia del sulfato de sodio evita la absorción de
oxígeno en la solución y la disolución del óxido cuproso.

El Cu2O es un cuerpo sólido, cristalino de color rojo rubí, insoluble en agua, que en
ocasiones puede aparecer el color amarillo-anaranjado, dependiendo del tamaño de las
partículas. Una coloración verdosa, también es posible cuando hay un exceso de
reactivo. Los ácidos lo atacan en calor dando la sal de cobre:

Cu2O + H2SO4 H2O + CuSO4 + Cu

66
También puede pasar las siguientes reacciones con el cobre formado:

H2SO4 HSO4-1 + H+1

HSO4-1 H+1 + SO42-
Cu + 2 H+ + SO42- Cu+2 + SO42- + H2 ↑

Por esta razón a veces puede haber un desprendimientos del gas hidrógeno en la
reacción química.

Si la reacción química se lleva a cabo en calor, da un color negro, característico de la

siguiente reacción:

Cu3(OH)2(CO3) H+1 3 CuO + 2 CO2 ↑ + H2O

La glucosa se oxida a ácido aldónico o un ácido aldurónico.

Proceso de oxidación del carbohidrato.

Luego, el ácido sulfúrico reacciona con el D-gluconato de sodio para dar D- glucónico
que se lactoniza a su formas ϒ o δ, tal como se muestra en la siguiente reacción química:

67
 Reacción donde muestra que el D-gluconato de sodio se lactoniza a sus forma ϒ.

Entonces el molidboarsenato de amonio reacciona con el ácido aldónico, en este

ejemplo el ácido glucónico, para dar reducir este complejo amarillo a azul de molibdeno
y oxidando el ácido a una aldosa con un átomo de carbono menos que el inicial.

Reacción de oxidación entre el carbohidrato y el complejo molibdoarsénico.

La cantidad de azul de molibdeno formado y el porcentaje de sulfato de cobre que dejo

de reaccionar en el reactivo Somogyi son proporcionales a la concentración de los
azucares reductores en la muestra, lo cual se puede medir en el espectrofotómetro.

68
El arseniato de sodio, como dije anteriormente es un reactivo tóxico y escaso y en la
reacción química forma el complejo ácido molibdoarsénico y se puede reemplazar por
el fosfato y silicato para formar complejos amonio molibdafosfato y el ácido
molibdosilícico, respectivamente:

24 H+ + 3 NH4+ + 12 MoO42- + AsO43- (NH4)3 As(Mo3O10)4 + 12 H2O

Complejo de color amarillo

24 H+ + 3 NH4+ + 12 MoO42- + PO43- H3[P(Mo3O10)4] + 12 H2O

Complejo de color amarillo

24 H+ + 3 NH4+ + 12 MoO42- + SiO32- H4[Si(Mo3O10)4] + 11 H2O

Complejo de color amarillo

Obsérvese que en todos los métodos se produce el complejo molibdato y

posteriormente ser produce la reducción al complejo azul de molibdeno para leer su
absorbancia a una determinada longitud de onda.

Las lecturas se deben llevar a cabo en un espectrofotómetro, para medir la intensidad

de luz transmitida por una solución frente a un blanco, teniendo en cuenta la relación
entre el color transmitido y el absorbido. En una tabla muestro las λ en dependencia a
los colores absorbidos y trasmitidos y en la otra muestro las λ con respecto a las
muestras:

Color absorbido Color transmitido λ en nm

Violeta Amarillo verdoso 380-450

Azul Amarillo 450-480

Verde azulado Naranja 480-490

Azul verdoso Rojo 490-500

Verde Púrpura a rojo violeta 500-570

Amarillo Azul 270-590

Naranja Verde azulado 590-620

Rojo Azul verdoso 620-780

Cuadro que muestra un rango de longitudes de onda y sus respectivos colores absorbidos y
transmitidos.

69
 Sustancia analizada por λ en nm Referencia
Somogyi-Nelson
Glucosa y azucares reductores 520 Ros et. al.

Oligogalacturonatos 500 Collmer et. al.

Glucosa 540 Hawk et. al.

Azúcares reductores 610 Castellanos

Azucares reductores 660 Fisher

Otros iones:

Fosfatos 885 Gutiérrez

Fosfatos 700 Merck

Silicatos 810 Gutiérrez

Silicatos 820 Merck

Cuadro que muestra las sustancias analizadas por la reacción Somogyi-Nelson y sus longitudes
de onda.

Cabe señalar, que si se hiciera el cambio de reactivo del arseniato, se tendrá que tomar
en cuenta la estabilidad de color del complejo formado en cada caso, la temperatura, el
pH, así como el almacenamiento y la preservación de los reactivos.

Otros métodos utilizan la relación entre un cromógeno y la glucosa y además eliminan

sustancias interferentes. Esto se da en el método Dubowski o de la o-toluidina. También
hay los métodos enzimáticos como el de la glucosa oxidasa o el de la hexoquinosas, que
son considerados los más exactos.

A nivel sanguíneo la glucosa se mantiene dentro de un rango de 80-110%, gracias a la

acción de diversas hormonas como la insulina y el glucagón. Cuando los valores son por
encima o debajo de este rango es porque hay una alteración en el metabolismo de los
carbohidratos, por ejemplo, valores por encima de 120%, nos producen diabetes.

70
METODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA CREATININA Y LA GLUCOSA

Hay una relación de proporcionalidad entre la coloración de una sustancia y la

concentración tal como dice la Ley de Lambert-Beer. Así, a mayor concentración, mayor
absorbancia.

Para los compuestos coloreados se emplean dos métodos para medir en el

Espectrofotómetro:

- Método del “Factor de calibración”

- Método gráfico, empleando curvas de calibración

METODO DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN:

El factor de calibración (Fc) es un término que relaciona la concentración de una

sustancia con su absorbancia:

𝐶𝑠𝑡
𝐹𝑐 =
𝐴𝑠𝑡

Donde:
Cst: Concentración de la solución estándar (STD)
Ast: Absorbancia de la solución estándar (STD)

Con el factor de calibración, se puede fácilmente determinar la concentración de una

muestra (Cm) si se conoce su absorbancia:

Cm = Fc x Am

Si se preparan dos soluciones de una misma sustancia a concentraciones diferentes y se

miden sus absorbancias a una λ, espesor de cubeta, la relación de sus concentraciones
y absorbancias será:

A1 = ε.l.c1 y A2 = ε.l.c2

Como ε y l son constantes y se trata de la misma sustancia, se puede dividir ambas

ecuaciones:

71
 𝐴1 𝐶1
=
𝐴2 𝐶2

Si consideramos que A1 y C1 corresponde a una solución STD conocida y que A2 y C2

corresponden a una concentración de una muestra desconocida, tendremos:

𝐴1 𝐶1
=
𝐴𝑚 𝐶𝑚
Depejando Cm, se obtiene:

𝐶𝑠𝑡
𝐶𝑚 = ∗ 𝐴𝑚
𝐴𝑠𝑡

En esta última relación podemos observar que la Cst/Ast es el Factor de calibración.

Cm = Fc x Am

Esta fórmula expuesta solo cumple para aquellas muestras que cumplan la Ley de Beer,
es decir, que haya una relación lineal entre la absorbancia y la concentración. Esto se
hace corroborando a través de una curva patrón.

Cuando se trabaja con líquidos biológicos, por ejemplo, sangre, orina, suero, etc., para
calcular el contenido por 100 mL o 1000 mL, el resultado obtenido se lo multiplica por
su dilución.

Este Factor de dilución (Fd) es la relación entre la cantidad de muestra usada y el

volumen tomado como base. Por ejemplo, para expresar el contenido en 100 mL de
sangre, se multiplicará por 100/V, donde V corresponde al volumen de muestra utilizado
para el análisis.

A veces se requiere hallar este Fd usando varios patrones y se toma el promedio de sus
valores, denominado “Fd prom.”, que se utilizará para hallar la concentración de la
muestra:

Cm = Fd prom. x A

72
Cabe señalar, que este valor es diferente para cada procedimiento colorimétrico y que
la muestra se trabaje en las mismas condiciones en que se determinó el Fc.

Si se cambia de condiciones, como el cambio de reactivos, nuevos equipos, etc., se

deberá hallar un nuevo factor de calibración.

METODO DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Este método se basa en preparar una serie de soluciones patrones a diferentes
concentraciones y a cada uno de estos medir su absorbancia. Hacer una gráfica
ploteando la Absorbancia vs la concentración, mínimo de 3 puntos. La ecuación de la
recta es:

Y = mx + b
Donde:

Y = Variable de la Absorbancia.
X = Variable de la concentración.
b = Intercepto con el eje X
m = pendiente

Seguidamente, medir la absorbancia de la muestra problema y tal como lo muestra el

grafica plotear y obtener la concentración de la muestra.

