para el estudio microscopico

El procedimiento más utilizado para el estudio microscópico de

los tejidos es la preparación de cortes histológicos.

Con el microscopio óptico o fotónico es posible estudiar la

imagen debido a que el corte histológico es atravesado por un
haz de luz.

A partir de tejidos y órganos en los que es necesaria una aplicación de procedimientos previos
para que se puedan seccionar mediante instrumentos de gran precisión, denominados
micrótomos.

Un artefacto histológico es un error producido durante el proceso de preparación del tejido, y

se hace evidente una vez que observamos el preparado en el microscopio.

Los pasos necesarios para la preparación de los tejidos observados en la microscopia óptica
incluyen:

• FIJACIÓN: Tratamiento del tejido con sustancias químicas que no solo retardan las
alteraciones hísticas post. a la muerte o a la remoción del organismo, sino que también
conservan su estado normal. Los fijadores más
comunes son: Formalina (Formaldehído al 4%
solución isotónica) y Glutaraldehído. El
formaldehído conserva la estructura general de
la célula y de los componentes extracelulares y
debido a que este no altera la
tridimensionalidad de las proteínas, mantienen
su capacidad de reaccionar con anticuerpos
específicos.

• DESHIDRATACIÓN Y ACLARAMIENTO: Debido a

que el agua representa una gran proporción del
tejido, se aplica una serie de baños de alcohol
para extraerla.
1) El tejido es introducido en diversos baños de
etanol en agua, desde etanol al 70% hasta
etanol al 100% para eliminar el agua. A este
proceso se le conoce como deshidratación.
 *Es importante que el tejido fijado no pase directamente a alcoholes de 100%, porque
la deshidratación sería muy enérgica apareciendo en el tejido espacios, donde no
existían en la realidad.*
2) El tejido es tratado con xileno, una sustancia química que es mezclable con parafina
fundida, a este proceso se le conoce como aclaramiento, ya que el tejido se torna
transparente en el xileno (el xileno sirve como eslabón entre el alcohol y la parafina).
3) Cuando se desea estudiar los lípidos en los tejidos, se aconseja el uso de cortes en
congelación debido a que la inmersión de los tejidos en disolventes como xilol provoca
la disolución de los lípidos.

• INCLUSIÓN: Con objetivo de distinguir entre las células superpuestas en un tejido y la

matriz extracelular, se debe incluir los tejidos en un medio apropiado y a continuación
seccionarlos en cortes delgados.
1) En microscopia óptica el medio habitual de inclusión es la parafina.
2) Para la inclusión el tejido se coloca en un recipiente adecuado con parafina fundida
hasta que se infiltra por completo.
3) Una vez que el tejido se impregna por completo con parafina, se coloca en un
receptáculo pequeño recubierto de parafina fundida y se deja endurecer para formar
un bloque que incluya el tejido.

• CORTE Y ADHESIÓN: Luego que los bloques estén listos se montan para seccionarlos.
1) Los bloques solidos se colocan en un micrótomo el cual pasa por el tejido endurecido
para obtener un corte del grosor deseado.
Para la microscopia óptica: el
grosor de cada corte fluctúa
entre 5 y 10 𝜇𝑚 (micrómetro).
2) Después de cada sección, para
poder colorear y observar los
tejidos ya cortados, estos
deben ser pegados en
portaobjetos muy limpios a
través de sustancias adhesivas
(solución acuosa de albúmina)
y posteriormente deben ser
estirados y secados.

• DESPARAFINADO E HIDRATACIÓN: A pesar de que los tejidos son muy delgados no es

posible distinguir las estructuras celulares ya que el tejido y las células están embebidos
en parafina. Para colorear y teñir los cortes, la parafina debe disolverse y extraerse con
xileno y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones de
alcohol decrecientes.

