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MANUAL PRÁCTICAS
BIOQUÍMICA
PRESTACIÓN DE SERVICIOS
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
2 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
Contenido
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
3 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA Nº 1
PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
OBJETIVOS
Observar algunas propiedades físicas de los aminoácidos.
Reconocer la presencia de aminoácidos por la reacción de estos con la
Ninhidrina
Identificar algunos grupos funcionales presentes en aminoácidos específicos
mediante la formación de productos coloreados.
TEORÍA RELACIONADA
Las células vivas producen macromoléculas que son biopolímeros constituidos por
unidades monoméricas o bases estructurales. Para las proteínas, estas unidades son
los L – á – aminoácidos. Las propiedades biológicas de estas macromoléculas están
determinadas en gran parte por las clases de aminoácidos presentes, el orden en el que
están dispuestos en una cadena de polipéptidos y por lo tanto la relación espacial de un
aminoácido con otro. Los aminoácidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo.
En un á – aminoácido, ambos están unidos al mismo átomo (á) de carbono. De los
aminoácidos presentes en la naturaleza, sólo 20 de ellos aparecen en las proteínas de
todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminoácidos intervienen en
la transmisión de impulsos en el sistema nervioso (Glicina y acido glutámico). Los
aminoácidos esenciales deben ser suministrados en la alimentación, ya que nuestros
cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento
(niños) o para conservar la salud (adultos).
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4 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
Reacción del Acido Glioxílico para Triptófano: Grupo indólico del triptófano reacciona con
ácido glioxílico en presencia del ácido sulfúrico concentrado dando un color púrpura.
MATERIALES Y REACTIVOS
10 Tubos de ensayo 1 Gotero.
1 Gradilla 1 Estufa
1 Pinza para tubos de ensayo. 1 Beaker de 500mls
3 Pipetas de 1, 5 y 10 mL Papel indicador
PROCEDIMIENTO
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5 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1- Escriba la reacción para cada prueba realizada.
2- De acuerdo con las pruebas realizadas en esta práctica proponga una clasificación
para los aminoácidos.
3- Identifique los grupos químicos que caracterizan a los aminoácidos.
4- Explique como se encuentran estructuralmente los aminoácidos en el plasma
sanguíneo o líquido intracelular cuyo pH es de 7.4 y 7.1 respectivamente.
5- Cuales son las explicaciones prácticas de las pruebas realizadas.
BIBLIOGRAFÍA
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6 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA Nº 2
ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
OBJETIVOS
TEORÍA RELACIONADA
MATERIALES Y REACTIVOS
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7 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PROCEDIMIENTO:
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8 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Consultar en forma clara y breve en que consiste la desnaturalización de las
proteínas.
2. Explique que sucede cuando el cabello se somete a los tintes, de ris y alisado, este
proceso es reversible o irreversible.
3. Explique por que las pezuñas, los cuernos, las uñas, el cabello y las plumas no se
disuelven con el agua..
4. Consultar de qué depende la solubilidad de las proteínas.
5. Explique cuando es positiva la reacción de Biuret, escriba la reacción
6. Consulte otras técnicas utilizadas para la cuantificación de proteínas.
BIBLIOGRAFÍA:
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA Nº 3
CATÁLISIS ENZIMÁTICA E INORGÁNICA
OBJETIVOS
TEORÍA RELACIONADA
Las enzimas son catalizadores biológicos de estructura proteica y producidos por los
mismos organismos que las utilizan para realizar sus propios procesos metabólicos. La
acción catalítica de una enzima está sometida a la influencia de factores físicos como son,
el calor, las radiaciones o de factores químicos como cambios en el pH y en la
concentración de la enzima, sustrato y la presencia de inhibidores. En cambio los
catalizadores inorgánicos, en algunos casos, no son afectados por factores físicos como
el calor, por tanto, pueden catalizar una determinada reacción pese a cambios en la
temperatura.