Y = mx + b
R2 =0.99

Muestra problema
Absorbancia

Concentración

73
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
- Espectrofotómetro en el rango visible
- Tubos de ensayo de 50 mL
- Pipetas graduadas y volumétricas de diferentes tamaños
- Papel de filtro
- Baño maría

REACTIVOS
- Oxalato de sodio en cristales
- Ácido sulfúrico 2/3N
- Tungstato de sodio al 10%
- Acido pícrico 1.5% (w/v)
- Solución de picrato alcalino. Se debe preparar en el momento de la determinación
usando una solución saturada de ácido pícrico en NaOH al 10% en proporción 1:1.
- NaOH al 10%
- HCl 0.1 M
- Solución stock de creatinina: disolver 100 mg de creatinina pura en 100 mL de HCl 0.1
M.
- Solución STD: En fiola de 100 mL, colocar 0.6 mL de solución stock, 2mL de HCl 50% y
enrasar con agua destilada.

- Reactivo de Somogyi:
Sol. A: 4 g de sulfato de cobre, 36 g de sulfato de sodio en 200 mL de agua.
Sol. B: 12 g de tartrato de Na y K, 24 g de carbonato de sodio, 16 g de bicarbonato de
sodio, 14.4 g de sulfato de sodio en 800 mL de agua.

En un tubo colocar: 2 mL de la solución A + 8 mL de solución B. Está solución debe

prepararse en el momento, tapar y mezclar.

- Reactivo de Nelson:
Sol. A: 25 g de molibdato de amonio tetrahidratado, 450 mL agua y 21 mL de ácido
sulfúrico concentrado y mezclar.
Sol. B: 3 g de arseniato de sodio heptahidratado, 250 mL de agua.

Mezclar ambas soluciones, colocar en baño maría a 37 °C durante 48 h, conversar en

un lugar oscuro.

74
- Anticoagulante oxalatado
1.2 g de oxalato de amonio, 0.8 g de oxalato de potasio, 100 mL de agua. Disolver,
homogenizar y agitar.
Tomar una alícuotas de 5 mL y colocar en la estufa a una temperatura entre 37-40 ºC
para evaporar.

- Sangre anticoagulante (oxalato de amonio). En los viales preparados colocar la

sangre recién extraída agregando por las paredes para evitar la hemolisis, mezclar
por rotación sobre la superficie plana.

- Solución stock de glucosa: 1 g de glucosa anhidra, agregar 0.25 mL de ácido benzoico

y 100 mL de agua destilada.

- Solución STD de glucosa: 1 mL de la sol. Stock de glucosa, llevar a 100 mL con agua
destilada.

75
 PARTE EXPERIMENTAL

a) DETERMINACION DE LA CREATININA

a.1) Precipitación de las proteínas

En un tubo de ensayo de 50 mL de capacidad, colocar 7 mL de agua destilada, 1 mL de
sangre oxalatada (con anticoagulante), 1 mL de tungstato de sodio al 10%, y 1 mL de
ácido sulfúrico 2/3N. Agitar en cada caso. Observar la precipitación de la sangre por la
coloración de un precipitado de color marrón, filtrar con un papel de filtro. Reservar el
líquido filtrado como muestra clarificada.

a.2) Determinación de la cantidad de creatina usando la reacción de JAFFE

Prepara tres tubos de ensayo con las cantidad descriptas en el siguiente cuadro:

Nº tubo Blanco STD Muestra

Sol. STD creatinina - 3 -

Muestra filtrada - - 3

Agua 3 - -

Sol. Picrato 1:1 1.5 1.5 1.5

Mezclar y dejar en reposo durante 10 min, luego leer en el espectrofotómetro a 520

nm. Determinar la concentración de creatinina en la muestra de sangre en mg/dL.

b) DETERMINACION DE GLUCOSA
b.1) Precipitación de proteínas
En un tubo de 50 mL, colocar 15 mL de agua destilada, 1 mL de sangre con
anticoagulante (muestra problema), 2 mL de hidróxido de bario 0.3 M y 2 mL de la
solución de sulfato de zinc.
Agitar bien después de cada adición, reposar 10 min. Observar la precipitación de
proteínas, filtrar y reservar como muestra clarificada.
Está desproteinización se fundamente en el uso de los metales pesado como el Zn.

76
b.2) Preparación de la curva de calibración y determinación de la cantidad de
glucosa
Preparar la siguientes tubos de ensayo según las cantidades descriptas en la siguiente
tabla:

Reactivo Blanco 1 2 3 4 Muestra

problema
STD Glc (mL) - 0.4 0.6 0.8 1 -

Agua (mL) 1 0.6 0.4 0.2 - -

Muestra (mL) - - - - - 1

Reactivo Somogy (mL) 1 1 1 1 1 1

Colocar en baño maría por diez minutos y enfriar

Reactivo Nelson (mL) 1 1 1 1 1 1

Agua (mL) 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5

Homogenizar y leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm,

usando como BK (Blanco) el agua.

Con los resultados obtenidos completar el siguiente cuadro:

Tubo Blanco 1 2 3 4 Muestra

problema
A

[]%

Determinar la concentración de glucosa por el método de la curva de calibración.

77
 PRACTICA Nº 6: DETERMINACION DE GLUCOGENO HEPATICO

OBJETIVOS:
- Cuantificar el glucógeno hepático utilizando el método de la antrona.

FUNDAMENTO TEORICO:
El glucógeno es un carbohidrato, es un polímero formado por unidades de D-(+)-Glucosa
unidos por enlaces α (1→4) y cada 12 a 18 unidades presenta un punto de ramificación
con enlaces α (1→6) formando una estructura bien ramificada.

Estructura de una parte de la molécula del glucógeno.

Un polímero de glucógeno puede contener más de 120 000 monómero de glucosa. Las
ramificaciones le dan una mayor solubilidad y, las ramificaciones tienen una gran
cantidad de residuos de glucosa no reductores, los cuales interaccionan con las enzimas
glucógeno sintasa y glucógeno fosforilasa para acelerar la velocidad de síntesis como la
degradación del glucógeno.
El glucógeno, es la fuente de reserva de glucosa más importante que tenemos, se
encuentra principalmente en el hígado (como máximo un 10% en peso) y en el musculo
(como máximo del 1 al 2% en peso) de los animales.

78
 Gráfico que muestra el transporte de la glucosa por el musculo, la sangre y el hígado.

Luego de la ingesta de los alimentos ricos en carbohidratos, la concentración de glucosa

sanguínea aumenta, favoreciendo la liberación de la insulina en el páncreas y con ello la
síntesis del glucógeno (glucogénesis o glucogenogénesis), el cual es almacenado en el
citosol de las células del tejido hepático y muscular como se ya se mencionó.
La glucogénesis requiere la activación de la glucosa, siendo esta transformada en
glucosa-6-fosfato por la enzima hexocinasa en el tejido muscular o por la glucocinasa en
el tejido hepático.
Luego, la fosfoglucomutasa cataliza la conversión reversible de la glucosa-6-fosfato a
glucosa-1-fosfato. La glucosa-1-fosfato en presencia de UTP genera la UDP-glucosa en
una reacción catalizada por la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa.
Seguidamente, la enzima glucógeno sintetasa cataliza la transferencia del grupo
glucosilo de la UDP-glucosa a los extremos no reductores del glucógeno y finalmente la
enzima ramificante amilo-α-1,4 → 1,6 glucosil transferasa origina los enlaces α(1→6)
creando las ramificaciones del polímero.

79
La glucogénesis se resume en el siguiente gráfico:

Grafico que muestra todo el proceso de la glucogénesis.

80
La degradación del glucógeno o glucogenólisis se presenta cuando la concentración de
glucosa sanguínea disminuye como consecuencia de una disminución o ausencia de
alimentos o cuando el organismo tiene una actividad física prolongada.
La glucogenólisis es la degradación del glucógeno en unidades básicas de glucosa que
pasan a la sangre para mantener sus niveles normales.
El siguiente grafico resume este proceso.

Procesos que muestran la glucogenólisis.

La regulación del metabolismo del glucógeno está influenciada por un equilibrio entre
las enzimas que participan en la glucogénesis o glucogenogénesis y en la glucogenólisis,
las cuales están bajo el control de las hormonas insulina y glucagón o adrenalina,
respectivamente.

81
Determinación del glucógeno hepatico
El glucógeno es extraído del tejido hepático, muscular o tisular con KOH al 30% en
caliente. Con este proceso las proteínas y los lípidos complejos son hidrolizados pero no
el glucógeno.
Luego se lo precipita con etanol y es separado por centrifugación.
El glucógeno se hidrolizar para formar derivados furfurales, que reaccionan con la
antrona para producir un complejo de color azul verdoso midiendo su absorbancia en
un espectrofotómetro a una  de 620 nm.