• TINCIÓN: Debido a que muchos constituyentes de los tejidos tienen casi las mismas
densidades optimas, deben teñirse para la microscopia óptica. La tinción apropiada debe
incluir sobre todo colorantes hidrosolubles.
1) Aunque existen varios tipos de colorantes para observar los múltiples componentes
celulares y tejidos, pueden agruparse en tres clases: colorantes que diferencian
componentes básicos y ácidos de la célula, colorantes especializados que distinguen
los componentes fibrosos de la MEC y sales metálicas que se precipitan en los tejidos y
 forman depósitos de metales en ellos.
2) Los colorantes empleados con más frecuencia en histología son hematoxilina y eosina
(H&E)

• MONTAJE: Para dejar una preparación permanente y definitiva, se coloca sobre el tejido
(ya diafanizado) una sustancia adhesiva y se cubre con un cubre objeto muy limpio y se
deja secar.

El procedimiento completo desde la fijación del tejido hasta su estudio con el

microscopio óptico puede requerir entre 12 hrs y 2 días y medio, según el tamaño del
tejido, el fijador y el medio de inclusión utilizados.
- La hematoxilina es una base que tiñe de manera preferencial los componentes ácidos de la
célula de un color azuloso/morado. Puesto que la mayor parte de los componentes ácidos son
ADN; ARN; núcleo y regiones citoplasmáticas ricas en ribosomas, estos se tiñen de color azul
oscuro y son denominados basofílicos.

- La eosina es un ácido que tiñe los componentes básicos de la célula de un color

rosado/naranjo. En virtud de que muchos constituyentes citoplasmáticos tienen pH básico, las
regiones del citoplasma se tiñen de tonalidad rosada y se dice que estos elementos son
acidófilos.

REACTIVO RESULTADO
Hematoxilina Azul: Núcleo, regiones ácidas del
citoplasma y matriz del cartílago.

Eosina Rosa: regiones básicas del citoplasma y

fibras de colágeno.

Tricómico de Masson Azul oscuro: núcleo.

Rojo: músculo, queratina, citoplasma.
Azul claro: mucinógeno, colágeno.

Colorante de Orceína (para fibras Pardo: fibras elásticas.

elásticas)
Colorante de Weigert (para fibras Azul: fibras elásticas
elásticas)
Tinción argénica Negro: fibras reticulares.

Hematoxilina ferrica Negro: estriaciones de músculo, núcleos,

eritrocitos

Ácido peryódico de Schiff Magenta: moléculas ricas en glucógeno y

carbohidratos.

Colorantes de Wright y Giemsa (tinción Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos.

diferencial de células sanguíneas) Azul: citoplasma monolitos y linfocitos.
 La parte de imagen con el identificador de relación rId14 no se encontró en el archivo.

La parte de imagen con el identificador de relación rId14 no se encontró en el archivo.

Tricómico de Masson Orceína Hematoxilina Férrica

Lengua de Rata Aorta Tejido muscular y nervioso

La parte de imagen con el identificador de relación rId14 no se encontró en el archivo.

Ácido Peryódico de Schiff

Candidiasis Esofágica.
 MICROSCOPIA ÓPTICA: El microscopio está constituido por partes mecánicas y partes
ópticas.

El componente óptico está formado por tres sistemas de lentes:

1. Condensador: Concentra la luz y proyecta un haz luminoso sobre la
muestra.
2. Objetivo: Proyecta una imagen aumentada del objetivo hacia el ocular.
3. Ocular: finalmente el ocular amplía todavía más la imagen y la proyecta
en la retina, en la pantalla, en un negativo fotográfico o en un detector
(Cámara CCD).

RESOLUCIÓN: Este permite amplificaciones totales de 40, 100, 400, 1000,

1500 y enfocan la imagen resultante en la retina del ojo.
La calidad de la imagen no solo depende la capacidad de un lente para amplificar, si no
también de su resolución: la capacidad de la lente para mostrar que dos objetos distintos están
separados por una distancia.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES Y DE INTERFACE INTERFERENCIAL: Para poder

observar una célula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y
hacerle una tinción, lo que implica, la muerte de la célula en cuestión.

