Redox Biology 8 (2016) 298–304

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Redox Biology
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Direct spectrophotometric measurement of supra-physiological levels of ascorbate in

plasma
VERIFICACIÓN ANALÍTICA PARA LA DETERMINACIÓN DE ABSORBANCIA,
CONCENTRACIÓN Y TRANSMITANCIA.

Karla S. Córdoba, Andrés Gómez, Valentina Ramírez, Isaac E. Vélez.

Departamento de ciencias básicas, Programa de microbióloga, Laboratorio de bioquímica, Universidad Santiago de Cali, Cuidad Cali,
Colombia.

1 Infoartículo 15 RESUMEN

2 Historia del informe: 16 La espectrofotometría es un método científico utilizado para determinar

3 Entregado 18/09/2019 17 cuánta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la
4 Contactar: valentina.ramirez09@usc.edu.co 18 luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra,
5 19 basándose en la Ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede
6 20 usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en una
7 Palabras claves: 21 sustancia. En la práctica se utilizaron los siguientes reactivos: azul de
8 Absorbancia 22 bromotimol (76-59-5), y rojo Congo (573-58-0), los cuales se mezclaron
9 Determinación espectrometría 23 con un amortiguador de fosfato para lograr un pH de 7,5. Luego, se
10 Ley de Beer-Lambert 24 realizó el procedimiento en el espectrofotómetro para determinar su
25 absorbancia máxima y su concentración, en donde se obtuvo una longitud
11 26 de onda máxima de 490 nm, una absorbancia de 0.554, y una
27 transmitancia de 27,9 %. La concentración se situó en 99.055 mg/L.
12
28
13 29 .
14

1 1. INTRODUCCIÓN. 20 solución pueden absorber radiaciones de la zona ultravioleta (λ=195-325nm), o

21 luz visible (λ=325-800nm). [1]
22 Entonces, con respecto a lo antes mencionado, si cada molécula de un analito
2 La espectrofotometría es una técnica analítica que se basa esencialmente en la 23 absorbe una radiación característica, la medida de toda la cantidad de moléculas
3 absorción de las radiaciones UV visibles por parte de las moléculas, lo cual tiene 24 da como resultado la concentración.
4 un gran uso para identificar y cuantificar tales moléculas o sustancias.
25 La transmitancia (T) de una solución es la relación entre la cantidad de luz
5 En general, la espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía 26 transmitida que llega al detector unas vez que ha atravesado la muestra (como se
6 radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la 27 ilustra en la siguiente ecuación):
7 radiación, y las mediciones a una determinada longitud de onda. 𝐼
8 Para saber esto se recurre a un instrumento versátil de laboratorio llamado 28 T= (1)
𝑙𝑜
9 espectrofotómetro, el cual se utiliza para diferentes determinaciones analíticas. 29 La transmitancia se expresa a menudo como porcentaje:
10 Está constituido por un foco de radiación visible o ultravioleta, que emite una 30 𝐼
%T= × 100
11 radiación que atraviesa un selector, que permite escoger una radiación de una 𝐼𝑜
12 longitud de onda (λ) concreta. 31 La absorbancia (A) se calcula a partir de la medida experimental de la radiación
13 La radiación seleccionada incide sobre la muestra contenida en una cubeta 32 incidente y de la transmitida:
𝐼
14 transparente, una parte de la radiación es absorbida, mientras el resto es 33 A=-log T=log (2)
𝐼𝑜
15 transmitida y se mide con un detector (como se muestra en la ilustración 1).
34 Ahora, para saber la concentración de la sustancia se halla relacionada con la ley
35 de Beer-Lambert: A=a×b×C, en donde b es el espesor de la cubeta, y a es la
36 absortividad específica, que es la característica para cada analito pero depende
37 de la longitud de onda de la radiación absorbida y de las características de la
38 solución que contiene el analito. Para el análisis cuantitativo se realiza una recta
39 de calibrado con patrones. [1]
40
16 41 Curva de calibración
17 Ilustración 1: Funcionamiento de un espectrofotómetro. 42 Este grafico representa ondulaciones con máximos y mínimos. Para hacer
43 las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda
18 Cada molécula, en función de su configuración, puede absorber unas radiaciones 44 correspondiente a un máximo, pues el error de medición es mínimo y la
19 específicas, las cuales se caracterizan por su longitud de onda. Las moléculas en 45 sensibilidad máxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se
 Córdoba Santander, K.S Gómez Martínez A. Ramírez Gutiérrez V. Vélez Bueno I. E. 2019