82
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
- Homogenizador
- Centrifuga
- Fiolas de 10 mL
- Pipetas gradas y volumétricas de diferente tamaños
- Baño maría
- Tubos de ensayos

REACTIVOS
- Hígado
- Hidróxido de potasio al 30%
- Alcohol etílico 95%
- Sol. de antrona al 0.2% en ácido sulfúrico QP.
- Sol. STD de glucosa al 5%.

83
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Extracción del glucógeno

Colocar 0.5 g de hígado en un tubo de ensayo, añadir 1 mL de KOH al 30%, triturar y
homogenizar. Luego, hervir en un baño maría por 30 minutos, agitando
constantemente.

Enfriar el tubo con un chorro de agua, agregar 3 mL de agua destilada y trasvasar a un

tubo de centrifuga, agregar 5 mL de etanol al 95%. Observar la formación de un
precipitado de glucosa. Centrifugar a 5000 rpm por 5 min. Descartar el sobrenadante.

Disolver el precipitado de glucosa poco a poco con agua destilada e ir trasvasando a una
fiola de 10 mL, enrasar. Esta es nuestra muestra problema.

b) Determinación de la cantidad de glucógeno con el reactivo de la antrona

Determinar la cantidad de glucógeno usando el reactivo de la antrona. Armar el siguiente
sistema de tubos tal como se explica en el cuadro:

Tubos
Reactivos en mL
Blanco STD Muestra
(mL) (mL) (mL)
Solución STD Glc 5% - 0.25 -

agua 0.25 - -

Muestra problema - - 0.25

Colocar en baño maría con hielo durante 5 min y añadir gota a gota el reactivo
de antrona.

Reactivo de antrona 1.5 1.5 1.5

Colocar los tubos en baño maría hirviendo por 10 min, enfriar y leer en un
espectrofotómetro a 620 nm.

84
Con los datos obtenidos, completar el siguiente cuadro:

Blanco STD Muestra

Absorbancia

Calcular el contenido de glucógeno en el hígado y expresar en % multiplicando por el

factor 0.9. Este factor viene de la división de glucosa en forma de glucógeno (162 g/mol)
entre el peso molecular de la glucosa (180 g/mol).
El peso molecular de la glucosa en forma de glucógeno se obtiene restándole al peso
molecular de la glucosa, el peso del agua de 18 g/mol que se elimina durante la
formación del enlace glucosídico.

85
 CAPITULO III: ACTIVIDAD ENZIMATICA

Las enzimas son proteínas del tipo globular, solubles en el líquido de la célula o están
adheridas a la superficie de las estructuras membranosas en el interior de la misma,
catalizando diferentes reacciones químicas en la célula.
Las enzimas catalizan la velocidad de la reacción química en un rango entre 10 12 a 1020
veces más que las reacciones no catalizadas a 37 ºC. Cabe señalar, que los catalizadores
inorgánicos tienen menor eficacia que las enzimas. Por ejemplo, en la reducción del
peróxido de hidrogeno catalizada por la catalasa, la enzima que contiene al átomo de
hierro es 10 millones de veces más rápido que catalizado con el platino coloidal a la
misma temperatura de 37 ºC.
Otra de las características de las enzimas, es que pueden transformar 10 000 a 1 000
000 de moléculas de sustrato por minuto.
Las enzimas presentan especificidad, lo cual es una de las diferencias más notorias con
respecto a los catalizadores no biológicos. Algunos tipos de especificidad de las enzimas
son:

a. Especificidad absoluta.- Esto pasa cuando la enzima se une a un solo sustrato y/o
cataliza una sola reacción. La mayoría de las enzimas tienen este tipo de
especificidad. Por ejemplo, cuando una enzima se una a la glucosa y no al resto de
aldosas.

b. Especificidad del grupo.- Esto se da cuando la enzima es específica para un

determinado enlace químico unido a un grupo específico. Por ejemplo, la tripsina es
una enzima específica para los enlaces peptídicos ubicados en el extremo carboxilo
de la arginina y la lisina.

c. Especificidad estereoquímica.- Muchas enzimas muestran selectividad por un

isómero específico. Por ejemplo, la enzima D-láctico deshidrogenada interacciona
específicamente sobre el isómero D-ácido láctico.

86
Mecanismo de acción de las enzimas
Las enzimas disminuyen la Energía de activación (Ea) necesaria para que las moléculas
interaccionen más rápido. Al reaccionar forman un complejo intermedio E-S (Enzima-
Sustrato), el cual requiere una menor Ea y por ende, hay un aumento en la velocidad de
reacción química.

Gráfico de las Ea en una reacción química con/sin enzima.

Métodos enzimáticos
Los métodos enzimáticos se usan ampliamente en el análisis bioquímico debido a su
sencillez, velocidad y especificidad del método.
Estos métodos nos permiten:
1. Una determinación más rápida y eficiente de números compuestos en alimentos,
tejidos o fluidos biológico como la sangre, orina que los métodos químicos. Por
ejemplo, la determinación de la urea en alimentos o fluidos utilizando la ureasa. La
hidrolisis convierte la urea en amoniaco y CO2. El amoniaco resultante reacciona con
un sustancia cromóforos que produce una intensidad de color proporcional al de la
urea que es medido en un espectrofotómetro.

2. Las enzimas se usan en la preparación de ciertos productos para mejor su rapidez de

elaboración. Por ejemplo, la α y el β-amilasas se usan para mejorar el valor del pan
de las harinas, debido a que hidrolizan el almidón y hacen más disponibles a la glucosa
y a maltosa fermentable, desprendimiento CO2 y por ende aumentando su volumen
y textura del pan, haciendo la miga más fina.

87
 Otro ejemplo, es la utilización de la lactasa que degrada la lactosa en glucosa y
galactosa usándose en la elaboración de helados de leche y crema. También se utiliza
lactosa en la elaboración de leche deslactosada para las personas que tienen una
intolerancia a la lactosa por su déficit de lactasa intestinal.

3. Medir la actividad enzimática en alimentos, tejidos y fluidos biológicos. Las enzimas

se encuentran en estos sustratos en cantidades pequeñas, lo cual hace difícil expresar
su concentración, es por ello que se utiliza la actividad catalítica de la enzima, es decir,
su velocidad de reacción catalizada como una medida indirecta de su concentración
en una muestra. La cantidad de la enzima está en relación directa con su poder
catalítico. Por ejemplo, la enzima alanina amino transferasa está presente en el
plasma a una concentración <1 mg/L, mientras que la concentración de proteínas del
plasma es de aproximadamente de 70 g/L, valor tan alto, que su extracción,
purificación y determinación es muy tedioso. En estas circunstancias, la velocidad
medida es proporciona a la cantidad de enzima presente.

Medición de la actividad enzimática

La actividad enzimática se puede medir por cambios en la concentración de un sustrato
de un producto, es decir, por la disminución en la cantidad del sustrato o por la aparición
de la cantidad de un producto en un cierto tiempo. Para esto, es necesario conocer las
siguientes características de la enzima:
➢ La estequiometria de la reacción catalizada.
➢ Requerimiento de cofactores.
➢ Km.
➢ La temperatura óptima y el pH óptimo de la actividad enzimática.

Las enzimas se usan en un pH óptimo y con una concentración del sustrato por encima
del nivel de saturación, que es 10 veces el valor de Km, de tal manera que la velocidad
inicial de la reacción es de orden cero. En estas condiciones, la velocidad inicial de la
reacción solamente es proporcional a la concentración de la enzima.
En el caso de que las enzimas necesitan de cofactores como los iones metálicos o
coenzimas, deben añadirse en concentraciones superiores a las de saturación de modo
que el verdadero factor limitante de la velocidad del sistema sea la concentración de la
enzima.
La Unión Internacional de Bioquímica (UIB) definió como Unidad Internacional de
actividad enzimática a la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de
producto/min en condiciones específicas de tiempo, temperatura, pH y concentracion
de sustrato.

88
La UIB ha recomendado una nueva unidad para expresar la actividad enzimática el Katal
(1 Kat = 1 mol/seg). La actividad enzimática en tejidos se expresa como la unidad por
peso de tejidos, proteínas, DNA o número de células; mientras, que la actividad
enzimática en suero se expresa en unidades por litro.

Factores que afectan la actividad enzimática

pH.- El pH de la reacción se mantiene por los sistemas buffer. Es importante que el
buffer tenga un pH cercano al pH óptimo de la reacción. No se debe utilizar un buffer
que sea una unidad mayor o menor al pH óptimo, ya que tendría eficiencia baja. Cabe
señalar, que una ligera modificación del pH puede afectar la actividad de la enzima.