Pero la microscopia de contraste de fases utiliza un sistema de lentes que

da lugar a imágenes visibles de estructuras casi transparentes; la luz
modifica su velocidad al atravesar estructuras celulares y extracelulares
que presentan índices de refracción distintos, y hace que las distintas
estructuras aparezcan más claras o más oscuras, lo que hace que este
tipo de microscopio una potente herramienta para la observación de
células vivas.

Otro instrumento que permite estudiar las células de los tejidos no teñidos es la microscopia de
contraste interferencial ( Microscopia de Nomarski), que da lugar a una imagen
aparentemente tridimensional.

MICROSCOPIA DE POLARIZACIÓN: El microscopio de polarización se basa en el empleo

de dos filtros polarizadores. El primero de ellos, el polarizador propiamente dicho, sirve
para generar un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace
incidir en la muestra. El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra
y el ocular. Cuando ambos polarizadores se encuentran cruzados, se extingue la luz
generada por el primer polarizador. Sin embargo, si la muestra contiene sustancias que
presentan anisotropía, se produce birrefringencia y esta puede detectarse.

*Cuando al atravesar un cuerpo, la velocidad de propagación de la luz no es la misma en todas

las direcciones, entonces se dice que dicho cuerpo presenta anisotropía.

*La capacidad que tienen las distintas estructuras de modificar el plano de vibración de la luz
polarizada, se denomina birrefringencia.
 MICROSCOPIA CONFOCAL: El microscopio confocal es un microscopio que emplea una
técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imágenes
tridimensionales utilizando un "pinhole" espacial para eliminar la luz desenfocada o
destellos de la lente en especímenes que son más gruesos que el plano focal.

El microscopio confocal moderno aprovecha las posibilidades de las fuentes de luz coherente
(laser, sistemas electromecánicos de barrido y sobretodo del procesamiento digital de
imágenes:

ü El láser permite que la estimulación de los colorantes fluorescentes sea con una luz
muy intensa.
ü El sistema de barrido permite que la estimulación no sea en toda la muestra a la vez
sino que solo es en áreas muy pequeñas, el área de estimulación (y de recepción) va
moviéndose a lo largo de toda la muestra (barrido) de modo que en un tiempo
determinado, tiempo de barrido, la totalidad de la muestra ha sido sondeada.
ü En un microscopio confocal coexisten tres fuentes de luz:
ü Lámpara de luz visible estándar de cualquier microscopio que nos permite localizar
muestras en campo claro o contraste de fases.
ü Lámpara de vapor de mercurio. Se suele usar para observar las muestras y localizar
aquellas zonas de interés para ser escaneadas en condiciones de confocalidad.
ü Láser. El más empleado es el de argón-kriptón que da tres líneas de salida. Es posible
montar simultáneamente varias fuentes láser. En las instalaciones donde existe más
de un laser, el segundo suele ser uno que emite en el ultravioleta.

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA: Cuando ciertas sustancias reciben la luz de una

cierta longitud de onda, emiten la luz cuya longitud de onda es mayor. Este fenómeno se
denomina fluorescencia.
En la microscopia de fluorescencia, los tejidos se iluminan generalmente con luz ultravioleta
y emiten luz en la porción visible del espectro, lo que hace que las sustancias fluorescentes
aparezcan con un color brillante sobre fondo oscuro.

La microscopía de fluorescencia incluso permite a los usuarios determinar la distribución de

una sola especie de molécula, su cantidad y su ubicación dentro de una célula. Se pueden
realizar estudios de colocalización e interacción, y se pueden observar las concentraciones
de iones y procesos intra y extracelulares como la endocitosis y la exocitosis.
 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA: La microscopia electrónica de transmisión y barrido
están fundamentadas en las interacciones entre los electrones y los componentes de
los tejidos.

1) MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISIÓN: