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Manual de Técnicas para Análisis Microbiológico de Alimentos-Version Final 2009 PDF
Manual de Técnicas para Análisis Microbiológico de Alimentos-Version Final 2009 PDF
MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
1
Índice
Índice ___________________________________________________________ 2
Agradecimientos _________________________________________________ 4
Introducción _____________________________________________________ 5
SECCIÓN 2. ANEXOS.
2
Tinciones______________________________________________________ 192
3
AGRADECIMIENTOS
A todos los profesores y colegas que en algún momento nos orientaron e hicieron
sugerencias para mejorar este trabajo.
4
INTRODUCCIÓN
Este manual, que dedicamos con todo afecto a nuestros estudiantes, tiene como
propósito apoyarlos en su formación, para adquirir conocimientos, aptitudes y actitudes,
en especial en aspectos de control analítico en el campo de la microbiología de
alimentos. Hemos tratado de impulsar el desarrollo de un criterio en el área, que
permita a los profesionales que pronto serán, actuar como individuos críticos, capaces
de elaborar y/o cambiar normas de calidad existentes, que ayuden a garantizar la Salud
Pública.
Esperamos sinceramente que el manual sea útil para nuestros estudiantes, que son
quienes dan sentido a nuestro trabajo y esfuerzo diario. Todos los autores estamos
abiertos a sus comentarios, especialmente a aquellos que nos permitan mejorar nuestro
trabajo docente, a través de este material didáctico, y de las clases.
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Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de
alimentos para su análisis microbiológico.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
El muestreo debe diseñarse de tal forma que permita tomar una muestra representativa
del alimento por analizar, así como la recolección de cualquier dato útil. Otro aspecto
importante que se debe tomar en cuenta es la estandarización de los métodos de
prueba para asegurar reproducibilidad, precisión y exactitud en los resultados. Las
cuentas numéricas de microorganismos pueden variar considerablemente de acuerdo
con la técnica analítica desarrollada, así como con los medios de cultivo utilizados en la
misma, entre otros factores; esta variabilidad se elimina utilizando el mismo método de
dilución, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubación, etc., de aquí la
importancia de la aplicación de las Normas Oficiales. Finalmente la evaluación de la
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higiene del producto y la aceptabilidad por parte del consumidor, pueden seguirse
apropiadamente sólo si se tiene el historial del mismo.
En el diseño del plan de muestreo es muy importante que toda persona implicada en la
recolección y envío de las muestras, así como el personal del laboratorio y los analistas
que realizan la interpretación de los resultados sean consultados en las primeras etapas
del muestreo y análisis microbiológico de las muestras, por lo tanto deberán definirse
claramente los objetivos del análisis para evitar pérdida de tiempo y esfuerzo. Todos los
análisis microbiológicos tienen sus limitaciones y éstas se deberán tener presentes
antes de tomar cualquier acción.
Para asegurar la representatividad del producto por analizar, otro aspecto importante
durante el muestreo es que la toma de muestras se realice aleatoriamente en cada lote.
Es indispensable tener un control microbiológico de los contenedores usados en la
toma de muestras lo cual se logra manteniendo uno de ellos vacío, pero expuesto a las
mismas condiciones de recolección de la muestra; también se debe considerar que de
acuerdo a la capacidad de estos recipientes y la cantidad de muestra tomada de cada
envase correspondiente a un lote, será el número que de ellos se necesite; en el
aspecto cuantitativo una muestra unitaria consiste de un mínimo de 100 g de alimento.
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Las condiciones de conservación, transporte, tiempo comprendido entre la recolección
de la muestra, su entrega en el laboratorio, así como la realización del análisis influyen
notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población microbiana puede sufrir
cambios cualitativos y cuantitativos, esto es apreciablemente cierto en los productos
perecederos.
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tiempo. No se deberán congelar los productos refrigerados. Enfriar en hielo entre 0-4 C
las muestras refrigeradas, excepto las de mariscos y moluscos bivalvos y colectarlas en
un contenedor con refrigerante capaz de mantener la temperatura de la muestra entre
0-4 C hasta su llegada al laboratorio. A menos que se especifique de otra manera, las
muestras refrigeradas en general no deberán ser analizadas en un lapso mayor a 36 h
después del tiempo de recolección. Empacar las muestras de moluscos bivalvos
desconchadas en hielo frapé hasta su análisis. Mantener los mariscos en un intervalo
de temperatura entre 0 y 10°C. Examinar los mariscos o moluscos bivalvos en un
período de 6 h y no más de 24 h después de que se hayan recolectado.
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Si fuera necesario transferir las muestras al recibirlas en el laboratorio, deberán
colocarse en contenedores adecuados y emplearse las técnicas de asepsia al abrirse.
El contenedor deberá estar desinfectado con alcohol al 70%, si es necesario, para
evitar la contaminación de la muestra. Otros lotes de un producto similar pueden
proporcionar un historial útil y deberán evaluarse junto con cualquier muestra
sospechosa. Los siguientes detalles deberán acompañar al formato:
Tan pronto como la muestra de alimento llega al laboratorio, el analista deberá anotar
las condiciones físicas generales de la misma. Si la muestra no puede ser analizada
inmediatamente, deberá ser almacenada como se describe posteriormente. Si la
muestra va a ser analizada para fines regulatorios, para investigación de un brote por
consumo de un alimento, o para una inspección bacteriológica, es esencial el
seguimiento estricto a las recomendaciones descritas a continuación.
B. Recibo de muestras.
2. Etiquetado e Historial. Cada muestra debe estar sellada con tapa y acompañada de
un reporte de recolección completo (como el que se indicó anteriormente) y
registrarse el número de muestra y la fecha. Asignar a cada muestra unitaria un
número individual y analizarla separadamente a menos de que se trate de una
muestra compuesta descrita en el capítulo anterior.
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4. Almacenamiento. Si es posible, examinar las muestras inmediatamente después de
recibirlas. Sin embargo, si el análisis debe ser pospuesto, almacenar las muestras
congeladas a -20 C hasta su realización. Refrigerar las muestras perecederas no
congeladas de 0-4 C por un periodo máximo de 36 h. Los alimentos no perecederos,
enlatados o de baja humedad se almacenarán a temperatura ambiente hasta el análisis.
C. Descongelado.
Utilizar una técnica aséptica para el manejo del producto congelado. Antes de
manipular o analizar la muestra de alimento, limpiar las áreas de trabajo y áreas
circundantes. Aunado a lo anterior humedecer el área de trabajo y las áreas
circundantes con un agente germicida comercial. De preferencia no descongelar las
muestras antes del análisis. Si es necesario atemperar la muestra congelada para
tomar una porción analítica, descongelar en el empaque original o en el contenedor en
el que se recibió en el laboratorio. Cuando sea posible, evitar la transferencia de la
muestra a un segundo contenedor para descongelar. Normalmente la muestra puede
ser descongelada de 2 a 5 C en 18 h. Si se desea un descongelado rápido, someta la
muestra a un baño regulado a 45 C por un tiempo no mayor a 15 min.
D. Mezclado.
E. Pesado.
F. Homogenización y dilución.
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total de la pipeta, por ejemplo, no use pipetas con un capacidad mayor a 10 mL para
medir volúmenes menores a 1 mL; para medir volúmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas
con una capacidad mayor a 1 mL. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL
de diluyente estéril y 10 mL de la dilución previa a menos que se especifique de otra
manera. Mezclar todas la diluciones vigorosamente 25 veces en un arco de 30 cm. en 7
s. No deben excederse más de 15 min. Desde el licuado de la muestra hasta que las
diluciones correspondientes sean vertidas en el medio de cultivo adecuado.
12
Análisis Microscópico de Alimentos.
Si se sospecha que un alimento ha sido el causante de una infección o toxiinfección o
se ha deteriorado, se debe usar el producto original o una dilución baja del mismo.
Preparar un frotis para un examen microscópico directo. La tinción de Gram y la
morfología celular de la bacteria en el frotis puede indicar la necesidad de otro tipo de
evaluaciones. Realizar un examen microscópico incluso si el alimento sufrió tratamiento
térmico y los microorganismos podrían estar inactivados. Un gran número de cocos
Gram-positivos en el frotis podría indicar la presencia de enterotoxina estafilocóccica, la
cual no se destruye por los tratamiento térmicos que eliminan las cepas de
Staphylococcus aureus enterotoxigénico. Un gran número de bacilos Gram-positivos
esporulados en un alimento congelado podría indicar la presencia de Clostridium
perfringens, un organismo que es sensible a bajas temperaturas. Otros bacilos Gram-
positivos esporulados como Clostridium botulinum o Bacillus cereus podría también
estar presente en el alimento. Cuando el examen microscópico del alimento en cuestión
revela la presencia de muchos bacilos Gram-negativos, considerar los síntomas y
períodos de incubación reportados para la enfermedad bajo investigación y seleccionar
el método de examen específico para el aislamiento de uno o más de los siguientes
géneros: Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio o Campylobacter.
MATERIAL Y EQUIPO.
PROCEDIMIENTO
Preparar un frotis de la muestra molida del alimento (dilución 10-1). Permitir que el frotis
seque con el aire y fíjar con calor moderado pasando los frotis rápidamente 3 ó 4 veces
sobre un mechero Bunsen o Fisher. Opcionalmente, secar los frotis al aire y fijarlos con
metanol 1-2 min., eliminar el exceso de metanol y flamear o secar al aire.
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Enfríar a temperatura ambiente antes de teñir. Desengrasar los frotis de alimentos con
alto contenido en grasas sumergiéndolos en xileno 1-2 min., eliminar éste, lavar con
metanol, eliminar y secar.
Teñir el frotis con el método de Gram. Usar un microscopio equipado con objetivo para
aceite de inmersión (95-100X) y ocular 10X; ajustar la iluminación al óptimo. Examinar
al menos 10 campos de cada frotis, anotando los tipos de microorganismos
predominantes, especialmente las formas de tipo Clostridia (bacilos Gram-positivos),
cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos.
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Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994 “Procedimiento para la
toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico”
OBJETIVOS:
MATERIAL Y EQUIPO
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Hielo o bolsas refrigerantes.
Bata, cofia, cubreboca y guantes estériles.
Autoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada a 121 ± 1°C.
Horno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C.
Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperaturas de
alimentos con rangos de -40 a 100°C, con intervalos no superiores a 1°C.
PROCEDIMIENTO
2. Toma de muestra
A. Obtención
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3. Tratándose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir éstos y
extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación
microbiana.
4. Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren
precauciones estrictamente asépticas.
5. Cuando se requiera tomar muestras asépticamente, éstas no deben tomarse en
áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las
mismas.
6. La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los
recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de
introducir ésta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar
que la tapa se contamine colocándola sobre un trapo estéril desechable.
7. Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin
deberá ser diferente de la que se envía para su análisis.
8. Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que
la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los
recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. Los
alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la
temperatura en que se muestrearon, esto únicamente si el traslado es menor a una
hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en
condiciones de refrigeración.
9. En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta
conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes
niveles.
10. En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse
con ayuda de utensilios estériles como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc.
11. En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para
obtener una muestra representativa.
12. Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de
una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras
fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
B. Productos perecederos
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C. Impugnación
D. Identificación de la muestra
E. Conservación y transporte
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7. Las muestras que se entreguen al laboratorio deberán acompañarse de un informe
que además de contener la identificación de la muestra, incluya los siguientes datos:
1. Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante, representante
y/o distribuidor.
2. Indicar nombre genérico y específico del producto, así como la marca comercial y
cualquier otra información que se considere importante.
3. Observaciones, en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se
encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra, o algún otro dato
que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean
necesarios.
4. La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales
que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no
decida llevar a cabo su impugnación.
RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
19
Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico
OBJETIVOS
Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio, así como las
diluciones que les permitan investigar su contenido microbiológico.
Determinar el número de diluciones adecuado, con base en las características y
datos de la muestra y de los microorganismos que serán investigados.
GENERALIDADES
Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las
necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos
diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga
microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el
20
número de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y
del proceso, e incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la
experiencia con cada tipo de muestra.
El buen resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en
lo posible, por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar
cuidadosamente las condiciones.
FUNDAMENTO
Posterior a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria
cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto
en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así
lograr una distribución lo más uniforme posible, de los microorganismos contenidos en
la muestra destinada al análisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la
recuperación de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se
cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para
iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así como para
favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.
NOTAS
21
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se inoculan las diluciones en los medios de cultivo,
no debe exceder de 20 minutos.
MATERIAL Y EQUIPO
NOTA
a
Material necesario al inicio de la práctica
22
PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
23
PROCEDIMIENTO
1.1. Muestras líquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc. en las
cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente
homogeneizable por medios mecánicos como agitación)
NOTAS
24
constituyentes que no se dispersen fácilmente; sólo debe utilizarse cuando
exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados
obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
NOTAS
En todos los casos, si la cantidad disponible de muestra no permite tomar 10 mL o
g, la dilución primaria puede hacerse con 1 mL de muestra en 9 de diluyente.
Después se prosigue como se indica para las diluciones adicionales.
NOTAS
25
En todos los casos, deben de prepararse las diluciones que permitan obtener
resultados dentro del rango de sensibilidad del método, por lo menos en una
de tres diluciones; como el rango de sensibilidad del método generalmente va
de n a 10n (de 15 a 150 ó de 25 a 250 colonias, por ejemplo), el obtener
resultados dentro del rango en 2 diluciones subsecuentes se considera
evidencia de que s ha logrado la distribución uniforme y se han controlado los
factores de variación.
Staphylococcus aureus en
placas extendidas en agar Baird Parker 15 a 150 colonias / placa
RESULTADOS
26
factor de dilución es 103. Si se usó otra proporción en las diluciones, el inverso de
la proporción en que se diluyó será el factor de dilución.
BIBLIOGRAFÍA
Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) “Culture Methods for
Enumeration of Microorganisms”. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 53-67.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
27
Cuenta en placa de bacterias
OBJETIVOS
GENERALIDADES
FUNDAMENTO
28
UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las
diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de
cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y
dilución de muestras de alimentos para su análsis microbiológico”.
NOTAS
MATERIAL Y EQUIPO
29
Stomacher (homogeneizador peristáltico) a
Bolsas estériles para Stomacher a
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador b.
Registrador mecánico o electrónico b
Microscopio óptico b
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica
b
Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica
30
CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS
Homogeneizar la muestra
y el agar mediante Incubar las cajas en
movimientos rotatorios posición invertida
Contar aquellas placas que tengan
entre 25 a 250 colonias y reportar
como UFC/g o mL de muestra
24 a 48 h /
37°C
31
PROCEDIMIENTO
3. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.
1. Distribuir las cajas con el medio estéril en la mesa de trabajo de manera que la
inoculación se pueda realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las
cajas con los datos pertinentes antes de inocular.
32
3. Cuando es necesario utilizar el método de extensión en superficie pero se
esperan cuentas bajas, se pueden utilizar de 3 a 5 cajas de Petri con el medio
de cultivo, y sembrar 1 mL de la muestra líquida (o de dilución 10-1),
repartiendo el volumen en las 3 (ó 5) cajas, es decir, sembrando 0.3+0.3+0.4
mL (ó 0.2 mL en cada una de 5 cajas).
4. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.
CUADRO 1.
Condiciones de incubación para cuenta en placa de diferentes grupos
Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubación
Termofílicos 55 ± 2ºC 48 ± 2 h
Mesofílicos 35 ± 2ºC 48 ± 2 h
RESULTADOS
La selección de las cajas que se toman en cuenta para los cálculos es muy
importante para la confiabilidad de los resultados; a continuación se especifican
las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la selección
de cajas obedece a criterios:
lógicos (elegir las que están en rango),
estadísticos (considerar los duplicados y el mayor número posible de datos) y
funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores disponibles).
33
Las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes:
34
Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que se
diferencian claramente de otras.
Colonias como película en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.
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CUADRO 2.
Ejemplos para el cálculo de resultados de cuenta en placa, utilizando ensayos por duplicado.
(Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias)
Serie Diluc iones Resultado
-2 -3 -4
Ejemplo duplic. 10 10 10 UFC. / g o mL Observaciones
1 A > 250 178 16 18 x 104 Si están dentro del rango, se promedian los datos de la
dilución 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104)
B > 250 190 17
2 A > 250 220 25 23 x 104 En este caso se promedian datos de diluc. 10-3 (= 179 x
103,pasa a 180 x 103 ó 18 x 104). Por otra parte se promedia
datos de dilución 10-4 (= 27 x 104). Finalmente se promedian
los resultados de ambas diluciones y se redondea el
B > 250 138 28 resultado final
3 A 18 2 0 16 x 102 Se promedian datos de diluc. 10-2 ; aunque están fuera de
B 14 0 0 valor estimado rango, son los más cercanos. Se anota “valor estimado”
4 A > 250 > 250 512 50 x 105 Se toma la más alta que se pueda contar, aunque sea en
B > 250 > 250 495 valor estimado cuadrantes o cuadrícula y se anota “valor estimado”.
5 A > 250 240 34 24 x 104 Se ignora la dilución 10-4 por el crecimiento extendido; se
B > 250 235 Crecim promedian los datos de 10-3, se redondea 237.5 a 240.
extend.
6 A 0 0 0 < 100 Se reporta como < 1 en la dilución más baja que se utilizó,
B 0 0 0 valor estimado en este caso 10-2. Se registra como “sensibilidad del método”.
7 A > 250 240 24 25 x 104 Se promedia el único dato que está dentro del rango (240),
B > 250 268 19 con su duplicado, aunque éste salga del rango (268).
8 A > 250 216 23 28 x 104 Se consideran las placas que están dentro del rango y se
B > 250 262 42 promedian con sus duplicados, aunque éstos salgan.
Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones
9 A > 250 215 20 23 x 104 Se promedian datos de 10-3 , se promedian datos de 10-4
B > 250 235 26 se realizan los cálculos como en el ejemplo 2
Las cifras y recuadros resaltados en negritas son las que se consideran adecuadas para realizar los cálculos.
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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) “Culture Methods for
Enumeration of Microorganisms”. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 53-67.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
37
Determinación de coliformes totales por cuenta en placa
OBJETIVOS
GENERALIDADES
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FUNDAMENTO
NOTAS
Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa
de coliformes, debe considerarse lo siguiente:
Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos
pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando
colonias semejantes a las de coliformes.
El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar
antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe
colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento
de utilizarlo.
Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han
solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas
para los coliformes.
El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de
incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la
formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.
El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de
sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.
El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al
diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con
las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.
39
6 a 10 tubos de ensayo sin labio, de 16 x 150 con 5.0 mL de agar bilis rojo
violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 30.0 a 50.0 mL. a
MATERIAL Y EQUIPO
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica
b
Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la práctica
40
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA
1.0 mL 1.0 mL
1.0 mL
41
PROCEDIMIENTO
42
Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias
de 10.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
43
Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes
fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo
múltiple (Número más Probable o NMP)
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Éstos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido
un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos
microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.
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44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
prominente es Escherichia coli.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC, por sus siglas en inglés), E. coli enteropatógena (EPEC),
E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras
cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las
4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y
alimentos contaminados.
FUNDAMENTO
45
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por un periodo de
24 a 48 h.
Invasiva
- - - +
Intiminas
- + + -
Enterohemolisina - - + -
46
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
47
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Balanza granatariaa.
Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d
Asa bacteriológicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio ópticod
Termómetro calibradob
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b
Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
Autoclavea
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
48
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
37°C
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37°C 44.5°C
24 – 48 h
24 – 48 h
-
1.0 mL 1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilución en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1 10-2 10-3
35°C
24 - 48 h
35°C 44.5°C
24 - 48 h 24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en Tubos con 10.0 mL de Lectura de tubos positivos en
Caldo Lactosa verde tablas. NMP de coliformes Caldo EC o EC-MUG tablas. NMP de coliformes
brillante bilis 2% totales /g de muestra fecales /g de muestra.
Siembra de tubos positivos en
agar Mac Conkey para
50 búsqueda de Escherichia coli
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
51
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en
2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.
52
a. Producción de indol (I)
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con medio SIM,
incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2
mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser,
se considera una prueba positiva.
53
NOTAS
Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta.
Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono,
también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil- -D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de
gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de
confirmación EC-MUG.
Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de
gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
Finalizado el periodo de incubación, Irradiar los tubos con una fuente de luz UV,
observar fluorescencia y hacer la lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
54
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
2. Alimentos
Realizar 2 diluciones decimales más usando tubos con 9.0 mL de agua peptonada
al 0.1 %.
Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.
55
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y
producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una
de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales
biliares.
56
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
57
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos 95% de Límite de Confianza (aproximado)
positivos NMP/100 mL Inferior Superior
0 <1,1 0 3,0
1 1,1 0,05 6,3
2 2,6 0,3 9,6
3 4,6 0,8 14,7
4 8,0 1,7 26,4
5 >8,0 4,0 Infinito
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos 95% de Límite de Confianza (aproximado)
Positivos NMP/100 mL Inferior Superior
0 <1,1 0,0 3,0
1 1,1 0,03 5,9
2 2,2 0,26 8,1
3 3,6 0,69 10,6
4 5,1 1,3 13,4
5 6,9 2,1 16,8
6 9,2 3,1 21,1
7 12,0 4,3 27,1
8 16,1 5,9 36,8
9 23,0 8,1 59,5
10 >23,0 13,5 Infinito
Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporción de los tubos positivos de la prueba
confirmatoria en caldo EC.
58
BIBLIOGRAFÍA
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz.
Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
59
Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como carbohidratos incluyendo
pectinas y otros polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden
causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas) y (b)
habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias
patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las
superficies de alimentos.
60
Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas
pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas o
en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles o
hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos:
septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no
septados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin tabiques
transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del cilindro y se
les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados
órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o “anclajes” de los
géneros Rhizopus o Absidia, la célula basal del género Aspergillus y la ramificación
dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum.
Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación. Se diseminan fácilmente por la
atmósfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos
principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3)
esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas fértiles
denominadas conidióforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro
de ningún receptáculo, en contraposición a las esporangiosporas, las cuales se
encuentran dentro de un esporangio o receptáculo, situado en el extremo de una hifa
fértil, el esporangióforo. Las artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El
extremo engrosado del esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas
en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios
comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula
especializada, el esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo.
61
Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción
industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen
en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad
para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial
de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación
de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas.
62
sin duda la más importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum, P.
viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o
trigo, o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es
posteriormente consumida por humanos.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales.
Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos,
vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos
fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración del
sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las
carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las
colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única
forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son
húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas
tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad
metabólica es a la vez de ambos tipos.
63
Algunos géneros de importancia en alimentos son:
Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas
en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color
rosado en el sauerkraut.
64
FUNDAMENTO
NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y
cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya
que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo
microbiano.
MATERIAL Y EQUIPO
65
Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a.
Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón a.
Pipetas Pasteur estériles a, b
Propipetaa, b
Cajas de Petri estériles (una se utiliza para pesar la muestra) a.
Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas,
tenedores, etc. a
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 1°C a.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida a
45 1°C a.
Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b.
Microscopio óptico b.
Asa bacteriológica y asa micológicab.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador b.
NOTAS
a
Material necesario para el inicio de la práctica.
b
Material necesario para los 3, 4 y/o 5 días después de iniciada la práctica.
66
DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
67
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer
que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua
peptonada al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril o
pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de
la licuadora a velocidad mínima, ó 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad
normal. Esta es la dilución primaria.
3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de
ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2,
agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se
debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.
NOTA
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las diluciones
de la muestra, utilizando una pipeta estéril.
5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa
dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a 45°C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de
agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o
bien esterilizar la solución a 121°C 1°C durante 15 minutos. Esto significa que a
cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45°C se le
deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo
precaución de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo.
7. La norma recomienda que después de la acidificación, se utilice un tubo de medio
acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5
utilizando un potenciómetro.
8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa
acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45 C. El
tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el momento en que es
vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda,
seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás
hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el
medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique,
dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría.
68
10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja
de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar
extracto de malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no deberán
presentar desarrollo de colonias.
11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1 C.
12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después
de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si
alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar
colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso
las de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de
los análisis.
NOTA
13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de
algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos
que se hayan desarrollado.
14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras
obtenidas.
15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de
incubación (a 26 1ºC o a temperatura ambiente).
16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe. Multiplicar por el inverso de la dilución.
17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de
mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25 1 C durante
5 días.
18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de los
mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.
19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícil
contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días
de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo de
incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.
69
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben seleccionar las
placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadística).
Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el número de hongos y
levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de
colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado físico de la muestra
analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en una caja
representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o
levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución
correspondiente.
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el resultado de la
cuantificación de hongos y de levaduras.
ANÁLISIS CUALITATIVO
BIBLIOGRAFÍA.
Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiología de los Alimentos. 4ª. ed. Acribia,
España. 23-50.
Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) “Yeasts and Molds”. In: Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 209-215.
70
Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology.
Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM
Press. USA. 451-465.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
71
Método para la determinación de Staphylococcus aureus en
alimentos.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan
solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son
capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo,
Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones
en el hombre.
Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo,
superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por
ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y
derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas
concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los
alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo
suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y
neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para
permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también
se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas
son los principales reservorios de estos microorganismos.
Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una
contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por
ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de
72
conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora
competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo
73
El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan
rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la
susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento
contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los
síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea, vómito, dolor o espasmos
abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no
manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. En casos más severos, se
puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios
intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los
2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy
severos.
FUNDAMENTO
74
Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima
coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterización bioquímica de
Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa positiva
Presencia de termonucleasa positiva
NOTA
75
HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d.
BIOLÓGICOS
Plasma de conejo c.
MATERIAL Y EQUIPO
Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a, c. (se debe utilizar una
pipeta para cada dilución)
Pipetas Pasteur estériles a, b. c. d.
Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . a. (en caso que la
muestra sea líquida.
Propipeta. a, b, c, d
Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo,
dobladas en ángulo recto (forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución). a
Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras,
espátulas y separador de huevo. a
Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a.
Motor para licuadora o Stomacher a.
Asa bacteriológicab.
Portaobjetosb.
Microscopio óptico b.
Balanza granataria a.
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Baño de agua a ebulliciónd
Incubadora a 35 ± 2°Cd
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica.
76
DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS
Incubar 24 - 48 h a 37°C
Coagulasa
Incubar 24 h
37°C
Siembra de colonias
Fermentación Plasma DNAsa termoestable Realizar pruebas típicas en tubos con
del manitol más bioquímicas a caldo BHI. Consultar
desarrollo cada tubo Cuadro 1
en BHI
77
PROCEDIMIENTO
1. Aislamiento selectivo.
2. Recuperación de la cepa.
78
CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus.
Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar
en una caja representativa bioquímicamente
Menos de 50 UFC 3
51-100 UFC 5
101-150 UFC 7
3. Pruebas bioquímicas.
1. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo
que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de
conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina
estéril.
2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en
intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el
período de observación hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma
reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una
gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.
NOTA
Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores del
cuadro 2.
Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor igual
o superior a 2 cruces.
79
3.2 Prueba de la enzima termonucleasa.
NOTA
80
3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma).
1. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón
después de su incubación, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%, mezclar perfectamente
bien y observar los resultados.
3. Si se presenta formación de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que
sí contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se
interpretará como ausencia de esta enzima.
5 UFC 100%
2 UFC X
X= 40%
81
De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxigénicas (tomando en
cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran
en este alimento?
NOTA
Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, están dentro del rango estadístico
(de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes descrito.
Si se está en el valor estimado, esto es que no existen colonias típicas, se debe
reportar la sensibilidad del método, en este caso será de 100 UFC/g para muestras
sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas.
Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas, se informará:
< 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10
< 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10
82
BIBLIOGRAFÍA.
Jablonskin L.M. & Bohach G:A. 2001. “Staphylococcus aureus” In:Doyle M. Beuchat.
L:R. & Montville T:J. (Eds.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. ASM.
USA: 411-434.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
83
Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
84
incluso a utilizar tecnologías moleculares para establecer loci genéticos y/o productos
únicos para el género Salmonella.
Las frutas y verduras han ganado notoriedad en años recientes como fuentes de
salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores
como: la fertilización de sembradíos con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes
potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibióticos, la irrigación
de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la
manipulación excesiva por los trabajadores, la exposición a la contaminación ambiental
de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a
valores de pH bajos.
85
cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica en la detección del
agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la
sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o
trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infección sistémica. En países
subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha
originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad
cuando se presenta un brote de este tipo.
FUNDAMENTO
86
Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la
identificación específica de un microorganismo.
NOTA
87
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
BIOLÓGICOS
MATERIAL Y EQUIPO
Balanza granataria a.
1 caja de Petri de vidrio estéril a.
1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estéril a.
Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos,
tenedores, estériles a.
Stomacher o motor para licuadora a.
Pipetas de vidrio de 1 mL, estériles con filtro de algodón b.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d, e, f
Asa microbiológica c, d, e.
Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e.
Portaobjetos d.
Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón d, e.
Microscopio óptico d, e.
Incubadora a 35°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1°C
a, b, c, d, e
.
Incubadora a 42°C que evite variaciones mayores a 0.1°C b.
88
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
f
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
89
DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS
Incubar 18- 24
h a 37°C
Incubar 18- 24
h a 37°C
Incubar 18- 24
h a 37°C
Incubar 18- 24
h a 37°C
Resultados
Confirmación positivos para Siembra de bioquímicas
serológica Salmonella complementarias: malonato
citrato, RM-VP, urea, SIM,
manitol
90
PROCEDIMIENTO
1. Preenriquecimiento.
NOTA IMPORTANTE
2. Enriquecimiento selectivo.
91
Caldo selenito cistina
Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitución del caldo tetrationato)
3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo
Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente
contaminados deberán incubarse los medios de enriquecimiento a 42°C por el
mismo periodo
3. Aislamiento diferencial.
NOTA
La metodología descrita en esta sección deberá realizarse para cada uno de los caldos
de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos desarrollados en
caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport.
92
4. Pruebas bioquímicas preliminares
NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar
colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
1. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color del
medio).
2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa
bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar
triple azúcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h.
4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretación de los resultados.
1. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la
asada de la misma colonia con la que se sembró en estos medios, pero sembrando
ahora en el agar lisina hierro (LIA).
2. La interpretación de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2.
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de
Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas bioquímicas
complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero que
presentan reacciones en LIA típicos deben trabajarse como cultivos presuntivos
positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas
atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los
cultivos que muestre reacciones atípicas en ambos medios.
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den
la prueba negativa.
93
5.2. Caldo urea (rápida)
1. Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de
caldo urea (rápida).
2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en baño de agua.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den
la prueba negativa.
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e
inocular por estría en el tubo con agar citrato de Simmons.
2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h.
3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2).
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular por punción vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente
crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovac’s.
4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular el tubo con caldo RM-VP.
94
5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo
1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio RMVP
durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la inoculación del medio
RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de
metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2).
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e
inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato.
2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h.
3. Interpretar los resultados después de incubar (Consultar Cuadro 2).
1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular en el tubo que contiene caldo manitol.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
NOTA
6. Identificación serológica.
1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril
(NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para
aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en
TSI/KIA o LIA.
95
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O” polivalente y mezclar
con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un
minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.
NOTAS
96
12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas
muestre aglutinación.
13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
14. La interpretación de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.
97
CUADRO 2. Reacciones bioquímicas de Salmonella.
Medio a Color antes de Color después de
Resultado
inocular/incubar inocular/incubar
Kligler: + Naranja Fondo tubo amarillo
Fermentación Crecimiento
Glucosa
Kligler: c Naranja Pico de flauta naranja.
-
Fermentación Crecimiento
Lactosa
Kligler: Producción + Naranja Ennegrecimiento
de H2S Crecimiento
Agar LIA: Lisin + Púrpura tenue Púrpura intenso
descarboxilasa Crecimiento
Agar LIA: H2S + Púrpura tenue Ennegrecimiento
Crecimiento
Agar LIA: + Púrpura tenue Fondo tubo amarillo
Fermentación Crecimiento
Glucosa
Caldo Surraco: - Rosa Rosa-violeta
Ureasa mexicano Crecimiento
Caldo Surraco: - Rosa Amarillo
Fermentación Crecimiento
sacarosa
Medio SIM: d Amarillo tenue. Crecimiento en
+
Movilidad Semisólido, superficie y picadura,
translúcido turbiedad/difusión
fuera de picadura
Medio SIM: Indol - Amarillo tenue. Con reactivo Kovac’s:
Semisólido, Formación de anillo
translúcido rojo en superficie
Medio SIM: H2S + Amarillo tenue. Ennegrecimiento
Semisólido, Crecimiento
translúcido
Caldo RMVP: Prueba + Amarillo tenue, Con indicador rojo de
de rojo de metilo translúcido metilo: Rojo
Caldo RMVP: Prueba - Amarillo tenue, Con reactivos VP1 y
Voges-Proskauer translúcido VP2: Anillo rojizo
Agar Citrato a+ Verde Azul
V
Simmons Crecimiento
Caldo malonato c Verde Azul
-
Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo
fenol
Caldo dulcitol rojo b Rojo Amarillo
+
fenol
Caldo KCN - Sin desarrollo Desarrollo
Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo
fenol
Observación
Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados
microscópica
a
+,90% o más positivos en 1 ó 2 días;- 90% o más negativos en 1 ó 2 días; v, variable.
b
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos.
c
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos.
d
Excepto S. entérica serovar Pullorum y S. entérica serovar Gallinarum y cepas con
flagelos disfuncionales
98
CUADRO 3. Reacciones serológicas de Salmonella.
Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas Interpretación
Típica Antígeno O, Vi o H Cepas consideradas como
Positivo Salmonella
Típica Todas las reacciones
positivas
Típica No probada Puede ser Salmonella
Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H
Positivo
Reacciones atípicas Todas las reacciones No debe ser considerada
negativas Salmonella
RESULTADOS
1. Interpretación de resultados.
Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificación de los géneros y
especies de las bacterias investigadas.
2. Informe de resultados.
99
COMPLEMENTO
100
1.4. Productos que contienen huevo en su formulación: (pastas para sopa, rollos
chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo); frutas frescas,
congeladas o secas; crustáceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas)
y pescado
1.6. Queso
1.7. Caseína
1.8. Coco
101
Levadura seca
102
1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados.
1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para licuadora o
en dos bolsas de Stomacher.
2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar directamente el
producto en matraces Erlenmayer estériles de 500 mL.
3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato (sin
verde brillante) a cada muestra pesada.
4. Licuar por dos min. y pasar asépticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL.
5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2
6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solución de verde brillante 0.1% y 4.5 mL
de solución yodo-yoduro de potasio
7. Mezclar el matraz con los reactivos añadidos.
8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.).
9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para muestras
en general.
1.12. Especias
1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco,
romero, tomillo, chile en polvo, páprika o pimentón, ajonjolí, hojuelas de
vegetales (vegetales secos)
103
1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas
1.13. Gelatina
BIBLIOGRAFÍA
D’Aoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food Microbiology.
Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville T.J. (Eds.) 2d. ed.
ASM Press USA: 141-157.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
104
Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) “Salmonella”. In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed. Downs
F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
105
Método para la determinación de Vibrio cholerae en alimentos, hielo y
agua.
OBJETIVO
GENERALIDADES
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s), pueden ser de tipo infeccioso y
de origen químico, como las intoxicaciones. La incidencia de estas enfermedades
constituye uno de los problemas de salud pública más extendidos en el mundo
contempóraneo y permanecen como una de las causas principales de morbilidad,
ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificación
obligatoria.
Entre los alimentos involucrados en ETA’s que están contaminados por V. cholerae
resaltan los moluscos bivalvos así como los crustáceos y los pescados frescos-
refrigerados y congelados. Estos productos pueden generar enfermedades a los
consumidores debido a que desde su origen están sometidos a contaminación
microbiológica y química entre otras, aunado a la forma de consumo que en muchos
casos es cruda. El fin principal de la Norma Oficial Mexicana que regula estos
productos desde el punto de vista sanitario es el de proteger la salud del consumidor.
La enfermedad del cólera fue descrita por primera ocasión por Pacini en 1854. Esta se
presenta por la ingesta de la bacteria viable, la cual se establece en el intestino
delgado y libera una toxina termolábil. La producción de esta toxina provoca diarrea
acuosa causando los síntomas característicos del cólera.
Los síntomas del cólera asiático pueden ir desde una diarrea acuosa ligera, hasta una
diarrea severa con aspecto de “agua de arroz”. El establecimiento de la enfermedad por
lo general es repentino, con periodos de incubación que varían entre las 6 h. y los 5
días. Esta enfermedad generalmente es autolimitante.
106
Las personas con cólera requieren de hidratación intravenosa u oral con soluciones que
contengan cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de potasio y glucosa, ya que
la muerte sobreviene debido a la deshidratación y pérdida de electrolitos esenciales.
El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram-negativos, oxidasa positivos
(excepto las especies metschnikovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios
facultativos. Muchas especies de Vibrio spp. son patógenas para humanos y están
implicadas en toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayoría de los
microorganismos que pertenecen a este género no crecen en medios sin cloruro de
sodio a excepción de V. cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta característica
no es considerado un vibrio halofílico, aunque requieran trazas del ión sodio para su
crecimiento.
107
Otros Vibrio spp. halofílicos, V. fluvialis, V. hollisae, V. alginolyticus, V. furnissii y V.
metschnikovii, se han asociado con gastroenteritis y están presentes en ambientes
estuarios junto con otras especies patógenas y no patógenas de Vibrio.
FUNDAMENTO
108
Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en moluscos bivalvos
frescos, refrigerados o congelados:
1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL con 450.0 mL de agua peptonada alcalina (1%
P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL vacío y estérila.
4 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5 0.2)
(APA)a.
NOTA
109
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo RM/VPd.
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo rojo de fenol más 1% de arabinosa (P/V) d.
Opcional: además del TCBS, 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar modificado con
celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC) b.
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
MATERIAL Y EQUIPO
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
110
DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN AGUA Y HIELO
Incubar, TCBS 18 -
24 h a 35-37°C.
sacarosa (+) =
amarillo
Seleccionar al
mCPC 18-24 h a 39 -
menos 3
40ºC. celobiosa ( - )
colonias
= púrpura Aislamiento en medios selectivos y
sospechosas
diferenciales
de cada placa y
aislar
Resultados característicos
Agar T1N1 o agar soya Bioquímicas presuntivas
tripticasa 2% NaCl. TSI, KIA Y AAG
Inc. 35-37ºC/12-18 h. Inc. 35-37 ºC/18-24 h.
Comprobar pureza en
GA o GS en el 2do. día.
Inc. 35-37ºC/12-18 h.
Resultados
Confirmación positivos para V. Siembra de bioquímicas
serológica cholerae complementarias: pruebas de halofilia
en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP,
oxidasa y fermentación de la arabinosa.
111
DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN CRUSTACEOS FRESCOS,
REFRIGERADOS O CONGELADOS
+
10-2 10-3
Realizar 2 mezclas con 10 crustáceos Para cada matraz realizar 2 dil. Incubar una serie a 35-
(aprox. 250.0 g c/u). De cada mezcla seriadas en 9.0 ó 90.0 mL APA. 37°C y otra a 42°C / 24 h.
tomar 25.0 g y colocar en 225.0 mL Después de la incubación
de APA. Homogeneizar 2 min. y sin agitar la película,
efectuar aislamiento en
uno de los sigs. medios
de cultivo: TCBS (mCPC
opcional además del
TCBS).
Incubar, TCBS 18 -
24 h a 35-37°C.
sacarosa (+) =
amarillo
mCPC 18-24 h a 39 -
Seleccionar al 40ºC. celobiosa ( - )
menos 3 = púrpura
colonias Aislamiento en medios selectivos y
sospechosas diferenciales
de cada placa y
aislar
Resultados característicos
Agar T1N1 o agar soya Bioquímicas presuntivas
tripticasa 2% NaCl. TSI, KIA Y AAG
Inc. 35-37ºC/12-18 h. Inc. 35-37 ºC/18-24 h.
Comprobar pureza en
GA o GS en el 2do. día.
Inc. 35-37ºC/12-18 h.
35-37ºC/12-18 h.
Resultados
Confirmación positivos para V. Siembra de bioquímicas
serológica cholerae complementarias: pruebas de halofilia
en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP,
oxidasa y fermentación de la arabinosa.
112
DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN PESCADOS FRESCOS,
REFRIGERADOS O CONGELADOS; QUESOS Y HELADOS.
Incubar, TCBS 18 -
24 h a 35-37°C.
sacarosa (+) =
amarillo
Seleccionar al mCPC 18-24 h a 39 -
menos 3 40ºC. celobiosa ( - )
colonias = púrpura Aislamiento en medios selectivos y
sospechosas diferenciales
de cada placa y
aislar
Resultados característicos
Agar T1N1 o agar soya Bioquímicas presuntivas
tripticasa 2% NaCl. TSI, KIA Y AAG
Inc. 35-37ºC/12-18 h. Inc. 35-37 ºC/18-24 h.
Comprobar pureza en
GA o GS en el 2do. día.
Inc. 35-37ºC/12-18 h.
Resultados
Confirmación positivos para V. Siembra de bioquímicas
serológica cholerae complementarias: pruebas de halofilia
en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP,
oxidasa y fermentación de la arabinosa.
113
DETERMINACIÓN DE V. cholerae EN MOLUSCOS BIVALVOS FRESCOS,
REFRIGERADOS O CONGELADOS
+
10-2 10-3
Incubar una serie a
Para cada matraz realizar 2 dil. 35-37°C y otra a 42°C /
Desconchar 10-12 moluscos seriadas en 9.0 ó 90.0 mL APA. 24 h.
(aprox. 50.0 g) y colocar en Después de la
450.0 mL de APA. incubación y sin agitar
Homogeneizar 2 min. Dividir la película, efectuar
en 2 matraces estériles. aislamiento en uno de
los sigs. medios de
cultivo: TCBS (mCPC
opcional además del
TCBS).
Incubar, TCBS 18 -
24 h a 35-37°C.
Seleccionar al sacarosa (+) =
menos 3 amarillo
colonias mCPC 18-24 h a 39 -
sospechosas 40ºC. celobiosa ( - ) Aislamiento en medios selectivos y
de cada placa y = púrpura diferenciales
aislar en;
Resultados característicos
Agar T1N1 o agar soya Bioquímicas presuntivas
tripticasa 2% NaCl. TSI, KIA Y AAG
Inc. 35-37ºC/12-18 h. Inc. 35-37 ºC/18-24 h.
Comprobar pureza en
GA o GS en el 2do. día.
Inc. 35-37ºC/12-18 h.
Resultados
Confirmación positivos para V. Siembra de bioquímicas
serológica cholerae complementarias: pruebas de halofilia
en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP,
oxidasa y fermentación de la arabinosa.
114
PROCEDIMIENTO
1. Enriquecimiento.
TEMPERATURA DE
TIPO DE INCUBACIÓN DEL
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
MUESTRA PREENRIQUECIMIENTO
35-37ºC/24 h 42ºC/24 h
115
TIPO DE TEMPERATURA DE
MUESTRA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCUBACIÓN DEL
PREENRIQUECIMIENTO
A 50,0 g de queso en cubos de aprox 6
mm y pasar a vasos de 2 litros.
Añadir 800,0 a 1000,0 ml de solución
hirviente de ácido fosfórico (1:40).
Agitar continuamente a baja velocidad
por 20 minutos hasta disolver la
muestra.
Quesos de Filtrar y lavar la muestra para evitar que X
el filtro se obstuya. ---
suero (6 diluciones)
En caso de obstrucción agregar al agua
de lavado una solución alcalina
(hidroxido de sodio al 5% o acido
fosforico 1:40 o alcohol caliente) asta
que el filtro quede limpio.
Examinar el papel filtro en el
microoscopio.
A 25 g de muestra introducirlos en
225,0 ml de agua peptonada alcalina
Helado y
(APW) y homogeneizar por 2 minutos a X
basespara --
la máxima velocidad (6 diluciones)
helado
De cada mezcla realizar 2 diluciones
más en 9,0 o 90,0 ml de APA.
2. Resiembra
3. Morfología colonial.
116
Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clásico) son grandes, lisas,
amarillas (positivas para la fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas,
con el centro opaco y los bordes translúcidos.
NOTA
Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son púrpuras (negativas para la
fermentación de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas
achatadas, con el centro opaco y los bordes translúcidos. La mayoría de las demás
especies de Vibrio no crecen fácilmente en agar mCPC.
4. Selección
1. Agar T1N1 o agar soya tripticasa con 2% de NaCl e incubar a 35-37°C durante 12-
18 h.. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la
pureza de las colonias antes de las pruebas bioquímicas, esto es, se puede
inocular en:
2. Agar gelatina (GA) o agar gelatina sal (GS) en el segundo día. Los resultados serán
confiables si las placas de aislamiento y la observación microscópica muestran que
las colonias elegidas están puras.
5. Diferenciación
La fórmula para todos los medios de pruebas bioquímicas deberán contener por lo
menos un 2% de NaCl.
Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar una
diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas,
Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciación de las colonias sospechosas se
realiza por duplicado en:
1. Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas
gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo
comercial.
117
2. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con
NaCl al 2%, u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables (Inciso 4) y
depositarlo en el papel filtro anterior.
NOTA
Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul
en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto
el V. metschnnikovii).
5.2. Agar triple azúcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA)
1. Registrar las características del medio TSI y KIA antes de la inoculación (color del
medio).
2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica
recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar
hierro (TSI) y agar de Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI y KIA a 35 2 C durante 18 a 24 h.
1. Registrar las características del medio AAG antes de la inoculación (color del
medio).
2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica
recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con medio AAG inclinado.
3. Incubar el medio AAG a 35 2 C durante 18 a 24 h.
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con
asa bacteriológica estéril y suspender el inóculo en un tubo con los siguientes
medios:
118
NOTAS
Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones similares
a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las
especies de Vibrio spp. que incluyen algunos V. cholerae no O1, crecen únicamente en
T1N3 y no crecen en T1N6 ni en concentraciones mayores de sal.
1. Dividir cada placa en ocho sectores. Tomar suavemente una porción del cultivo
desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriológica estéril e inocular en el
centro de cada sector una estría recta.
2. Incubar a 35-37ºC durante 18 a 24 h..
NOTA
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con
asa bacteriológica estéril e inocular por picadura en un tubo con el medio Hugh-
Leifson.
2. Añadir una capa de aceite mineral estéril a uno de los tubos para incubación en
anaerobiosis.
3. Incubar ambos tubos a 35-37ºC durante 18 a 24 h.
NOTA
Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la
fermentación. Las especies de Pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado
y los mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de
Vibrio, utilizan sólo la glucosa para la oxidación.
119
6. Identificación y confirmación de V.chloreae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicus
a través de pruebas bioquímicas complementarias.
Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, AAG, T 1N0, T1N3, T1N6 o
GA y GS con 3% y 6% de NaCl, además del caldo glucosa de Hugh-Leifson. También
se sugiere realizar una tinción de Gram a un cultivo de 18 a 24 h. de incubación.
NOTAS
La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Vibrio cholerae Grupo
O1 subgrupo Inaba (factor AC) o el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo
Ogawa (factor AB) se considerará como el control negativo para poder interpretar el
resultado.
Existe la posibilidad que los antígenos anti Vibrio cholerae estén relacionados entre sí,
por lo que se considera pertinente realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el
cultivo puro sea de V. cholerae O1 o no O1.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo O1) y con los sueros Inaba y
Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
120
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente, pero no aglutinan con sueros Inaba
y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.
121
CUADRO 1. Reacciones de algunas especies de Vibrio spp. y microorganismos
relacionados en medios sólidos diferenciales.