Temperatura.- Los cambios de temperatura de incubación pueden alterar la velocidad

de reacción aumentándola hasta un cierto rango y dependiendo el tiempo puede llegar
a desnaturalizar la proteína. Normalmente los ensayos se llevan a cabo a entre
temperaturas que van de 22 a 37 ºC. Cabe señalar, que una mayor temperatura, mayor
velocidad de reacción.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción.

Activadores o inhibidores.- Se debe tomar en cuenta la presencia de activadores e

inhibidores en las reacciones enzimáticas. Por ejemplo, la α- amilasas necesita iones Ca2+
y la presencia de un agente quelante como el EDTA (etilendiaminotetraacetico), el cual
los acomplejará inhibiendo su interacción con la enzima y por ende disminuyendo su
actividad enzimática.

89
Aplicaciones
La actividad enzimática se usa como un indicador del estado y conservación de un
alimento. Estas medidas enzimáticas pueden ser útiles durante el tratamiento,
almacenamiento y proceso de maduración en alimentos. Por ejemplo:
➢ En el control de tratamientos tecnológicos de alimentos sometidos a altas o bajas
temperaturas como por ejemplo medición de actividad enzimática de fosfatasa,
peroxidasa y aldehído reductasa que se utilizan para control de pasteurización y
esterilización de la leche.

➢ Evaluar las peroxidasas en frutas es útil para evaluar la eficiencia relativa de

procesos de enlatados ya que a menos que estas sean destruidas continuaran su
función en el recipiente causando coloración.

➢ Se puede utilizar actividad enzimática de catalasa en branquias y succinato

deshidrogenasa en tejidos como indicador del grado de frescura de pescados.

Otro campo amplio de aplicación de la actividad enzimática es en los diagnósticos

clínicos. Cada órgano tiene una función específica y enzimas únicas para cada función.
El daño del tejido, por ejemplo hipoxia o inflamación, permite a las enzimas solubles
escapar a los fluidos como el suero, fluido cerebral. La medida de su actividad en tales
fluidos se utiliza para diagnóstico de diversos tratamientos en humanos y en animales.
Para que una enzima sea de valor en diagnóstico clínico debe ser fácilmente medible y
además reflejar cambios patológicos en un tejido especifico, órgano o grupo de órganos.
El plasma es la muestra más común para enzimología clínica, pero la orina, fluido
gástrico e intestinal también contienen enzimas de valor clínico.
Existen enzimas plasmáticas que no llevan a cabo una función conocida en la sangre.
Frecuentemente se encuentran en concentraciones varios miles de veces menores en
los tejidos, de manera que su presencia en el plasma en valores mayores que los
normales sugieren destrucción por lo tanto salida de enzimas del tejido al plasma. Por
ejemplo, una actividad elevada de lipasa o amilasa pancreática en suero seria la
determinación más específica para un caso de pancreatitis en humanos. Ciertas
transaminasas pancreáticas pueden indicarnos daño en el tejido hepático, por ejemplo
alaninaaminotransferasas. La γ-glutamil transferasa que presente elevada actividad en
plasma puede provocar una hepatitis aguda infecciosa o crónica y cirrosis hepática.

90
 PRACTICA Nº 7: DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS Y COLESTEROL
TOTAL

OBJETIVOS:
- Calcular la concentración de triglicéridos y colesterol total en la muestra de suero o
plasma.

PARTE TEORICA:
a) TRIGLICERIDOS
Los triglicéridos (TG, triacilglicerol, TAG, triacilglicerido) es un éster derivado de glicerol
y tres ácidos grasos. Los TAG son lípidos que se absorben de la dieta y son producidos
por el organismo a partir de los carbohidratos.
Su evaluación es importante para el diagnóstico de las hiperlipidemias ya sean de origen
genético o secundario a otras enfermedades. Valores elevados también aumentan el
riesgo de arteriosclerosis y de enfermedad coronaria.

Estructura del TAG.

Para su cuantificación, los TAG son hidrolizados por una lipasa específica liberando
ácidos grasos y glicerol. El glicerol es fosforilado por la enzima gliceroquinasa (GK) y
posteriormente, el glicero-3-fosfato es oxidado a dihidroxiacetona fosfato por la enzima
glicerol-fosfato-oxidasa (GPO), generándose peróxido de hidrogeno.
Posteriormente, el peróxido de hidrogeno reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y el
ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibencensulfonico (DCBS) en presencia de la enzima peroxidasa
(POD), para producir un compuesto coloreado cuya cantidad es proporcional a la
concentración de TAG presentes en la muestra. Esta solución se mide a una λ de 520
nm.

91
 Triglicéridos lipasa Glicerol + ácidos grasos

Glicerol + ATP GK Glicerol-3-fosfato + ADP

Glicerol-3-fosfato + O2 GPO Dihidroxiacetonafosfato + H2O2

2 H2O2 + 4-AAP + DCBS POD Compuesto coloreado + 4 H2O

Cálculo de la cantidad de triglicéridos:

Triglicéridos (mg/dL) = 200 x (Absorbancia muestra / Absorbancia STD)

b) COLESTEROL TOTAL
El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis y tejido cerebral. Es precursor de
los ácidos biliares, esteroides, y vitamina D.

Estructura química del colesterol.

Su determinación también contribuye al diagnóstico de las dislipidemias. El colesterol

se determina por acción de las enzimas colesterol éster hidrolasa y colesterol oxidasa.
La primera enzima libera el colesterol de los esteres de colesterol, y la segunda oxida el
colesterol libre produciéndose peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de la enzima
peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico produciendo un compuesto coloreado
que absorbe a una longitud de onda de 505 nm.

Colesterol éster CEH Colesterol + ácidos grasos

Colesterol + O2 CHOD Colesterol-4-en-3-ona + H2O2
2 H2O2 + 4 AAP + p-HBA PAP Compuesto coloreado + 4 H2O

92
No todo el colesterol es malo para el cuerpo. Hay dos tipos de colesterol, el HDL que son
las lipoproteínas de alta densidad y las LDL que son las lipoproteínas de baja densidad.
El HDL está presente en la sangre, ayuda al transporte de colesterol y triglicéridos en el
hígado para su excreción o reutilización. Además, el HDL previene de enfermedades
cardiovasculares mediante la prevención de la obstrucción de las arterias; mientras, que
el LDL, que también está presente en la sangre, si está presente en grandes cantidades
puede causar problemas a la salud, ya que tiende a acumularse en las arterias y causar
bloqueos. Estos pueden producir arterioesclerosis.
Los intervalos recomendados son:

Parámetro Óptimo (mg/dL) Alto (mg/dL) Muy alto

(mg/dL)
HDL-colesterol entre 40 y 60  60 es beneficioso

LDL-colesterol  100 Entre 100 y 189  190

VLDL-colesterol entre 2 y 30  30 es perjudicial

Colesterol total  200 Entre 200 y 240  240

Triglicéridos  150 Entre 150 a 499  500

Cálculos:

Colesterol (mg/dL) = 200 x (Amuestra / ASTD)

HDL-colesterol = Amuestra x 320

LDL-colesterol = Colesterol total – (Triglicéridos/5) – HDL-colesterol

93
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:
- Espectrofotómetros y celdas
- Cronómetro
- Pipetas y propipetas
- Tubos de ensayo
- Gradillas

REACTIVOS:
Reactivos deben estar entre 2 a 8 ºC, protegidos de la luz.
- Composición del reactivo para la determinación de triglicéridos (Reactivo 1):
Buffer Pipes pH 7.2 50 mM
Lipasa (microbiol) › 1000 U/L
Gliceroquinasa › 500 U/L
Glicero-3-fosfato oxidasa › 2000 U/L
Peroxidasa › 1000 U/L
4-amino antipirina 1 mM
Acido 3,5-dicloro-2-hidroxibencensulfonico 1.5 mM
Adenosín trifosfato (ATP) 0.5 mM
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.

- Composición del reactivo para la determinación de colesterol total (Reactivo 2):

Buffer Fosfato a pH 7.2 100 mM
Colesterol éster hidrolasa › 150 U/L
Colesterol oxidasa (recombinante) › 100 U/L
Peroxidasa › 1000 U/L
4-Amino antipirina 0.4 mM
Acido p-hidroxibenzoico 10 mM
Azida sódico 0.1 g/dL
Estabilizantes y preservantes no reactivos c.s.

- Solución STD de triglicéridos y colesterol total:

Glicerol en solución estabilizada equivalente a 200 mg/dL de triglicéridos y de
colesterol total.

94
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Preparación de la muestra para ambas determinaciones

Utilizar suero o plasma (heparina o EDTA) libre de hemólisis. La muestra debe tomarse
estando el paciente en ayunas.
Los tubos de ensayo y los materiales deben estar limpios.

b) Determinación de la cantidad de triglicéridos

Llevar el reactivo de trabajo a la temperatura en que se realizará el ensayo. Preparar
tres tubos de ensayo a las cantidades descriptas en la siguiente tabla:

Blanco STD Muestra

Muestra (mL) - - 0.003
STD (mL) - 0.003 -
Reactivo 1 0.3 0.3 0.3

Mezclar e incubar durante 5 min a 37 ºC ó 10 min a temperatura ambiente.