46 debe realizar la curva de calibración, que es la absorbancia en función de Tabla 2: Comprobación de la ley Beer-Lambert. Variación de la
47 concentración. absorción con relación a la concentración.
48 La práctica tiene como objetivo efectuar el espectro de absorción de luz
49 visible de varias sustancias, también determinar longitud de onda de máxima
50 absorción de cada una de las sustancias, para luego comprobar y aplicar la
51 ley de Beer-Lambert; por último, tener un manejo óptimo de un
52 espectrofotómetro. [2]
53
54

55 2. MATERIALES Y METODOLOGÍA.

56 2.1 SOLUCIÓN PROBLEMA.

82

57 Se prepararon dos tubos de ensayo: el primero contenía 10 ml de agua

58 destilada, la cual cumplía la función de ser el blanco para la 83
59 espectrofotometría. El segundo contenía 1ml de azul de bromotimol (76-59-
60 5). Luego se adicionaron 1 ml de rojo Congo (573-58-0), y 1 ml de
0,6
61 amortiguador de fosfato pH 7,5 y 7 ml de agua destilada (7732-18-5).
0,5
62 2.2 COMPROBACIÓN LEY DE BEER-LAMBERT.

ABSORBANCIA
0,4
63 Para la comprobación de la ley de Beer-Lambert se prepararon las
64 respectivas soluciones, tal como se muestra en la tabla 2: en la solución del
0,3
65 tubo 1 se tomaron 0,25 ml de la solución problema, y luego se le añadieron
0,2
66 9,75 ml de agua destilada; y así consecutivamente se prepararon el resto de
67 los tubos de ensayo. 0,1

68 2.3 ESPECTROFOTÓMETRO. 0
400 430 460 490 520 550 580 610 640 670 700
69 Para obtener la absorbancia y la transmitancia primero se montó el blanco, LONGITUD DE ONDA
70 el cual consistía en añadir 1 ml de agua destilada (7732-18-5) en un tubo 84 3.1.2 GRAFICAS.
71 para espectrofotometría, con una pipeta de 1 ml, y luego se montó 1 ml de
72 la solución problema el cual se colocó después del blanco, el cual era el agua Ilustración 2: Absorbancia vs longitud de onda mezcla de azul de
73 destilada. Al utilizar el espectrofotómetro las longitudes de onda iban bromotimol y rojo Congo pH 7,5
74 cambiando de 30 en 30 nm, se utilizó de 400 a 700 nm. Se procedió a hacer
75 lo mismo con la comprobación de la ley de Beer-Lambert. 0,25
y = 0,0054x + 0,0191
ABSORBANCIA

0,2 R² = 0,9461
76
0,15
77 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
0,1
78 3.1.1 TABULACIÓN.
0,05