Catalasa
H2 O2 H2 O + O2
MnO2
H2 O2 H2 O + O2
MATERIALES Y REACTIVOS
6 tubos de ensayo Pinza para tubos de ensayo
2 pipetas de 5 y 10 ml Gotero
Beaker de 400ml Agua destilada
Calentador Probeta de 100ml
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10 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
Espátula Gradilla
Mortero con mano
PARTE EXPERIMENTAL
1. Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las siguientes sustancias:
Tubo Nº1 1ml de sangre al 10%
Tubo Nº2: 1 ml de extracto de papa.
Tubo Nª3: Una pequeña porción de MnO2
2. Agregar a cada uno de los tubos 2ml de H2O2 al 3%. Observar la intensidad de la
reacción por el burbujeo del oxígeno y la liberación de calor. Compare el nivel alcanzado
por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad
catalítica con base en este parámetro.
3. Prepare 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y Colóquelos en un baño con agua a
ebullición durante diez minutos, retirarlos y dejar en reposo dentro de un baño de agua a
temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2ml de H2O2 al 3%.
Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden
creciente la actividad catalítica con base a este parámetro.
4. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y colóquelos en un baño de
hielo durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2 ml de H2O2 al 3%. Compare el nivel
alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la
actividad catalítica con base en este parámetro.
5. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1, adicione a cada tubo uno 6
gotas de NaCN y dejar en reposo durante 5 min, luego adicione 2ml de H2O2 al 3% a
cada tubo. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y
registre en orden creciente la actividad catalítica con base en este parámetro.
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11 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Explique por qué el captopril y el enalopril son ejemplos de inhibidores competitivos
de la enzima conversora de la angiotensina.
2. Las granadas son fabricadas por la industria militar con un dispositivo especial de
seguridad para que no exploten en el sitio donde son fabricadas, si no durante el
combate, ¿Qué tipo de enzimas son fabricadas por ciertos órganos que tienen un
comportamiento similar al de las granadas? De ejemplos.
3. Por qué carece de importancia la lipasa gástrica en los procesos digestivos del
estómago de los adultos y en cambio es importante en el estómago infantil?
4. Cuál es la importancia médica de las enzimas? De por lo menos un ejemplo concreto.
5. Defina que son: Zimógenos, Isozimas, Inhibidores acompetitivos.
6. Qué diferencias hay entre inhibidores orgánicos e inorgánicos?
7. Qué función cumplen las vitaminas hidrosolubles en las reacciones catalizadas por
enzimas?.
8. Explique como se da el proceso de regulación de la actividad enzimática en el
organismo?.
BIBLIOGRAFÍA:
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. Mexico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de ciencias.
Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA Nº 4
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS.
Reconocer la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la
prueba de molish.
Diferenciar carbohidratos reductores de no reductores por su comportamiento
frente al reactivo de Benedict.
Realizar ensayos cualitativos para el reconocimiento de carbohidratos específicos.
TEORÍA RELACIONADA
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13 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
MATERIALES Y REACTIVOS
Soluciones de: glucosa, galactosa, ribosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, fructosa, almidón,
leche (traer de la casa)
PROCEDIMIENTO
Prueba de Molish: Agregue 5 gotas del reactivo de Molish a 1 ml de una muestra que
contenga carbohidratos (Leche). Añada cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de
ácido sulfúrico concentrado, hasta que se formen dos capas. Observe cualquier cambio
de color en la interfase de los dos líquidos.
Prueba de Benedict: Tome 3 tubos de ensayo; agregue al primero 0.5 ml de solución de
lactosa, al segundo 0.5 ml de solución de glucosa y al tercero 0.5 ml de solución de
sacarosa. Adicione 0.5 ml del reactivo de Benedict a cada tubo y colóquelos en un baño
de agua hirviendo por 3 min. La formación de un precipitado de color rojo ladrillo indica la
presencia de azúcar reductor.
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14 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Escriba cada una de las reacciones en las diferentes pruebas para carbohidratos.
2. Explique los resultados de cada una de las pruebas realizadas?
3. Explique estructuralmente, por que la maltosa es un azúcar reductor y por que el
almidón no lo sus observaciones
4. Consulte las enfermedades producidas por el mal metabolismo de los
carbohidratos.
5. Por qué la celulosa a pesar de estar formada por moléculas de glucosa es
insoluble en agua.
6. ¿por que la sacarosa es un azúcar no reductor?. Consulte las posibles estructuras
de las muestras problemas.