Agregar a cada tubo 0.7 mL de agua destilada y luego leer sus absorbancias en el
espectrofotómetro a 520 nm. La muestra es estable durante 30 minutos.

Calcular la concentración de triglicéridos en mg/dL.

c) Determinación la cantidad de colesterol

Llevar el reactivo de trabajo a la temperatura en que se realizará el ensayo. Preparar
tres tubos de ensayo a las cantidades descriptas en la siguiente tabla:

Blanco STD Muestra

Muestra (mL) - - 0.003
STD (mL) - 0.003 -
Reactivo 2 0.3 0.3 0.3

Mezclar e incubar durante 5 min a 37 ºC ó 10 min a temperatura ambiente.

Agregar a cada tubo 0.7 mL de agua destilada y luego leer sus absorbancias en el
espectrofotómetro a 505 nm. La muestra es estable durante 30 minutos.

Calcular la concentración de colesterol en mg/dL, la HDL y LDL.

95
 PRACTICA 8: PROPIEDADES CATALITICAS DE LA CATALASA

OBJETIVOS
- Comparar la velocidad de una reacción con y sin catalizador.
- Comparar las propiedades catalíticas de una enzima con un catalizador inorgánico.

FUNDAMENTO TEORICO
La catalasa es una enzima que se encuentra en casi todas las células vivas excepto en los
microorganismos anaeróbicos y es abundante en hígado, riñón, en proporciones
menores en el tejido conectivo y epitelios.

Enzima catalasa.

Existen organelos llamados peroxisomas similares a los lisosomas en estructura, pero de

menor tamaño, abundante en las células hepáticas y que contienen diversas enzimas
relacionadas con el metabolismo del H2O2, sustancia toxica para el organismo.
La enzima catalasa está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas cada una con un
grupo hemo, es decir que contiene un átomo de hierro, cuyo peso molecular de 250 000
Da.
La catalasa cataliza la descomposición del H2O2, y aunque los mecanismos de la reacción
no están establecidos completamente, se asume que el ion Fe+3 transfiere los electrones
entre las dos moléculas de H2O2, descomponiéndola en H2O y O2, moléculas inocuas
para las células.
La catalasa tiene un amplio poder catalico. Así una enzima catalasa del higado de res
puede descomponer millones de moleculas de H2O2 en un minuto a 0 °C.

96
Aplicaciones:
En la industria se utiliza la enzima catalasa para diferentes fines.

En la industria textil se usa para eliminar residuos de peróxido de hidrógeno. Además, la

catalasa cumple una función protectora contra determinados microorganismos
patógenos, sobre todo anaerobios. La ausencia de dicha enzima por defectos genéticos,
llamada acatalasia o enfermedad de Takahara, enfermedad que está caracterizada por
la ausencia de los glóbulos rojos y está relacionado con las infecciones de la mucosa
bucal llegando a causar la pérdida de dientes y lesiones graves en los maxilares y tejidos
blandos de la cavidad bucal.

Otros beneficios para la salud son: Poder antioxidante importante, se ha comprobado

que la enzima catalasa tiene una reacción rápida en contra de los radicales libres del
peróxido de hidrógeno convirtiéndolos en agua y oxígeno. Posibles Efectos Anti-
Envejecimiento y Anti-Degenerativos. La catalasa actualmente se estudia por sus
aplicaciones al prolongar la vida y la vitalidad.

También se lo ha relacionado con la reducción de grasa. Estudios muestran que hay una
relación inversa entre la catalasa y los niveles de grasa.

Reacción General:
Catalasa
2 H2O2 2 H2O + O2

Esta reacción se lleva a cabo en dos pasos:

1) Catalasa FeOH + HOOH Catalasa FeOOH + H2O
2) Catalasa FeOOH + HOOH Catalasa FeOH + H2O + O2

Este O2 liberado se puede medir durante el transcurso de la reaccion. La actividad

enzimatica se expresa en unidades de catalasa, en las que una unidad contituye una
micromol de O2 liberado por minuto a una determinada temperatura.
Un aumento de la temperatura provoca un incremento en la velocidad de reacción hasta
la temperatura optima, ya que aproximadamente despues de los 45 °C, se comienza a
producir la desnaturalización de la enzima.

97
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:
- Matraz de 250 mL
- Bureta de 50 mL
- Tubo de desprendimiento y látex
- Vaso de precipitación de 500 mL
- Pipetas de 1 y 5 mL
- Pinza de mohr
- Tapón de jebe
- Soportes
- cronómetro
- Viales

REACTIVOS:
- Agua oxigenada 20 volúmenes
- FeSO4 al 5%
- Sangre recogida sobre anticoagulantes como oxalato, citrato o heparina.

98
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Descomposición de H2O2 sin catalizador

Llenar con agua una bureta, invertirla y sumergirla dentro de un vaso con agua y
enrasarla. Colocar en un tubo de desprendimiento que tenga conexión hermética hacia
el matraz de reacción.

Colocar el matraz de 250 mL un frasquito al cual se adiciona 5 mL de agua oxigenada de

10 volúmenes (1 mL de esta solución de agua oxigenada produce 10 mL de oxígeno en
condiciones normales). Cerrar herméticamente con tapón de jebe perforado y conectar
a una manguera que cierra con una pinza de mohr (uso de pinza es opcional). Esto es la
primera parte.

Conectar el matraz al tubo de desprendimiento: manteniendo cerrada la pinza de mohr,

cuidando de no voltear el frasquito con el agua oxigenada. Asegúrese de que el sistema
sea hermético para que no haya fugas de gas durante la experiencia.

Agitar el matraz haciendo que caiga el vial que contiene el agua oxigenada, para que la
reacción inicie y ocurra por 1 min. Abrir la pinza de mohr y cuando haya trascurrido el
tiempo, cerrarla. Anotar el volumen de gas (Vg) desprendido en mL. La siguiente figura
muestra el sistema:

Figura que muestra el sistema de medición de la producción de oxígeno.

99
b) Descomposición del H2O2 en presencia del catalizador inorganicoFeSO4
Repetir la primera parte descripta arriba. Agregar por fuera del vial 1 mL de FeSO4 al 5%
y repetir los pasos tal como se indicó en la parte A.

c) Descomposición del H2O2 en presencia de la enzima la catalasa

Al igual que en el caso anterior, repetir la primera parte y añadir por fuera del vial 0.1
mL de sangre y repetir los pasos tal como se indicó en la parte A.

Cálculos:

Calcular el número de moles de oxígeno, usando la siguiente fórmula:

PxV=nxRxT

Donde:

P = presión atmosférica en atm o en mmHg

V = volumen desplazado por el oxígeno en mL
n = número de moles de oxigeno liberado
R = constante universal de los gases, cuyos valores pueden ser de 62,4 mmHg.L/mol.°K
ó 0,082 atm.L/mol.°K.
T = temperatura en °K.

En el caso de la experiencia con catalasa de la sangre, se puede expresar su actividad

enzimática en unidades de catalasa.

100
 PRACTICA Nº 9: FERMENTACION LACTICA Y ALCOHOLICA

OBJETIVOS:
- Calcular la concentración del ácido láctico en la leche en %.
- Realizar el proceso de fermentación alcohólica en los jugos de uva o piña.

FUNDAMENTO TEORICO
La fermentación es un proceso metabólico anaeróbico exotérmico en el cual el azúcar
se transforma en alcohol, CO2, ácido láctico, entre otros, los cuales dependen del
microorganismo que actúe. En el siguiente cuadro muestra los diferentes organismos
que se utilizan y los productos de la fermentación:

Glucosa

Ac. Pirúvico

Organismos NADH

CO2, Ac. Acetona,

propiónico
Ac. láctico CO2, etanol
isopropanol
Ac. acético NAD+

Productos de
la
fermentación

Queso Yogurt, queso Quita esmalte, Vinagre

Vino, cerveza
Cheddar, yogurt alcohol
y salsa de soya.

Cuando en el proceso intervienen las bacterias lácticas, se obtiene el ácido láctico como
producto principal se llama fermentación láctica. Para obtener ácido láctico se requiere
de piruvato o ácido pirúvico, que se obtiene por la degradación de glucosa u otros
azucares, generalmente por glucólisis, en condiciones anaeróbicas o aeróbicas en el
citoplasma de las células eucariotas o procariotas en presencia de bacterias:

C6H12O6 2 CH3CHOH-COOH

101
Una vez obtenido el ácido pirúvico, este puede ser metabolizado en forma anaeróbica
dando como resultado la Fermentación láctica o alcohólica o puede ser de forma
aeróbica y participando en el ciclo de Krebs, tal como muestra la siguiente figura:

Figura que muestra los diferentes procesos de los piruvatos en forma anaeróbica y aeróbica.