79 Tabla 1: Azul de bromotimol y rojo Congo pH 7,5 0

0 10 20 30 40 50
Longitud de Transmitan CONCENTRACIÓN
onda (nm) Absorbancia cia
400 0,279 52,40% 85
430 0,346 45,10%
Ilustración 3: Comportamiento de la ley Beer-Lambert azul de
460 0,449 35,50%
bromotimol y rojo Congo pH 7,5
490 0,554 27,90%
520 0,491 32,20% 86 3.1.3 ECUACIONES.
550 0,329 47%
580 0,214 61,20% 87 𝑌 = 0,0054𝑥 + 0,0191 (3)
610 0,18 60,50% 88 0,554 − 0,0191 = 0,0054𝑥
640 0,153 70,30% 89 0,5349 = 0,0054𝑥
670 0,045 90,20% 0,5349
90 =𝑥
0,0054
700 0,172 67,30%
80 91 𝑥 = 99,055𝑚𝑔/𝐿
92 La concentración que tiene la máxima longitud de onda de 490nm es de
93 99,055mg/L donde su absorbancia es de 0,554, como se muestra en la
81
94 tabla 1.
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95 𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 (4) 145 que la absorbancia está relacionada linealmente con la concentración de las
𝐶1 × 𝑉1 146 sustancias absorbentes y con la longitud de la trayectoria de la radiación.
96 = 𝐶2 (5)
𝑉2 147 Se debe tener en cuenta que el azul de bromotimol y rojo Congo con pH 7,5
100𝑚𝑔/𝐿 × 0,25𝑚𝑙 148 se encuentra en una región visible, la cual se puede apreciar el color
97 = 2,5𝑚𝑔/𝐿 (6
10𝑚𝑙 149 visualizado en una solución y corresponde a una longitud de onda especifica
100𝑚𝑔/𝐿 × 0,5𝑚𝑙 150 que la transmite, mas no que la absorbe. El color absorbido es
98 = 5𝑚𝑔/𝐿(7) 151 complementario al color que se visualiza. Esto quiere decir que es necesario
10𝑚𝑙
152 utilizar una longitud de onda en la que la onda de luz de una solución sea
153 coloreada.
100𝑚𝑔/𝐿 × 1,0𝑚𝑙
99 = 10𝑚𝑔/𝐿(8) 154 A su vez, la ley de Beer-Lambert dice que la absorbancia de una solución es
10𝑚𝑙
155 directamente proporcional a su concentración, que a mayor número de
100
156 moléculas mayor interacción de luz habrá entre ellas; también varía que la
100𝑚𝑔/𝐿 × 10𝑚𝑙
101 = 15𝑚𝑔/𝐿 (9) 157 distancia que recorre la luz por la solución es igual a la concentración, cuanto
1,5𝑚𝑙 158 mayor distancia de luz recorre en la muestra se encontrara más moléculas.
100𝑚𝑔/𝐿 × 2,0𝑚𝑙 159 [5] Se demuestra la teoría de Beer-Lambert absorbancia vs concentración
102 = 20𝑚𝑔/𝐿(10)
10𝑚𝑙 160 (grafica 2) también obtener la pendiente de la gráfica mencionada con
100𝑚𝑔/𝐿 × 3,0𝑚𝑙 161 anterioridad se dice que cuando la máxima longitud de onda es 490nm su
103 = 30𝑚𝑔/𝐿(11)
10𝑚𝑙 162 concentración será 99,055mg/L (ecuación 3).
100𝑚𝑔/𝐿 × 4,0𝑚𝑙 163
104 = 40𝑚𝑔/𝐿(12)
10𝑚𝑙
105 Las concentraciones que se muestran en las ecuaciones 6-12 se ven
164 4. CONCLUSIONES.
106 reflejadas en la tabla 2.