7. Consulte el fundamento de otras técnicas usadas para la determinación de la
glucosa en el laboratorio.
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BIBLIOGRAFÍA:
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA Nº 5
ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS
OBJETIVOS:
Determinar la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos.
Realizar la reacción de saponificación y determinar algunas propiedades de los
jabones.
Comparar el grado de instauración de algunos lípidos.
TEORÍA RELACIONADA
Los lípidos, cuyo nombre deriva del griego lipos: (grasa). Son moléculas de estructura
variada cuya propiedad fundamental que ha permitido su aislamiento y caracterización es
la de ser insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos tales como el benceno,
cloroformo, éter, etc. Constituyen una excepción a esta regla las esfingomielinas que no
son solubles en éter y los fosfolípidos que no son solubles en acetona. Todos los métodos
de obtención de lípidos utilizan en gran medida estos criterios de solubilidad. Los lípidos
más comunes y abundantes en los alimentos de origen vegetal y animal son los aceites y
las grasas, los cuales consumidos en la dieta y conjuntamente con los sintetizados
endógenamente tienen múltiples funciones en el organismo:
Función energética o de reserva: Las grasas neutras (Triacilgliceroles) se
almacenan en los adipositos y suministran calorías fácilmente utilizables en
períodos de escasez. El panículo adiposo subcutáneo es así mismo un eficaz
protector contra el frío externo.
Funciones Estructurales: Todas las membranas biológicas están formadas por
fosfolípidos, glicolípidos y algunas veces esteroides estructurados en bicapas.
Funciones catalíticas: Algunos lípidos actúan en pequeñas cantidades como
activadores o reguladores del metabolismo; por ejemplo, las vitaminas
liposolubles, las hormonas esteroideas o las prostaglandinas.
MATERIALES Y REACTIVOS
10 tubos de ensayo Capsula de porcelana
2 gradillas 1 vaso de 250 ml
Pipetas de 5 y 10 ml Pinza para tubo de ensayo
Calentador Pinza para crisol
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17 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
Espátula Gotero
PROCEDIMIENTO
1. Solubilidad
Numere 7 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, luego agregue a
cada tubo de manera diferente, 1 ml de cada una de las siguientes sustancias:
Agua destilada, etanol, etanol caliente, benceno, cloroformo, éter etílico y acetona. Agite
cada tubo. Deje en la gradilla por 2 min y observe los resultados.
a. ¿Cuales son los mejores disolventes para las grasas?
b. ¿Cuales no disuelven las grasas?
c. ¿Como explican ustedes los resultados?
2. Emulsificación
En dos tubos de ensayo coloque 2 ml de aceite vegetal. Añada a cada uno 2 ml de agua
destilada. A una de los tubos agregue algunas escamas de jabón. Agite bien ambos
tubos. Observe lo que ocurre.
a. Cómo se denomina la mezcla formada?
b. Cómo esta constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo en la gradilla y
obsérvelos varias veces durante quince minutos.
c. Cómo es la estabilidad de las mezclas en los dos tubos?
d. Explique los resultados?
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3. Saponificación
En una capsula de porcelana coloque unos 20 ml de agua y sométalos a ebullición
(mantenga el volumen constante). Cuando estén hirviendo añada 1 ml de ácido
oleico. Agregue ahora cuidadosamente y gota a agota una solución de NaOH al 10%,
hasta que el medio sea claro. Tenga cuidado de no añadir un exceso de álcali.
a. En que consiste la solución formada?
b. Escriba la reacción química que ocurre?
Numere ahora cinco tubos de ensayo y coloque en cada uno dos ml de la solución
anterior realizando las siguientes pruebas:
Tubo#1. sature la solución con NaCl.
Tubo#2. Agregue cinco gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Tubo#3. Agregue cinco gotas de solución de cloruro de calcio.
Tubo#4. Agregue cinco gotas de solución de cloruro de magnesio.
Tubo#5: Agregue cinco gotas de solución de acetato de plomo.
Observe y anote los resultados. Explique lo que ocurre en cada caso. Explique las
reacciones químicas correspondientes.