Cuando el ácido pirúvico requiere la presencia de oxígeno, es decir de forma aeróbica

produce produce CO2 y H2O en el ciclo de Krebs. Y si las células no requieren la presencia
del O2, es decir de forma anaeróbica entonces el piruvato se transforma o bien en etanol
en un proceso denominado Fermentación alcohólica o bien se forma ácido láctico en un
proceso denominado Fermentación Láctica. El siguiente grafico muestra el proceso de
la Fermentación Alcohólica:

Gráfico que muestra Fermentación Alcohólica, don el producto final es el etanol.

102
Cabe señalar, que en la Fermentación Láctica comprende una serie de reacciones
degradativas siguiendo la vía Embden-Meyerhotf, en donde el ácido pirúvico formado
se transforma en el ácido láctico en la etapa final usando la enzima láctico-
deshidrogenasa (LDS) que utiliza NADH como agente reductor:

CH3COCOOH + NADH + H+ CH3CHOH-COOH + NAD+

Los siguientes gráficos muestran el proceso de la Fermentación Láctica:

Gráfico que muestra Fermentación Láctica, donde el producto final es el ácido láctico.

Existen dos tipos de fermentación láctica: la fermentación homoláctica y la

heteroláctica.

La fermentación homoláctica, es aquella que se obtiene como producto final al ácido

láctico o lactato (85-97%) por reducción del piruvato en presencia de la enzima lactato
deshidrogenasa. En este tipo de fermentación está dada por especies de
microorganismos como Lactobacillus (delbrueckii, plantarum, bulgaricus, farciminis,
gasseri, helveticus, jensenii, ruminis, shapeae, etc.). Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus y Pediococcus. Está vía de fermentación es utilizada para la elaboración
del queso fresco en donde el ácido láctico generado influye en la calidad del producto.

Las fermentaciones heterolácticas, son aquellas en que no solo se obtienen como

producto final al ácido láctico, sino también al CO2, ácidos volátiles, ácido acético, entre
otros compuestos. La cantidad del ácido láctico es alrededor del 50% y los
microorganismos más comunes son L. lycopersici, L. mannitopoeus, L. acidphil-
aerogenes, L. fermentum, L. fructosus, L. Kefir y Leuconostoc. Está vía es empleada en la
elaboración de yogurt y queso, al fermentar la lactos en ácido láctico, diacetilo,
anhídrido carbónico y otros compuestos que dan sabor y aroma al producto.

103
Valores de pH de algunas muestras de leche

Muestras pH

Leche fresca de vaca 6.6-6.8

Leche alcalina, aguada o leche del final de ≥ 6.9

la lactación
Leche acida o calostro. 6.5 a 6.6

104
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:
- Erlenmeyers de 125 mL
- Probeta de 10mL y 100 mL
- Vasos de precipitado de 100 mL
- Pipeta de 10 mL
- Bureta de 25 mL
- Estufa
- Tres frascos
- 3 globos que se ajusten a los frascos
- Hoja de papel milimetrado

REACTIVOS:
- NaOH 0.5 M
- Fenolftaleína
- Vaselina liquida
- Leche, yogurt
- 600 mL de jugo de uva o piña
- 50 g de azúcar

105
 PARTE EXPERIMENTAL

a) Reconocimiento de las bacterias

En un portaobjeto, colocar una gota de agua y un poco de yogurt. Adicionar una gota
de azul de metileno y mezclar. Luego de 5 minutos, observar en el microscopio las
características de cada bacteria y el movimiento Browniano, es decir, el choque de las
moléculas de agua en continúa agitación con las partículas microscópicas. A
continuación, te doy un ejemplo de algunas bacterias observadas en el microscópico:

b) Determinación de la cantidad del ácido láctico

Calentar 125 mL de leche a 40 °C. Tomar 50 mL de está leche y colocarlo en un

erlenmeyer de 125 mL, este es nuestro BLANCO. Preparar otro matraz similar para la
muestra problema.

A ambos matraces agregar 5-8 g de yogurt y agitar para homogenizar. Agregar vaselina
líquida sobre la superficie.

El matraz BLANCO se lo coloca en la refrigeradora a 4 °C y el matraz que contiene la

muestra se coloca en la estufa a 37 °C, durante 2 horas. Luego, esperar a que tomen
temperatura ambiente.

Titular ambos matraces con NaOH a 0.5 M, usando como indicador la fenolftaleína.
Calcular la concentración de ácido láctico formado en la leche en %.

106
c) Fermentación alcohólica

A tres frascos limpios y secos agregar consecutivamente: 80 mL del jugo al primer frasco,
teniendo el 100% de sustrato (muestra control), 100 mL de jugo y 3 g de azúcar al
segundo frasco, cuya cantidad de sustrato es al 120%, y 80 mL de jugo y 20 mL de agua
destilada al tercer frasco, siendo este la cantidad de sustrato al 80%.

A cada frasco agregarle 10 mL de solución de levadura y colocar un globo en la boca de

cada. El globo más inflado será considerado como un proceso de fermentación
completa, es decir fermentación al 100%. Esto se toma como un indicador ya que en el
proceso se libera CO2.

Tabular y graficar los resultados.

107
 UNIDAD IV: VITAMINAS Y ORGANISMOS FOTOSINTETICOS

1. VITAMINAS

Los principales grupos de los reguladores del metabolismo son las vitaminas, hormonas
y sustancias mediadoras. Cada uno de estos compuestos biológico puede ser
identificado tanto cualitativamente como cuantitativamente. En esta práctica vamos a
tratar sobre la determinación cualitativa de las vitaminas.

Las vitaminas son sustancias orgánicas que aportan los alimentos y que son necesarias
en proporciones pequeñas para el buen funcionamiento fisiológico.

Las vitaminas tienen las siguientes características:

➢ No pueden ser sintetizadas, por ende debemos de ingerirlos en las dietas, excepto la
vitamina D.
➢ Se encuentran en cantidades del orden de mg o μg por cada 100 g de alimento.
➢ Su carencia o exceso de ingesta provoca trastornos y patologías.

Clasificación de vitaminas:

Las vitaminas se clasifican en función de su solubilidad en hidrosolubles y en liposoluble.

Las vitaminas liposolubles contienen C, O, H, con uno o más anillos benzoicos unidos a
una cadena hidrocarbonada. Son solubles en grasa, por lo que seguirán los mecanismos
de absorción y transporte de las grasas. Por ende, un exceso uso de laxantes, dará como
consecuencia una disminución de absorción de las vitaminas liposolubles.

Las vitaminas liposolubles se almacenan principalmente en el hígado, riñones y

pulmones. Estás vitaminas se encuentran en los alimentos donde hay mayor mucha
cantidad de lípidos y no se degradan por el calentamiento, en general son bastante
estables.

Cabe señalar, que los síntomas de deficiencias de estas vitaminas se manifiestan

tardíamente.

Las principales vitaminas liposolubles son:

➢ Vitamina A o retinol
➢ Vitamina D o calciferol
➢ Vitamina E o tocoferol
➢ Vitamina K

108
 Principalmente se relaciona con el:
Función crecimiento del hueso, fisiología de la
visión, crecimiento y mantenimiento
VITAMINA A del tejido epitelial, reproducción animal
ó la agrupación de tres y favorece la resistencia a las
sustancias (retinol, retinal y el infecciones.
ácido retinoico). Fuentes animales: Hígado, paté, huevos
Fuentes (yema), mantequilla, leche, queso.
Fuentes vegetales: Zanahoria,
espinaca, perejil y tomate.
El exceso de esta vitamina puede dar
Excesos/Déficit lugar a dolores abdominales,
irritabilidad, diarrea, debilidad
muscular, caída del cabello, dermatitis y
conjuntivitis.
Su déficit puede ocasionar ceguera, piel
y mucosas resecas.
Actúa como hormona y controla el
Función mantenimiento del calcio mediante:
➢ Regula la absorción del Ca y P.
VITAMINA D ➢ Incrementa la reabsorción del Ca en
ó calciferol el riñón.
➢ Ayuda al flujo de Ca desde los
huesos al plasma.
Aceite de hígado de bacalao, sardinas,
Fuentes salmón, gambas, caballa, cereales,
huevo duro, hígado, carne, queso,
leche, yogur, entre otros.
El exceso puede ocasionar problemas
gastrointestinales, pérdida de apetito,
Excesos/Déficit dolor de cabeza, hipercalcemia y
deposiciones de calcio en tejidos
blandos, especialmente en el riñón.
El déficit puede provocar raquitismo y a
la osteomalacia.
Antioxidante. Al parecer involucrado en
Función procesos de envejecimiento, procesos
VITAMINA E circulatorios. Previene la hemolisis y
Incluyen los tocotrienoles y los
disminuye procesos mutágenos y
tocoferoles.
algunas toxinas como el O3, y NO.
Aceite de germen de trigo, aceite de
Fuentes girasol, de colza, de maíz, de soja, palta,
carne, queso, arroz, avellanas,
almendras, entre otros.
Tanto el exceso como su déficit son
Excesos/Déficit raros dado la cantidad de aceites en
nuestra comida.