165 Por medio de esta práctica se logró aprender el manejo del

107 3.2 DISCUSIÓN.
166 espectrofotómetro de absorción utilizando sustancias que presentan color,
167 y que por medio de la espectrofotometría se puede observar la región de
108 Al realizar el riguroso análisis de los resultados obtenidos durante la 168 absorbancia en determinada longitud de onda; también se logró determinar
109 práctica, se observó que para la mezcla de bromotimol y rojo Congo a pH 169 la longitud de onda de máxima absorbancia de cada sustancia.
110 7.5 se presentaron diferentes resultados en cuanto a la transmitancia y 170 La precisión en el resultado es fundamental para obtener credibilidad y
111 absorbancia al cambiar la longitud de onda en el espectrofotómetro. De 171 utilidad en el ámbito científico, por tanto, se debe tener en cuenta que al
112 acuerdo a su absorción y longitud de ondas (Gráfico 1), se demuestra que la 172 momento de colocar las cubetas para la lectura en el espectrofotómetro estás
113 máxima longitud de onda fue de 490 nm, con una absorción de 0,554 (Tabla 173 deben estar limpias, de lo contrario, las muestras se pueden contaminar
114 1), para la solución problema. Se dice que cada color absorbe energía de una 174 arrojando así resultados erróneos.
115 radiación electromagnética y puede sufrir varios tipos de excitación como, 175 El grado de concentración de una sustancia incide de manera directa en el
116 por ejemplo, excitación electrónica, excitación rotacional, excitación que
176 resultado, así, en cada uno de los 8 tubos que contenían la mezcla se dio una
117 induzca cambios del spin nuclear, excitación de deformación de enlace, etc.
118 Incluso, puede producirse ionización si la energía disponible es del orden 177 absorbancia diferente, como puede observarse en la Tabla 2, es decir, la
119 del potencial de ionización de la molécula y consigue expulsar un electrón. 178 mezcla cambia su capacidad de absorción si la concentración es diferente.
120 Todas estas absorciones aparecen en regiones diferentes del espectro 179 Se puede inferir entonces que la absorbancia es directamente proporcional a
121 electromagnético, puesto que cada modo de excitación requiere una cantidad
122 específica de energía. [3] 180 la concentración: entre más alto sea el grado de concentración de la
181 sustancia, mayor será su absorbancia.
123 Se obtuvieron resultados favorables, ya que todos estos están por debajo de
124 1,0. Para realizar correctamente la medición de la sustancia problema, la cual 182 Referencias.
125 era el azul de bromotimol y rojo Congo con pH 7,5, se deben tener ciertas
126 medidas con el espectrofotómetro, lo cual consiste en poner los tubos de
127 espectrofotometría de frente para verificar que la cantidad contenida no 183 [1] Anónimo, “Determinación Espectrofotometría de pKa”
128 rebase 1 ml de agua destilada y de sustancia. 184 Licenciatura en Química, Química Analítica III Universidad Nacional de
185 La Plata.
186 [2] Ricardo Daniel Delgado. (2017). Informe Espectrofotometria.
129 Luego, se procedió a realizar la comprobación de la ley de Beer-Lambert,
187 Retrieved September 15, 2019, from
130 en donde se pudo observar la variación de la absorbancia en relación con la
188 https://es.calameo.com/read/004518311fab360583904 (Ricardo Daniel
131 concentración. Mediante estos dos procedimientos, se pudo hallar sentido a
189 Delgado, 2017)
132 la teoría ondulatoria de la luz, la cual dice que la luz de una cierta longitud
133 de onda está asociada con los fotones, los cuales cada uno tiene una cantidad 190 [3] Cava Allinger. (2016). Ind. Espectrofotometría, 287, 1355.
134 definida de energía; en consecuencia, al momento de la transmitancia los 191 Retrieved from https://ifdc6m-
135 fotones interaccionan con las partículas absorbentes, con lo cual la potencia 192 juj.infd.edu.ar/aula/archivos/repositorio//0/195/Allinger_Cava_-
136 del haz es atenuada y, por consiguiente, la absorbancia cambia, todo esto 193 _Quimica_Organica.pdf
137 debido a la concentración de la sustancia. 194 [4] (Colorimetría y espectrofotometría, n.d.)Colorimetría y
138 Para llevar a cabo la etapa de calibración, se presentó la absorbancia de las 195 espectrofotometría. (n.d.). Retrieved from
139 muestras conocidas a la longitud de onda de máxima absorbancia frente a la 196 http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp04.pdf
140 concentración de dichas muestras. De esta manera, se obtuvo la curva de 197 [5] Walton & Reyes, 1978)Walton, H. F., & Reyes, J. (1978). Análisis
141 calibración (gráficas 1 y 2). Esto fue entonces lo obtenido al graficar la 198 químico e instrumental moderno. Retrieved from
142 relación concentración vs absorbancia (gráfica 2), en la cual se observó que 199 https://books.google.com.co/books?hl=es&lr=&id=htRP2dHJkXgC&oi=f
143 la segunda aumentaba a medida que aumentaba la primera, lo cual denota 200 nd&pg=PR5&dq=Walton+%26+Reyes,+1983&ots=zpPp0592v-
144 un comportamiento lineal (regido por la ley de Beer) [4]. Esto muestra 201 &sig=ND6iU4RzqhL0usDJVwkQrhr6WQ8#v=onepage&q&f=false
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