4. Insaturación.
Tome 3 tubos de ensayo y agregue; 1ml de aceite vegetal al primero, 1ml de acido oleico al
segundo y una pequeña cantidad de acido esteárico al tercero. Adicione a cada tubo 2 ml de
cloroformo y agite bien, deje 2 ml de cloroformo en otro tubo como control. Agregue solución
de yodo gota agota a cada uno de los 4 tubos, agitando después de cada adición. La solución
de yodo decolora si hay ácidos grasos insaturados. Continué agregando (máximo 15 gotas),
hasta que el color del yodo sea estable.
a. Cuantas gotas de solución de yodo se necesitaron en cada tubo para que el color
permaneciera estable?
b. Explique los resultados obtenidos?
c. Escriba la reacción química general de lo ocurrido.
d. Consultar teoría relacionada de lípidos.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Qué tipo de compuesto químico es el jabón?
2. Qué diferencia hay entre jabones y detergentes sintéticos?
3. Que producto se prefiere generalmente en el trabajo de lavandería domestica, un
detergente sintético o un jabón ¿por qué?
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19 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
4. Explique con sus propias palabras y por medio de un dibujo como un detergente puede
desprender las manchas de aceite y grasa de las telas?
5. Que son detergentes biodegradables y no degradables?
6. Explique estructuralmente y con sus propias palabras por que los aceites vegetales son
líquidos a temperatura ambiente y las grasas son sólidas?
7. Cuáles son los ácidos grasos presentes en la mantequilla, margarina, y aceites
vegetales?
8. Explique qué relación hay entre los ácidos grasos omega 3 y la enfermedad cardiaca?
9. Cuál es el nombre del esteroide que se presenta como un detergente en el cuerpo
humano?
BIBLIOGRAFÍA
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. Mexico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de ciencias.
Universidad Nacional de Colombia sede Bogota
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LABORATORIO BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 6
VITAMINAS Y MINERALES
OBJETIVOS:
Separar algunos constituyentes de la leche
Identificar la presencia de vitaminas y minerales en la leche
Reconocer la vitamina A presente en la mantequilla.
TEORÍA RELACIONADA
MATERIALES Y REACTIVOS
Vaso de precipitados de 400ml Gradilla
Probeta de 50ml Embudo de vidrio
Erlenmeyer de 100ml Espátula
Pipetas de 5 y 10ml Vitamina A (traer)
Agitador de vidrio Leche (traer)
Tubos de ensayo (5)
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PROCEDIMIENTO
1. PRECIPITACIÓN DE LA CASEÍNA
En un vaso de precipitado de 400ml; agregar 50ml de leche y 50ml de agua destilada,
añadir con una pipeta gota a gota y con agitación constante acido acético al 10% hasta la
formación de un precipitado flocúlenlo de caseína. Dejar decantar y filtrar sobre gasa;
descartar la caseína que no es de interés en la presente practicay conservar el filtrado
para las posteriores pruebas cualitativas de vitamina B1( tiamina) y minerales.
2. VITAMINA B1.
Vierta 2.5ml de filtrado en un tubo de centrifuga; añada una pequeña cantidad de KCl, y
0.5ml de ferrocianuro de potasio al 1% y 1ml de NaOH al 10%, mezcle y disuelva
totalmente el KCl. Agregar 2.5ml de alcohol isobutilico, agitar cuidadosamente por 2 min y
centrifugar por 5 min a 2000 rpm. La formación de precipitado indica la presencia de
vitamina B1
3. CALCIO
A 0.5 ml de filtrado adicionar unas gotas de solución de oxalato de amonio al 4%.
Observar el precipitado que se forma.( dejar reposar 10min)
4. FOSFATOS
A 0.5 ml de filtrado adicionar 0.5ml de acido molibdico y 0.5ml de acido 1, 2, 4,
aminonaftolsulfonico. Observe la coloración obtenida.
5. VITAMINA A
En un tubo de ensayo; disolver una capsula de vitamina A de 100U, luego se disuelve en
1ml de cloroformo y adicionar 5 gotas del reactivo de Carr-Price. En presencia de vitamina
A, se produce un intenso color azul que desaparece al poco tiempo.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. ¿Cual es el fundamento químico de los procedimientos desarrollados en la
práctica?