109
 Interviene en los procesos de
Función coagulación sanguínea y en la
VITAMINA K calcificación ósea. Además, participa en
Incluyen filoquinona,
la biosíntesis de proteínas.
menaquinona y Vitamina K
Origen vegetal: nabos, col, lechuga y
sintética.
Fuentes espinaca, tomate, espárragos, entre
otros.
Origen animal: Hígado, leche, yema de
huevo.
No se han descripto hipervitaminosis de
Excesos/Déficit vitamina K, seria necesarios una
cantidad de 1000 veces superior a lo
requerido para apreciar efectos tóxicos.
Es difícil padecer déficit de vitamina K
porque la flora intestinal se encarga de
sintetizar.

Las vitaminas hidrosolubles están formadas por C, O, H, además pueden contener N, S

o Co. Tiene una función menos específica que las vitaminas liposolubles actuando como
coenzima o cofactor en las diversas rutas metabólicas del organismo.

Son solubles en agua, de absorción intestinal rápida y por ende también es rápida su
excreción por la orina. No se almacena en el organismo excepto la vitamina B12, razón
por la cual el exceso de este grupo de vitaminas no resulta tóxico.

Los síntomas de deficiencia se manifiestan rápidamente. Como son hidrosolubles, puede

que se pierdan moléculas de agua en la ebullición. En general, son más inestables que
los liposolubles.

Las principales vitaminas liposolubles son:

➢ Vitamina C o ácido ascórbico

➢ Vitamina B1 o tiamina
➢ Vitamina B2 o riboflavina
➢ Vitamina B6 o piridoxina
➢ Vitamina B12 o cobalamina
➢ Niacina
➢ Biotina
➢ Ácido pantoténico
➢ Ácido fólico

110
 Antioxidante. Se usa para mantener los
Función vasos sanguíneos, cicatrización de heridas,
VITAMINA C funciones inmunológicas y es necesaria
para la absorción del Hierro.
Frutas y verduras como el Kiwi, guayaba,
Fuentes pimiento rojo, perejil, limón, coliflor,
espinaca, fresa, papaya, mango y naranja.
El exceso de la Vitamina C, provoca
Excesos/Déficit diarrea, nausea, cólicos estomacales,
empeora el incremento del hierro y daña
los tejidos del cuerpo.
El déficit te da escorbuto con hinchazón,
hemorragias de encías y caída de los
dientes.
Forma parte de una enzima para la
Función función nerviosa. Usado para los
músculos, necesario para los
VITAMINA B1 carbohidratos.
(Tiamina) Huevos, carnes de cerdo o vaca, palta,
Fuentes garbanzos, lentejas, avellanas, nueces y
ajos.
No existe toxicidad conocida para una
persona con exceso de esta vitamina.
Excesos/Déficit El déficit disminuye la cantidad de glucosa
en la sangre, también produce fatiga,
irritabilidad y debilidad muscular.

Necesaria para el metabolismo de los

Función ácidos grasos, aminoácidos, forma parte
VITAMINA B2 de una enzima para la parte ocular.
(riboflavina) Participa en la formación de glóbulos rojos
y en los anticuerpos.
Germen de trigo, almendras, cocos,
Fuentes champiñones, huevos, lentejas, leche,
verduras de hojas verdes y cereales.
No se han descripto toxicidad por excesos
de esta vitamina.
Excesos/Déficit El déficit produce dermatitis, úlceras
bucales, picor ocular, lagrimeo y visión
borrosa. También puede dar anemia y
problemas de absorción intestinal.

111
 Participa en el sistema nervioso, aparato
Función digestivo y en el mantenimiento de la piel.
VITAMINA B3
(Niacina) Hígado de ternera, almendras, germen de
Fuentes trigo, arroz integral, cereales, hongos,
verduras, espárragos y palta.
El exceso puede causar daños hepáticos y
Excesos/Déficit erupciones cutáneas.
El déficit puede dar dermatitis, diarrea, y
demencia.

Usado en la síntesis de ácidos grasos,

Función colesterol y en otros productos como la
VITAMINA B5 bilis, vitamina D y hormonas.
(ácido pantoténico) Vísceras, levadura de cerveza, yema de
Fuentes huevo y cereales.

El exceso de esta vitamina puede

ocasionar diarrea.
Excesos/Déficit El déficit puede ocasionar el síndrome del
intestino corto con diarrea crónica en los
niños. En adultos, dermatitis, somnolencia
e infecciones por cándidas.
Usa en la producción de los glóbulos rojos,
Función proteínas, anticuerpos y síntesis de
VITAMINA B6 hormonas.
(piridoxina) Sardina, nueces, lentejas, vísceras,
Fuentes garbanzos, carne de pollo, atún, avellana,
plátanos, entre otros.
El exceso puede provocar problemas
neurológicos y entumecimiento de las
Excesos/Déficit articulaciones.
El déficit podría ocasionar problemas de
úlceras en la boca y lengua, irritabilidad y
depresión.

112
 Usado en el metabolismo de grasa,
Función carbohidratos y proteínas.
BIOTINA
Frutos secos, frutas, leche, hígado,
Fuentes levadura de cerveza.

Los excesos carecen de toxicidad aun en

Excesos/Déficit cantidades elevadas.
El déficit incluye pérdida del cabello,
erupciones rojas, depresión, apatía y
hormigueo en los brazos y piernas.
Participa en la formación de glóbulos
ACIDO FÓLICO Función rojos, de nuevas células. Participa en el
metabolismo de proteínas.
Lechuga, levadura de cerveza, zanahorias,
Fuentes tomate, perejil, espinacas, verduras de
hojas verdes, semillas y en los granos.
No existe reporte por daños por exceso de
esta vitamina, ya que se libera en la orina.
Excesos/Déficit El déficit podría relacionarse con
patologías cardiacas como las
cardiovasculares e infarto de miocardio.
Participa en el metabolismo de proteínas,
Función gras y carbohidratos. También participa en
VITAMINA B12 la formación de glóbulos rojos y en el
mantenimiento del sistema nervioso.
Huevos, productos lácteos y alimentos de
Fuentes origen animal.

El déficit puede dar lugar a la anemia,

entumecimiento, hormigueo en los brazos
y piernas, diarrea, palidez y dificultad para
respirar.
No se suele relacionar a las personas con
Excesos/Déficit
problemas de salud por exceso de esta
vitamina, ya que se excreta en la orina. Sin
embargo, personas con problemas en el
riñón, un exceso de esta vitamina les
puede ocasionar problemas de salud.

113
2. ORGANISMOS FOTOSINTETICOS

En las células de los organismos fotosintetizantes se tiene un sistema de pigmentos

como la clorofila, ficobilinas y carotenoide que absorben en la región visible del
espectro, los cuales son transformados en energía fosfato ATP que puede ser usada por
los seres vivos. Estas sustancias también son conocidas como pigmentos.

Algunos pigmentos absorben la luz en todas las longitudes de onda y por ende tienen
un color negro, pero otras, absorben en ciertas longitudes de onda y reflejan o
transmiten las longitudes de onda que no absorben.

La clorofila, pigmento que hace que el color de las hojas sea verdes, absorbe la luz en
el espectro del violeta al rojo, tal como se muestra en el siguiente gráfico:

Gráfico que muestra el espectro de absorción de la clorofila.

114
La clorofila está formado por un tetrapirrólica con un átomo central de magnesio y una
cola de fitol, que es un alcohol unido a una cadena hidrocarbonada. Hay dos tipos de
clorofila, la “a” y “b”.

La clorofila a y b están presente en los eucariotas fotosintéticos como las plantas y algas,
y produce energía química de la luz solar. La siguiente figura muestra la estructura de
la clorofila a y b.

Estructura de la clorofila a y b.

Otro grupo de pigmentos son los carotenoides, son polímeros cuya unidad básica es el
isopreno. Los factores que influyen en la cantidad de los carotenoides son: el manejo de
la cosecha, el grado de madurez del alimento, las operaciones del procesado y
conservación del alimento, la temperatura, intensidad de luz y empacado de las
alimentos.

Los carotenoides pueden ser de dos tipos: los carotenos, cuyo color es el amarillo y las
xantofilas, de color naranja. Los carotenos se clasifican en α-, β-, γ-, ε- caroteno y los
licopenos, tal como se muestra en la figura siguiente.

115
 α-caroteno

β-caroteno

γ-caroteno

ε-caroteno

Licopeno

Gráfico que muestra las diferentes formas del caroteno.

116
Las ficobilinas están compuestas de tetrapirrolicos lineales. Son de dos tipos, las
ficocianinas de color azul y la ficoeritrina de color rojo.

En una hoja, estos colores quedan enmascarados por la clorofila, quien se encuentra en
mayor cantidad; sin embargo, en algunos tejidos como en el tomate maduro, los colores
de los carotenoides pueden prevalecer.

La clorofila b, los carotenoides y las ficobilinas son capaces de absorber la luz a

diferentes longitudes de onda de la clorofila a.

La relación entre la fotosíntesis y la presencia de estos pigmentos se muestra en el

espectro de acción de la fotosíntesis, que es la eficiencia fotosintética frente a la longitud
de onda con los espectros de absorción de las clorofilas. La eficiencia fotosintética es
mayor en la mayor absorción del pigmento.

Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos.

117
Espectro de acción de la fotosíntesis y su eficiencia fotosintética a 670 nm que está en la parte
superior del gráfico.

Cuando un pigmento absorbe luz, los electrones se excitan y se ubican en niveles

energéticos superiores, que luego regresan a su estado basa. La energía desprendida
puede:

- Emitirse a una longitud de onda superior, proceso conocido como fluorescencia.

- Disiparse en forma de colar, en una conversión interna.
- Ser absorbida por una molécula vecina, que excita sus electrones y hay
resonancia inductiva.

Grafico que muestra el proceso cuando un pigmento absorbe luz y los diferentes formas que
absorción de la energía liberada.

118
 PRACTICA Nº 10: VITAMINAS Y ORGANISMOS FOTOSINTETICOS

OBJETIVOS:
- Determinar cualitativamente las vitaminas A, D, E, K, P y C.
- Hacer la extracción, fraccionamiento, y reacciones de óxido-reducción y precipitación
de los organismos fotosintéticos.

FUNDAMENTO TEORICO

1. VITAMINAS

a) Vitamina A (retinol)
Este método se basa en la capacidad del ácido sulfúrico concentrado de desprender
agua del retinol y como consecuencia hay la formación de productos coloreados.

b) Vitamina D (calciferol)
Este método se basa en la interacción del calciferol con el hidrocloruro de anilina dando
como resultado la formación de un compuesto coloreado.

c) Vitamina E (tocoferol)
Este método se basa en la formación de un compuesto de estructura quinoidea que
toma un color rojo por acción de oxidante fuertes como el ácido nítrico.

d) Vitamina K (naftoquinona)
El método se basa en la interacción entre la dietilditiocarbamato con la vitamina K en
medio alcalino dando como resultado un complejo de color celeste.

e) Vitamina P (rutina)
El método se basa en la interacción con el cloruro férrico (III) dando como resultado un
complejo coloreado.

f) Vitamina C
El método se basa en la reacción oxido- reducción con el azul de metileno, nitrato de
plata o 2,6-diclorofenolindofenol.

119
2. ORGANISMOS FOTOSINTETICOS

a) Extracción de pigmentos de una planta

El método se basa en la extracción de los pigmentos como la clorofila en alcohol caliente,
al reaccionar se forma la etilclorofilida, que es un éster en el cual el resto de fitol está
constituido por un resto de etanol. Con este extracto se va a realizar las siguientes
reacciones:

a.1) Fraccionamiento de pigmentos

El método se basa en la capacidad de los pigmentos a poder separarse de acuerdo a su
solubilidad con la bencina. La clorofila y la clorofilida son soluble, mientras, que la
xantofila es insoluble.

a.2) Precipitación de la clorofila por saponificación

El método se basa en la reacción de los grupos ésteres de la clorofila con hidróxido de
bario, proceso conocido como saponificación, dando como resultado sales de bario de
las clorofilidas A y B, insolubles. La solución sobrenadante presenta carotenos y
xantofilas del extracto de color amarillo.

a.3) Reducción de la clorofila con el ácido ascórbico

El método se basa en la capacidad del ácido ascórbico de reducir a la clorofila como
resultado da una solución de color amarillo.

a.4) Obtención de feofitina a partir de la clorofila

El método se basa en la capacidad del HCl de unir al ión Mg en la clorofila con la feofitina
de color pardo.

120
 MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:
- Tubos de ensayo
- Mortero
- Pipetas de 5 mL
- Papel de filtro
- Plantas, por ejemplo hojas de ortiga
- Coliflor fresca
- Te seco
- Baño maría

REACTIVOS:
- Cloroformo
- Ácido sulfúrico concentrado
- Ácido sulfanílico
- Nitrito de sodio al 5%
- Carbonato de sodio al 10%
- Ácido nítrico concentrado
- Dietil ditiocarbamato de sodio
- Solución alcohólica al 2%
- Hidróxido de sodio 4%
- Hidrosulfito de sodio en polvo
- Cloruro de hierro III
- Tiourea en cristales
- Aceite de pescado
- Tocoferol en solución alcohólica al 0.1%
- Vitamina K en solución saturada en etanol al 70%
- Vitamina B12 en ampolletas
- Etanol 96°
- Solución saturada de Hidroxido de bario
- Bencina
- Cristales de ácido ascórbico cristalino
- HCl al 10%

121
 PARTE EXPERIMENTAL

1. VITAMINAS

a) Vitamina A (retinol)
En un tubo de ensayo colocar 2 gotas de aceite de pescado, 5 gotas de cloroformo y 1-2
gotas de ácido sulfúrico concentrado. La coloración pardo-rojiza nos indicará reacción
positiva.

b) Vitamina D (calciferol)
En un tubo de ensayo colocar 10 gotas del reactivo anílico, agregar 5 gotas de aceite de
pescado. Agitar, calentar a ebullición por 30 sg. En presencia de la Vitamina A, la
emulsión amarilla pasa a un color rojizo.

c) Vitamina E (tocoferol)
En un tubo de ensayo colocar 5 gotas de la solución alcohólica de tocoferol, luego
agregar 10 gotas de ácido nítrico concentrado. Agitar y observar desarrollo de coloración
roja.

d) Vitamina K (naftoquinona)
En un tubo de ensayo colocar 4 gotas de la solución alcohólica de la vitamina K, luego
agregar 8 gotas de la solución de dietilditiocarbamato de sodio y 4 gotas de hidróxido
de sodio. Agitar y observar la coloración celeste, que indica reacción positiva.

e) Vitamina P (rutina)
Pesar 100 g de té, agregar 15 mL de agua y hervir durante 3 min. Después enfriar y
colocar en un tubo de ensayo 1 mL del extracto, añadir algunos cristales de cloruro
férrico, dando un color negruzco. Agitar y luego diluir 2- 3 veces con agua. Observa el
cambio de coloración.

f) Vitamina C
A 1 mL del jugo de coliflor o papa, se agrega 1 mL de azul de metileno al 0.01%. Agitar,
taparlo para evitar el contacto con el oxígeno del aire.

Calentar el tubo en un baño de agua a 37- 40 ºC hasta observar la decoloración del

líquido como consecuencia de la reducción del azul de metileno en su forma leico
incolora y de la formación del ácido dehidroascorbico. Si luego la solución incolora de
azul de metileno se agita enérgicamente, sin impedir el ingreso de oxígeno al tubo de
ensayo, la solución nuevamente adquiere un color azul.

122
2. PIGMENTOS DE LAS PLANTAS

a) Extracción de pigmentos de una planta

Moler 5 g de hojas una planta como la de ortiga seca en un mortero y añadir 5 mL de
etanol. Mezclar. Volcar en un tubo de ensayo y calentar en un baño maría a 70 °C, tener
cuidado la evaporación del etanol.

Filtrar el contenido con un papel de filtro y guardar extracto para las siguientes
determinaciones:

a.1) Fraccionamiento de pigmentos

En un tubo de ensayo, colocar 10 gotas del extracto y añadir igual cantidad de bencina,
agitar suavemente con el dedo en el fondo del tubo de ensayo. Observar y anotar
coloración en los diferentes pigmentos.

a.2) Precipitación de la clorofila por saponificación

En un tubo de ensayo agregar 10 gotas del extracto y añadir 20 gotas de la solución
saturada de hidróxido de bario. Agitar y anotar los cambios observados.

a.3) Reducción de la clorofila con el ácido ascórbico

En un tubo de ensayo, agregar 10 gotas del extracto y cristales de ácido ascórbico.
Calentar en un baño maría a 70-80 °C durante 3 a 5 min y observar los cambios de
coloración.

a.4) Extracción de la feofitina a partir de la clorofila

En un tubo de ensayo añadir 5 gotas de filtrado y una gota de HCl. Observar y anotar el
cambio de coloración.

123