2. ¿Que importancia presenta la vitamina a, la tiamina, el calcio y los fosfatos en
mamíferos?
BIBLIOGRAFÍA:
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. Mexico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de ciencias.
Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá
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PRACTICA N° 7
IDENTIFICACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS EN ORINA
OBJETIVOS
Determinar la presencia de cuerpos cetónicos en orina, mediante pruebas
cualitativas para cada uno de ellos.
Familiarizarse con algunos protocolos empleados en laboratorios clínicos para el
reconocimiento de cuerpos cetónicos
TEORÍA RELACIONADA
Los cuerpos cetónicos son los ácidos acetoacético, la acetona y el ácido - hidróxibutirico.
En la cetósis, hallamos un aumento de estas sustancias en la sangre y en la orina. Bajo
buenas condiciones de salud, los cuerpos cetónicos se forman en el hígado y son
completamente metabolizados, de tal manera que solo cantidades insignificantes
aparecen en la orina. Por el contrario, en casos de diabetes, inanición, vómitos con
deshidratación y después de la exposición al frío y/o ejercicio vigoroso, los cuerpos
cetónicos pueden encontrarse en cantidades apreciables en la orina, lo cual permite su
determinación cualitativa.
La determinación de acetona (Método de Imbert), se fundamenta en la formación de un
ferropentacianuro con el derivado isonitrado de la acetona, la determinación de acido
acetoacético (Método de Gerhrdt), se basa en la aparición de una coloración rojo-vinosa
con el cloruro férrico y en el Método de Hart, el acido - hidróxibutirico es transformado en
acetona, la cual se identifica mediante el reactivo de Imbert.
MATERIALES Y REACTIVOS
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PROCEDIMIENTO
DETERMINACIÓN DE ACETONA:
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Qué otro tipo de sustancias pueden determinarse en la orina por un metabolismo
anormal de lípidos.
2. Qué es la cetósis y la Cetonuria.
BIBLIOGRAFÍA
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PRACTICA N° 8
PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN
OBJETIVOS
TEORÍA RELACIONADA
La producción de piruvato durante la fermentación se realiza por una serie de reacciones
enzimáticas que involucran algunos intermediarios. Este proceso se conoce como
fermentación o glucólisis.
La reacción total podría considerarse como la transferencia de dos pares de átomos de
hidrógeno de la glucosa al nad+. Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se
encuentran normalmente en bajas concentraciones, por lo tanto para comprobar su
existencia es necesario impedir su transformación.
La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera
que el piruvato se acumula y su presencia se demuestra con la 2,4- dinitrofenilhidracina.
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo (4) Calentador
Tubos de centrífuga (2) Pinzas para tubo de ensayo (2)
Beaker de 400mL Termómetro
Pipetas de 5mL (3) Espátula
Balanza
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25 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PROCEDIMIENTO
En dos tubos de ensayo A y B añada respectivamente 2.5 ml de solución de glucosa al
10%. Al tubo A agregue 2.5ml de suspensión de levadura al 10% P/V en solución de
fosfato de sodio dibásico 0,5 M; al tubo B agregue 2.5ml de suspensión de levadura al
10% P/V en solución de fosfato de potasio monobásico 0,5M.
Coloque en baño de maría a 37ºC durante 1 hora, luego agregue a cada tubo 2 ml de
A.T.A al 10%P/V, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm.
A 1 ml del sobrenadante agregue 0.5ml de solución saturada de 2,4- dinitrofenilhidracina
en HCl 2M. Mezcle fuertemente, tome 0,5 ml de esta mezcla y agregue 1 ml de NaOH al
10% y 0,5 ml de agua.
La formación de un color rojo indica la presencia de piruvato. Repita esta prueba usando
una solución de glucosa en vez del sobrenadante.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Cuál es la función del ácido tricloroacético?.
2. Qué conclusiones se podrían sacar de los resultados de las muestras A yB?
3. Cuál es la reacción de la 2,4- dinitrofenilhidracina con el pirivato?.
4. Qué función cumple el NAD+ en la producción del piruvato.
5. Consulte la vía de la glucólisis y determine los pasos irreversibles de esta vía.
BIBLIOGRAFÍA
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. Mexico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de ciencias.
Universidad Nacional de Colombia sede Bogota
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PRACTICA N° 9
OBJETIVOS
Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido hepático.
Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante el
uso de un aceptor electrónico.
Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima
succinato deshidrogenada.
TEORÍA RELACIONADA.
Las células de la gran mayorías de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de
reacciones de oxido reducción mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a
través de la degradación de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto
nivel energético (ATP). La succinato deshidrogenada una enzima clasificada dentro del
grupo de las oxidorreductasas cataliza una reacción muy importante en el metabolismo
oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato.
La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar
fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima esta sujeta a una poderosa
inhibición competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una
manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio. Para estudiar el
transporte de cargas en la reacción se empleara un aceptor artificial de electrones (azul
de metileno), cuya decoloración permite diferenciar la actividad enzimatica en los ensayos
a realizar en la presente práctica.
MATERIALES Y REACTIVOS.
Vasos de precipitado de 25y 400 ml Pipetas de 5 ml (2)
Tubos de centrifuga Pipeta de 1 ml (1)
Mortero con maso Gradilla para tubos de ensayo
Termómetro Tubos de ensayo (3)
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PROCEDIMIENTO
1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO
Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hígado hepático libre de sangre y
colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una
mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer
fosfato0.1M Y pH 7.4. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y manténgalo en un baño
con hielo durante 15min, mezclando ocasionalme. Pase la mezcla a tubos de centrifuga y
centrifugue a 1600rpm durante 10min. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y
marquelo como extracto enzimático, manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso.
2. SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN
Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, adicionar a cada tubo
(1,2 y 3) 0.5ml de azul de metileno al 0.1%, luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de
succinato de sodio 0.1M y solo al tubo 3 agréguele 1ml de malonato de sodio 0.1M. Dejar
los tubos en incubación a 37ºC durante 10 min. (Manteniendo la temperatura constante).
Sin retirarlos del baño, agregar 1.5ml de extracto enzimático a cada uno de los tubos (1,2y
3), agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos.
Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo, tenga en cuenta que el tubo 1 es el
control.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
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28 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
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PRACTICA N° 10
FORMACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO EN LA GLUCÓLISIS
OBJETIVOS
Producir ácido láctico a partir del músculo de rata.
Comprobar la formación de dicho ácido mediante pruebas características.
PROCEDIMIENTO
Sacrifique una rata o curiel y extraiga los músculos de las patas. Desmenuce rápidamente
con ayuda de una tijera y macere en un mortero limpio y seco manteniendo a baja
temperatura. Pese dos porciones de 1 g del macerado y viértalas en dos tubos de ensayo.
Uno de los tubos de ensayo se utilizará como control, agréguele inmediatamente 1 ml de
A.T.A al 20%. En ambos tubos de ensayo agregue (5 ml de solución de glucosa al 0,5 %
en bicarbonato de sodio 0,5 M ).agregue 5 gotas de vaselina o aceite vegetal.
Seguidamente coloque los tubos en un baño de María a 37 ºC durante 2 horas.
Después de la incubación en el tubo de ensayo experimental se vierte 0.5 ml de la
solución de A.T.A al 20%, se agita, y los contenidos de ambos tubos se filtran aparte.
Para precipitar los carbohidratos se toman de cada uno de los tubos 2.5 ml del filtrado, se
les agrega 2 ml de solución de sulfato de cobre al 20 % y 0.5g de hidróxido de calcio. Las
muestras se agitan cuidadosamente y después durante un periodo de 15 minutos, se
repite la operación alternándola con intervalos de reposo. Seguidamente se filtran.
Con cuidado se toman 1 ml del filtrado y se vierten al otro tubo de ensayo, el cual se
coloca en un baño de hielo y se le agrega 15 gotas de ácido sulfúrico. Las muestras se
colocan seguidamente en un baño de agua hirviendo por 4 minutos. E inmediatamente se
colocan en un baño de hielo. Una vez que se ha enfriado se agrega a cada tubo 8 gotas
de una solución alcohólica de hidroquinona al 0,2 % y se agitan. Observar ambos tubos.
MATERIALES Y REACTIVOS
Bisturí Baño Serológico
Mortero con mano Pipetas de 5 y 10 mL
4 tubos de ensayo Balanza
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29 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA.
BIBLIOGRAFÍA
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LÓPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional sede Bogotá.
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30 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 11
OBJETIVOS
Obtener preparados de amilasa salival y - d- fructofuranosidasa.
Comprobar la actividad de estas dos enzimas en diferentes muestras.
PROCEDIMIENTO
1. obtención del preparado de amilasa salival y comprobación de su actividad.
Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de comida.
Se mide en una probeta 30 ml de agua destilada y con ella se enjuaga la boca por
espacio de 3 a 5 min . el líquido recogido se filtra a través de un algodón y el filtrado se
utiliza para los siguientes ensayos.
En dos tubos de ensayo se vierten 3 ml de solución de almidón al 1%, en uno de ellos se
agrega 3ml de agua y en el otro 3ml del preparado enzimático y se introducen en un baño
de maría a 40ºC por 5min. Tomando una gota de cada tubo y combinándola con una gota
de lugol en una cápsula de porcelana. Repita esta operación a los 10, 15, 20,25 y 30 min.
Al tubo que contiene la enzima se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B o en
su defecto 1ml de reactivo de benedict. Coloque a calentar hasta que ebulla. Observe.
2. obtención del preparado de - d- fructofuranosidasa y comprobación de su
actividad.
Se trituran 50 g de levadura de cerveza con 3 g de carbonato de calcio hasta formar una
pasta homogénea que se coloca en un beaker de 200ml. Se añaden 13 ml de cloroformo
y se deja por 4 días a temperatura ambiente, alejado de los roedores, después de los 4
días se filtra y al filtrado se le agrega un volumen igual de etanol, el precipitado se lava
con mínimas cantidades de alcohol y éter y se seca al vacio, una solución al 1% de esta
sustancia se utiliza para el experimento.
Prepare una solución de sacarosa al 1%.
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MATERIALES Y REACTIVOS
Beacker de 200 y 500 mL Frasco lavador
Espátula Probeta de 50 mL
Pipetas de 5 y 10 mL Embudo
Mortero Bomba de vacio
Capsula de porcelana (2) Papel filtro
Sacarosa Etanol
Lugol Cloroformo
Hidroquinona al 0,5% Fehling A y B
Peróxido de hidrógeno al 3% Levadura (debe traerla cada grupo de
práctica 4 días antes).
PREGUNTAS.
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BIBLIOGRAFÍA
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LÓPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional sede Bogotá.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 12
OBJETIVOS
PROCEDIMIENTO
Pese 20 g de hígado o corazón y triture suavemente, páselo a un vaso de precipitado y
agréguele KOH al 10% hasta cubrir y caliente en un baño de agua hirviendo durante 20
minutos, agite de vez en cuando durante el calentamiento; enfríe en un baño de hielo,
retire los cuerpos sólidos y agregue 2 ml de sulfato de sodio saturado y mezcle
fuertemente, añada 4 ml de etanol y deje en baño de hielo por 10 minutos. Observe y
centrifugue por 3 minutos, descarte el sobrenadante, seque y pese.
Una pequeña cantidad agregue agua y caliente suavemente hasta disolver, agréguele 1
ml de HCl (1,2M), caliente durante 20 minutos y realice la prueba de Felhing.
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de centrífuga (2) Pipetas de 5 y 10mL
Balanza Agitador
Beaker de 400 y 200 mL Beaker de 300 y 100Ml
Vidrio de reloj Cuchillo
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ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA
1. Cuál es el porcentaje de glucógeno en Hígado y corazón teórico, compárelo con el
calculado experimentalmente.
2. Cuál es la función del Hidróxido de Potasio, etanol y ácido Clorhídrico en la
determinación de glucógeno.
3. Cuál es el porcentaje de error de la cantidad de glucógeno obtenida.
BIBLIOGRAFÍA:
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 13
CUANTIFICACIÓN DE LA RESPIRACIÓN POR EL MÉTODO
COLORIMÉTRICO.
OBJETIVOS
Determinar la cantidad de CO2 producido por las semillas mediante la cantidad de
NaOH consumida.
Observar el fenómeno respiratorio de las semillas
TEORÍA RELACIONADA
La fase de hidratación de las semillas viene acompañada por la dispersión de los coloides
celulares e iniciación de procesos enzimáticos a velocidades crecientes, siendo una de las
primeras consecuencias observables el incremento de los fenómenos respiratorios. El
ATP necesario para llevar a cavo la activación deriva, de manera preferente, del
transporte electrónico respiratorio, provocado por la combustión mitocondrial de sustratos
oxidables. Tales sustratos existen en el endospermo bajo forma exclusiva de
polisacáridos de alto peso molecular (almidón) y lípidos complejos (triglicéridos).
MATERIALES Y REACTIVOS
2 frascos boca ancha con tapa 2 pipetas de 5 y 10 ml
2 beaker de 50ml Algodón
1 probeta de 50 ml Semillas (50g)
PROCEDIMIENTO
Cada grupo coloca 25 ml de NaOH 0,2 N, en dos frascos de mayonesa de 250 ml y tapa
inmediatamente, pese 5g de semilla, la cual ha estado sumergida durante una hora o más
y las coloca en saco de gasa, el cual está unido a la tapa por un cordel, de modo que la
semilla no esté en contacto con el NaOH, un frasco debe quedar sin semilla.
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A las 36 horas extraiga las semillas y tape rápido, tome de cada frasco 5 ml y le agrega
2.5 ml de BaCl2 1 M, adicione tres gotas de fenolftaleina y titule con HCL 0,2 N, hasta que
desaparezca el color y anote los volúmenes gastados. A los ml de titulación del blanco
reste los ml gastados en la titulación de las semillas y multiplique por 5; obtendrá así la
cantidad de HCl equivalentes al CO2 desprendido por las semillas
BIBLIOGRAFÍA:
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRACTICA N° 14
OBJETIVOS
Extraer colesterol de la yema del huevo, utilizando acetona como disolvente.
Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en la yema de huevo
mediante un método calorimétrico.
TEORÍA RELACIONADA
Los lípidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los
triacilglicéridos, el colesterol y los fosfolípidos. Mediante una extracción fraccionada se
pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicéridos y colesterol) de
los más polares (fosfolípidos), que serían solubles en disolventes como la mezcla
cloroformo/metanol.
Los métodos analíticos para la determinación del colesterol se dividen en colorimétricos y
enzimáticos. De los primeros, el más popular es el de Liebermann-Burchard, en el que la
reacción tiene lugar en un medio ácido fuerte (ácido sulfúrico). La etapa inicial del proceso
consiste en la protonación del grupo hidroxilo del colesterol, seguido de su deshidratación
para formar un ión carbonio 3,5-colestadieno. La oxidación secuencial de este ión
carbonio alílico por el sulfúrico produce un compuesto cromóforo, el colestahexano-ác.
sulfónico, que absorbe energía en la zona de la luz visible, a 410 nm.
MATERIALES Y MATERIALES
Vaso de precipitado 100 mL Agitador de vidrio
Vaso de precipitado 50 mL Tubos de ensayo (2)
Pipeta de 5 mL
PROCEDIMIENTO
1. Extracción de colesterol de la yema de huevo.
Cascar un huevo de gallina con precaución y separar la clara de la yema, teniendo
cuidado de no romper ésta. Decantar la clara y tomar 1 g de la yema, en un vaso de 50
ml. Añadir sobre la yema 5 ml de acetona fría y agitar con la varilla de vidrio, hasta
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38 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Dónde ha encontrado usted más colesterol, en la fracción A1 o en la A2? Por qué?
2. Consultar sobre los métodos enzimáticos para la determinación de colesterol.
3. Cuáles son los valores de referencia para el contenido de colesterol en sangre
humana.
4. Qué relación existe entre el contenido de colesterol y el riesgo de contraer
enfermedad vascular arteriosclerótica.
Enfermedad Vascular Arteriosclerótica
BIBLIOGRAFÍA
PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.
LÓPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de Ciencias.
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