122
CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Vibrio cholerae
123
CUADRO 3. Características diferenciales de especies y biotipos del género Vibrio
V. V. V. V. V. V. V. V.
cholerae alginolyticus fluvialis parahaemolyticus vulnificus mimicus hollisae furnissii
Crecimiento en A A V V V V NC A
TCBS
Agar mCPC P NC NC NC A NC NC NC
Medio AAG Ka KA KK KA KA KA Ka KK
Crecimiento con:
0% NaCl + - -/d - - + - -
3% NaCl + + + + + + + +
8% NaCl - + d + - - - d
10% NaCl - + d - - - - -
Crecimiento a:
4ºC - - - - - ND ND ND
30ºC + + + + + ND ND ND
35ºC + + + + + ND ND ND
40ºC + + + + + ND ND ND
Oxidasa + + + + + + + +
OF/glucosa OF OF OF OF OF OF OF OF
ONPG + - + - + + - +
Voges- d + - - - - - -
Proskauer
Rojo de Metilo + NC - NC NC d - +
Indol + d - + d + + -
Movilidad + + d - + + - +
Citrato + - + d d + - +
Arginina - - + - - - - +
dihidrolasa
Descarboxilación + + - + + + - -
de lisina
Descarboxilación + + - + + + - -
de: Ornitina
Gelatinasa + + + + + d - +
Ureasa - - - D - - - -
Producción de: + + + + + ND ND ND
amilasa
H2S (SIM) - - - - - - - -
Utilización de: + + + + + - + +
D-glucosa
Gas a partir de - - - - - - - +
glucosa
D-Xilosa - - - - - -
L-Arabinosa - - + d - - + +
D-Galactosa + d + + + + + +
Sacarosa + + + - - - - +
Celobiosa - - d - + - - -
Lactosa - - - - + d - -
Salicina - - - - + - - -
D-Gluconato + + + + +
Putrescina - d d + -
SÍMBOLOS: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; mCPC, agar celobiosa-polimixina B-colistina;
modificado; AAG, agar arginina-glucosa A, amarillo; V, verde; P púrpura; OF, metabolismo oxidativo/fermentativo; N,
no crece; K, alcalino; a, ligeramente ácido; V, reacción variable dependiendo de las especies o biotipos; S, sensible;
R, resistente; d, resultados diferentes; +, la mayoría de las cepas +, usualmente 90% o más; -, casi ninguna cepa
positiva, usualmente positivas; ND, no hay datos.
124
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed.
Arlington, VA: AOAC.
Kaysner C. A., & DePaola A. Jr. (2001) “Vibrio”. In: Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 405-420.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
125
Método para la determinación de Listeria monocytogenes en
alimentos.
OBJETIVO
GENERALIDADES
126
Para la caracterización bioquímica y diferenciación de Listeria spp, la fermentación de
ramnosa y xilosa son las pruebas cruciales. Ni L. monocytogenes ni L. innocua
fermentan xilosa, L. monocytogenes fermenta xilosa. L. monocytogenes fermenta
ramnosa al igual que la mayoría de los serotipos de L. innocua. Estas dos especies
pueden distinguirse a partir de la ausencia de actividad hemolítica en L. innocua, al
contrario de L. monocytogenes y L. seeligeri; aclarando que L. seeligeri solo presenta
una leve actividad hemolítica en placas de agar sangre de carnero después de 48 h de
incubación, mientras que para L. monocytogenes desde las 24 h se hace evidente. Ya
que esta última produce hemolisina beta, característica relacionada con su
patogenicidad. Debido a que L. innocua comparte antígenos con L. monocytogenes, es
necesario que para su caracterización se realicen las reacciones xilosa-ramnosa y/o
patogenicidad en ratones.
Las pruebas clásicas para definir la patogenicidad de la Listeria incluyen entre otras, la
prueba de Antón en conejos, inyecciones intraperitoneales en ratones e inoculación de
ratones e inoculación de embriones de pollo.
127
Debido a que todas las especies patógenas, exceptuando L. welshimeri, comparten
uno o más antígenos somáticos con L. monocytogenes, es necesario caracterizar
bioquímicamente las cepas antes de aplicar las prueba inmunológicas.
Este microorganismo a pesar de ser una bacteria que no posee esporas, es altamente
resistente a condiciones adversas tales como: congelamiento, secado y calentamiento.
La dosis infectiva está relacionada con la susceptibilidad del huésped. Así, para
individuos susceptibles la infección ocurre incluso con 100 células, mientras que
personas no susceptibles resisten hasta 10 000 000 células.
Como medidas de control para evitar la listerioris a través del consumo de alimentos
contaminados, se recomienda y solo por mencionar algunas lo siguiente, pH bajo,
tratamiento térmico adecuado, evitar la recontaminación y un aw bajo.
128
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el problema de la Listeria
no está en impedir su presencia, sino en controlar su supervivencia y crecimiento, con
el fin de reducir las cantidades en que se encuentran en los alimentos.
FUNDAMENTO
MEDIOS DE CULTIVO
129
EQUIPO Y MATERIAL
Aceite de inmersiónb.
Asa bacteriológica de plástico,c,d,e.
Cubreobjetosb,c.
Lámpara de luz blancab.
Pipetas estériles con algodón de 1.0, 10.0 y 25.0 mLa,b,c,d,e.
Pipetas Pasteur estériles a, ,b ,c, d, e
1 propipetaa,b,c,d,e.
Portaobjetos escabadob,c.
1 mechero Bunsena,b,c,d,e.
Incubadora a 30°C y a 35°Ca,b,c,d,e.
Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de
alimentosa.
Balanzaa.
Microscopio de contraste de fase con un objetivo 100Xb,c.
Licuadora ó stomachera.
2 Tubos limpios, 16 x 125 mm u otros tamaños apropiados con tapón de rosca d,e.
Cajas Petrie.
REACTIVOS Y SOLUCIONES
Acrilflavina HCl
Agar
-naftilamina
α-naftol en etanol absoluto al 5%
Agar sangre base No.2
Cicloheximida
Sangre de carnero, desfibrinada
Etanol absoluto
Amortiguador de anticuerpos fluorescente
Glicina anhidra
Colorantes para la Tinción Gram
Solución de peróxido de hidrógeno al 3% para la prueba de catalasa
KOH, solución al 40%
juego de sueros comerciales ante Listeria.
Acido nalidíxco (sal de sodio)
Reactivos A, B o C y/o zinc para la prueba de reducción de nitratos
Caldo nutritivo
Acido sulfanílico
Aceite de inmersión
130
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 7 días de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 8 días de iniciada la práctica.
131
DETERMINACIÓN DE Listeria monocytogenes EN ALIMENTOS
Confirmación
serológica Resultados positivos para L.
monocytogenes
132
PROCEDIMIENTO
1. Enriquecimiento.
2. Aislamiento.
3. Identificación.
133
contraste de fase o microscopio de contraste de fase o microscopio de
campo oscuro.
Las células de Listeria spp. son bacilos cortos con movilidad rotatoria o
como si brincaran.
Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.
3.4. Hemólisis
1. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para
la lectura se debe agregar 0,2 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, un
color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración
no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de
una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos).
2. En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 mL del reactivo B
y 0,2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia
de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0,2 mL del reactivo de
cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa
(presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa -
naftilamina, que es carcinogénica.
134
3.6. Movilidad en agar
1. Inocular en medio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-
25 ºC), observar diariamente. Las especies de Listeria son móviles, dando un
crecimiento típico en forma de paraguas.
1. Inocular densamente tubos con agar bilis esculina inclinados, incubar a 35ºC
durante 48 h. L. monocytogenes tolera la bilis en su crecimiento y es capaz de
hidrolizar la esculina.
135
4. Serología
EXPRESIÓN DE RESULTADOS
136
CUADRO 2. Serología de las especies de Listeria
Especies Serotipo
L. monocytogenes 1/2A, 1/2B, 1/2C
3A, 3B, 3C
4A, 4AB, 4B
4C, 4D, 4E, "7"
L. ivanovii 5
L. innocua 4AB, 6A, 6B, Una
L. welshimeri 6A, 6B
L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Una
Una Indefinido
INFORME DE LA PRUEBA
BIBLIOGRAFIA
Ryser E.T., & Donnelly C.W. (2001) “Listeria”. In: Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA.
Washington. 343-356.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
137
ANEXO I
Medios de Cultivo
NOTA
Los medios de cultivo son presentados en orden alfabético,
independientemente de su estado físico.
Agua Peptonada.
Peptona 1.0 g
Cloruro de sodio 8.5 g
Agua destilada 1.0 L
Peptona 10.0 g
Cloruro de sodio 10.0 g
Agua destilada 1.0 L
Principio de acción
Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del género Vibrio ya que las
condiciones óptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino.
Peptona 10.0 g
Cloruro Sódico 5.0 g
Fosfato sódico dibásico 3.5 g
Fosfato potásico monobásico 1.5 g
Agua destilada 1.0 L
138
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH,
después de la esterilización a 7.0 en caso de ser necesario. Distribuir en
recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones
necesarias para la prueba. Esterilizar a 121 1°C durante 20.0 minutos.
Principio de acción
El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser
utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo
de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de
células dañadas por los procesos de conservación de alimentos.
Almidón, agar.
Peptona 5.0 g
Extracto de carne 3.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Almidón de maíz 10.0 g
Agar 20.0 g
Agua destilada 1.0 L
Principio de acción:
Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de
hidrolizar el almidón (polisacárido); este compuesto está constituido por un
conjunto de unidades de α-D-glucosa cuya estructura química es una hexosa. Por
otra parte, se sabe que el almidón forma un complejo de color azul intenso en
presencia de yodo, en ocasiones la coloración es rojiza debido al alto contenido de
dextrinas que presenta el almidón, sin embargo los mono y disacáridos no se
enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloración azul ni rojiza. Algunos
microorganismos contienen enzimas como las α o β amilasas, capaces de
hidrolizar el almidón dando como productos de la reacción mono o disacáridos, por
lo que al adicionar a estos azúcares la solución de yodo, no aparecerá coloración
azul ni rojiza (no confundir con el color de la solución de yodo que es café).
139
Arginina y glucosa, agar.
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Triptona 10.0 g
Cloruro de sodio 20.0 g
Glucosa 1.0 g
Clorhidrato de L-arginina 5.0 g
Citrato férrico amónico 0.5 g
Tiosulfato de sodio 0.3 g
Púrpura de bromocresol 0.2 g
Agar 13.5 g
Agua destilada 1.0 L
Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolución del agar;
envasar cantidades de 5.0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y
7.0. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el
medio inclinando los tubos.
Principio de acción:
La descarboxilación del aminoácido L-arginina, es realizada por microorganismos
que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unión
del grupo carboxilo, liberando dióxido de carbono (gas) y formando putrescina,
esta última es una diamina que se caracteriza por presentar reacción alcalina. Por
otra parte el indicador, púrpura de bromocresol en medio alcalino presenta una
coloración púrpura y en medio ácido es amarillo. Por lo tanto si se produce
putrescina el medio intensifica el color púrpura por la alcalinidad producida, en
caso contrario el medio no cambia de color; finalmente también se podrá observar
la fermentación de la glucosa con su respectiva producción de acidez, virando el
medio a color amarillo verdoso.
140
Suspender 58.0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitación
constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a
121°C±1.0°C durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45°C.
Principio de acción:
S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio
metálico (Te), por esta razón las colonias se presentan de color negras metálicas
de acuerdo a la siguiente reacción:
Te4+ Te0
141
llevar a cabo la hidrólisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la
colonia negra (reducción del telurito), además al romperse las uniones
lipoprotéicas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una
opalescencia alrededor de la colonia.
Principio de acción:
La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en
el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el
desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se
presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química
básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno.
142
Principio de acción:
La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram
positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las
sales biliares son derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química
básica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en
este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se
satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina.
Principio de acción:
La enzima β-D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la
lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa,
monómeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO 2; este
último subproducto se detecta en las campanas de fermentación después de
incubar de 24 a 48 h.
Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el
verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram
positivos y también tienen efecto tóxico sobre algunos microorganismos Gram
negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y
desoxicólico, su estructura química básica es la de ciclo pentano
perhidrofenantreno.
El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram
positivas y la mayoría de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso
suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la
lactosa como el Clostridium perfringens que daría reacciones falsas positivas.
143
BPLS modificado, agar.
Suspender 52.0 g del medio en 750.0 mL de agua, para humectar los polvos
insolubles, después adicionar el resto del agua y calentar a ebullición durante un
minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas
Petri.
Principio de acción:
En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las
cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formación de
acidez a partir del azúcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no
fermentan la lactosa.
144
Principio de acción:
El tioglicolato de sodio consume el oxígeno ambiental, creando una atmósfera
anaeróbica, que es el objetivo de este medio. Además este medio contiene más
sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehído, los cuales
garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de
metileno es un indicador para reacciones de óxido reducción.
Principio de acción:
En este medio el sulfito de bismuto actúa con el verde brillante como agente
selectivo para la inhibición de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella.
Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la producción de ácido
sulfhídrico, mientras que la reducción de las sales de bismuto a bismuto metálico
tiñe las colonias de un brillo negro o café metálico por la reducción del sulfito a
sulfuro, produciendo ácido sulfhídrico.
145
Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC)
Solución 1:
Peptona 10.0 g
Extracto de carne 5.0 g
Cloruro de sodio 20.0 g
Solución Stock de colorante 1000 X 1.0 mL
Agar 15.0 g
Agua destilada 0.9 L
Para obtener un color firme del medio, usar una solución colorante stock, en lugar
de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes
en el alcohol etílico hasta obtener una concentración de 4% (peso/volumen); de
esta solución se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solución
1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55°C.
Solución 2:
Celobiosa 10.0 g
Colistina 400000 UI
Polimixina B 100000 UI
Agua destilada 0.1 L
Principio de acción:
La polimixina B, es un antibiótico que inhibe el crecimiento de microorganismos
Gram positivos, esto es un antibiótico de espectro reducido. Permite entre otros, el
desarrollo del género Vibrio, por ser éstos Gram negativos. Además contiene una
alta concentración de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos
halotolerantes.
146
Cianuro, caldo (KCN).
Principio de acción.
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último
eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfirió electrones al oxígeno con
formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y
anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificación de aquéllos que carecen
de dicha enzima. El cianuro interrumpe el último eslabón de la cadena respiratoria,
sin embargo hay microorganismos que generan su energía metabólica por vías
alternas.
Disolver 23.0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver
completamente los ingredientes. Distribuír en tubos y esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 min. Inclinar los tubos después de esterilizar. Enfriar antes de su
147
uso y conservar en refrigeración (4-10 °C). La caducidad es aproximadamente de
6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio sólido (se recomienda
agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO
EN EL PICO DE FLAUTA
Principio de acción.
El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciación de la familia
Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como única fuente
de carbono. La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia
de fermentación o producción de ácido láctico por la utilización del citrato como
única fuente de carbono. Los microorganismos podrán introducir el citrato al
citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a través de la
enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato
y/o dióxido de carbono. El medio contiene también sales inorgánicas de amonio.
Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono también
utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno, éstas son degradadas
a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul
de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerándose
de esta forma la reacción como positiva.
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Dextrosa (D-glucosa) 1.0 g
Púrpura de bromocresol 0.02 g
Agua destilada 1.0 L
Principio de acción
La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de
desarrollo de los microorganismos. La descarboxilación del aminoácido que
contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que
poseen algunos microorganismos, provocan la liberación del grupo carboxilo,
quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza,
dando una coloración púrpura.
148
La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la
ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la
descarboxilación solamente se lleva a cabo en medio ácido (por debajo de pH
6.0), el medio debe acidificarse mediante la fermentación de la glucosa; esto
quiere decir que este medio sólo se utiliza para la diferenciación de
microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima
descarboxilasa.
DNA, agar.
Principio de acción:
Los ácidos nucleicos, están constituidos por azúcar-fosfato-bases nitrogenadas, el
azúcar es la β-D-desoxirribosa, que forma uniones éster con el ácido fosfórico,
unidas también a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina,
dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos ésteres pueden
ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrólisis del DNA por la nucleasa
microcóccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinucléotidos, son
productos de la ruptura del azúcar (carbono 3´ y 5´) con el fosfato. Es importante
hacer notar que la enzima DNAasa, es más activa sobre el DNA desnaturalizado
(por calentamiento) que sobre el DNA original, además es una característica de S.
aureus patógeno.
149
Dulcitol rojo de fenol, caldo.
Peptona de caseína 10.0 g
Extracto de carne 1.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Rojo de fenol 0.018 g
Dulcitol 10.0 g
Agua destilada 1.0 L
pH 7.4±0.2
Principio de acción
Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato
específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La
fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un
sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos
característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos
acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y
CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol
isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para
demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la
mayoría de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y
generaran un vire del indicador a amarillo.
150
durante 15 minutos a 121°C. Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se
deje bajar la temperatura a 75°C para evitar que se introduzcan burbujas de aire
en las campanas de Durham.
Principio de acción:
Principio de acción:
Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas)
producen la enzima β -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG
dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este último compuesto es
fácilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta.
Peptona 10.0 g
Lactosa 10.0 g
Fosfato dibásico de potasio 2.0 g
Eosina Y 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
Agua destilada 1.0 L
151
c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.
Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Principio de acción
El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La
acción selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de
metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas.
Peptona 10.0 g
Lactosa 5.0 g
Sacarosa 5.0
K2HPO4 2.0 g
Eosina Yellow 0.4 g
Azul de metileno 0.065 g
Agar 13.5g
Agua destilada 1.0 L
Principio de acción
La sacarosa y lactosa permiten distinguir al género Salmonella y Shigella, (porque
ambas no fermentan dichos azúcares), de la flora acompañante, por ejemplo
Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero sí la
sacarosa; cuando el resto de la flora acompañante son bacterias Gram positivas,
éstas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno.
152
Entérico de Hektöen, agar.
Suspender los ingredientes en el agua destilada estéril, hervir con agitación hasta
la disolución completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60°C,
posteriormente distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.
Principio de acción
La concentración alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales
biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales
(sacarosa y salicina) mejoran la diferenciación con respecto a la lactosa, y la
menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperación. Debido a los dos
indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas
muestran una diferencia cromática de color amarillo, frente a las colonias lactosa-
negativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que
fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina,
sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de
patógenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al
reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente.
El tiosulfato y el citrato férrico se utilizan para la detección de los organismos
productores de ácido sulfhídrico por reducción del tiosulfato. Una mezcla de sales
biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompañante. Se recomienda la
adición de novobiocina en una concentración de 15.0 mg/mL, lo cual mejora la
selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus.
153
Esculina bilis, agar.
Principio de acción
La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrógeno, minerales,
vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La
esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y
dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato férrico amoniacal)
que contiene el medio para producer un complejo negro a café rojizo que aparece
en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las
sales biliares. El agar es el agente solidifante.
Principio de acción:
Se utiliza para la demostración, aislamiento y numeración de hongos y levaduras.
A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que éstos favorecen
el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo
se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las
154
levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%,
adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido.
Principio de acción
Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrógeno,
vitaminas y minerales. El fosfato de sódio y potasio son los agentes
amortiguadores. La diferenciación se ve estimulada por la adición del citrato férrico
amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la
adición de iones fierro al medio detectará la reacción. Un ennegrecimiento del
medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formación
del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro.
La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de lítio, ácido nalidíxico y
acrilflavina en la fórmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como
medio para inhibir el crecimiento de los enterococos.
155
Gelatina, agar (GA).
Principio de acción:
En el caso específico de la determinación de V. cholerae se utiliza este medio de
cultivo para purificación de colonias sospechosas provenientes de los medios de
cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia.
Principio de acción:
En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no,
en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas
proteolíticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve
para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas
concentraciones de sal.
156
Gelatina con sal, caldo (GS).
Principio de acción:
Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan
algunos microorganismos.
Principio de acción
En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes
azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido
sulfhídrico H2S.
157
condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como
producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs
a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en
alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es
de color rojo.
Peptona 2.0 g
Extracto de levadura 0.5 g
Cloruro de sodio 20.0 g
Dextrosa 10.0 g
Púrpura de bromocresol 0.015 g
Agar 3.0 g
Agua destilada 1.0 L
158
Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar;
ajustar el pH a 7.4±0.2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a
121°C durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde.
Principio de acción
El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o
anaerobias, sin embargo la fermentación es un proceso anaerobio y las bacterias
que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas.
Los microorganismos al fermentar un azúcar, hidrolizan el carbohidrato, dando
como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos,
dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el ácido
pirùvico. La más importante vía metabólica para fermentar la glucosa es la de
Embden-Meyerhof-Parnas.
Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo
seleccionado como patrón positivo, la inoculación se hace por picadura hasta el
fondo de los tubos, después de lo cual un tubo se sella con parafina estéril y otro
no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculación deberá estar en fase
logarítmica de desarrollo.
159
Infusión cerebro corazón, caldo. Infusión cerebro corazón, agar (BHI, caldo/
BHI, agar).
Principio de acción:
Los componentes de la infusión de cerebro de ternera y de la infusión de corazón
de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para
microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.
160
Principio de acción
En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes
azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido
sulfhídrico H2S.
161
Koser citrato de, caldo.
Principio de acción:
En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos
microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la
obtención de energía. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima
citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El
citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la
condensación del acetilo activo con el ácido oxaloacético. El citrato es hidrolizado
por la enzima citrasa, generando como productos ácido oxaloacético y acetato.
Estos productos son convertidos enzimáticamente a ácido pirúvico y dióxido de
carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es
positiva.
Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa,
caldo (Brila).
Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con
lactosa, caldo (Brila).
Lactosado, caldo.
162
Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65°C. Distribuir en
porciones de 225.0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 121 1°C
durante 15.0 min.
Principio de acción
El caldo lactosado se utiliza para la identificación presuntiva de organismos
coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo,
puede también utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del
enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones
para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación.
163
Principio de acción
Este medio se usa como prueba presuntiva en la detección del grupo coliforme. El
lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de
bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de éstos,
sin embargo sí se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona
proporciona nitrógeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales
para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del
pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.
Principio de acción
La leche por ser un alimento rico en nutrientes (proteínas y azúcares) puede
utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para
inhibir la microbiota acompañante se debe adicionar 0.45 mL de una solución de
verde brillante al 0.1%.
164
Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta
ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar
en autoclave 12 minutos a 121ºC. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en
posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una
parte inclinada de 2 cm.
Principio de acción
La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la
amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de
bromocresol. Puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH
inferior a 6.0), es necesario que se produzca previamente la acidificación de medio
de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo
sólo puede utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa.
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la
glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La
formación de HxS produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro
producido.
Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepción de algunas cepas de
Proteus morganii, desamina a la lisina a ácido -cetocarbónico. Este último forma
compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de cultivo con la sal de
hierro y bajo la influencia de oxígeno.
Solución de acriflavina
Clorhidrato de acriflavina 15,0 mg
Agua destilada 10.0 mL
Solución de ácido nalidíxico
Acido nalidíxico (sal sódica) 40,0 mg
Hidróxido de sodio 0.05N 10.0 mL
Solución de cicloheximida
Cicloheximida 50,0 mg
Etanol 4.0 mL
Agua destilada 6.0 mL
165
Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante
su manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos
Principio de acción
Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrógeno, vitaminas y
minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene
el balance osmótico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora.
El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El ácido nalidíxico
inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina
suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora
para inhibir hongos saprofíticos.
166
Principio de acción
El agar Mac Conkey es un medio selectivo y diferencial. La selectividad del medio
esta dada por las sales biliares que inhiben el desarrollo de bacterias Gram-
positivas. El cristal violeta es un colorante que también inhibe el crecimiento de
algunas bacterias Gram-positivas. Finalmente, las peptonas constituyen la principal
fuente de nutrimentos.
Principio de acción
Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un
carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible.
La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un
sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos
característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético
y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f)
ácido succínico a ácido propiónico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y
h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la
fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los
167
productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire
del indicador a amarillo.
Malonato, caldo.
Principio de acción
Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio
como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un
inhibidor enzimático competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El
amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima
no puede combinarse con el sustrato normal, el ácido succínico, cesando de esta
manera la función normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los
microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn
o utilizar el malonato como única fuente de carbono. Microorganismos que pueden
realizar esta actividad metabólica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter.
168
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para
disolver por completo y ajustar el pH a 7.0 0.2 a 25°C. Distribuir en tubos de
ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15
minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola
vez cuando se necesite.
Principio de acción
La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas
complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura
proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los
microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo
que no contiene inhibidores.
MTM, medio.
Nitratos, caldo.
Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter
en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C
durante 15 minutos.
Principio de acción
En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene
reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo,
este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reacciòn de
diazoaciòn y copulaciòn) o bien llegar a nitrògeno libre, que se detecta por burbujas
en el medio.
169
Oxford, medio base (OXA).
Principio de acción:
La flora acompañante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato
de colistina, cefotetán, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la
esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formación de hierro
(III), que producen compuestos complejos negros, que luego tiñen de negro las
colonias de L. monocytogenes.
170
Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un
potenciómetro.
Principio de acción
A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa
que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras
bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen
los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido
tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido.
Principio de acción
Este medio sirve para observar la fermentaciòn de azùcares con producciòn de
acidez.
171
Principio de acción
La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la
obtención de energía. Los productos finales de la oxidación de la glucosa varían
dependiendo de la ruta metabólica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por
lo tanto se describen a continuación dos vías:
Prueba de Voges-Proskauer
172
Salmonella y Shigella, agar (SS).
Principio de acción
El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de
Salmonella y Shigella a partir de muestras patológicas, alimentos contaminados,
etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompañante son
inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El
tiosulfato en combinación con el fierro actúa como indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las
colonias. Las colonias de coliformes quedan señaladas por la demostración de la
degradación de la lactosa a ácido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal
forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las
de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas.
173
Principio de acción
Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos,
pudiendo diferenciar las hemòlisis alfa o beta.
Selenito-cistina, caldo.
Principio de acción
El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a
partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de
bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la
incubación. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo
clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos
componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser
resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable
para prevenir un incremento en el pH durante la incubación ya que cualquier
aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de
que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa
puede explicar que resistan la inhibición. El efecto de la cistina puede deberse a
dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del
selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la
bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito.
174
Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM).
Principio de acción
El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es móvil, esto es
que presente flagelos, lo cual se observa si después de incubar existe desarrollo
más allá de donde pasó el asa microbiológica al inocular al medio, b) si el
microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta ácido sulfhídrico, que al
estar este último en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que
es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano
que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la
eliminación del grupo alquilo, que está constituido por un aminoácido,
transformándose esta fracción a ácido pirúvico y amoníaco, gracias a la presencia
de la triptofanasa.
Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo.
Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante
15 minutos, el pH final serà de 7,3 ± 0,2.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc.
175
Soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL.
(Listeria).
Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos.
El pH final de la solución debe ser 7,3 ± 0,2.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El
caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el
preenriquecimiento de Salmonella.
176
Adicionar al caldo soya tripticaseína el sulfito de potasio por cada 1.0 L de medio,
de tal forma que la concentración final del sulfito de potasio sea 0.5%. Esterilizar a
121 1°C por 15 minutos.
Principio de acción
Este medio es altamente nutritivo y versátil, se recomienda para uso en general.
Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el
crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El
caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el
preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio actúa como un agente
selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el
desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la
producción de ácido sulfhídrico.
Surraco, caldo
Sacarosa 0.8 g
Urea 0.8 g
Azul de timol 4 gotas
Base caldo rojo de fenol 1.5 g
Agua destilada 100 mL
Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada,
agregar 0.8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solución se
toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en
autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 10 minutos (EVITAR
SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltración, agujas y
jeringas. Una vez esterilizado el material y los médios, dejar enfriar. Al matraz con
los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0.8 g de urea,
agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el
contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado)
al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estéril y
distribuir volúmenes de 3.0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados
previamente.
Principio de acción.
Medio para la diferenciación de microorganismos, especialmente de la familia
Enterobacteriaceae basándose en la producción de ureasa y/o de fermentar la
sacarosa. El medio de cultivo está libre de carbohidratos fermentables, si el
177
microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del
indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la
urea, forman amonio, produciendo reacción alcalina en el medio que se manifiesta
por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol.
Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución del agar. En caso
de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y después de esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deberá estar en 7.2±0.2. Para el
llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50°C antes
de llenar las cajas.
Principio de acción
Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las
diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de
sodio de esta fórmula por la deseada.
Principio de acción
Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las
diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de
sodio de esta fórmula por la deseada.
178
Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS).
Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen
requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar
con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No
esterilizar y ajustar el pH a 8.6±0.2 a 25°C; enfriar a 50°C y colocar el medio en
cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45°C antes de usarlas.
Principio de acción
La alta concentración de tiosulfato y citrato, así como la fuerte alcalinidad de este
medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y
el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria
coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas
cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar
colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de
indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando
hay liberación de ácido, aún en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar
a 35°C aeróbicamente durante 18 a 24 h.
179
Tetrationato, caldo.
Principio de acción
El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de
Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados,
etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e
inhiben junto con la solución de verde brillante especialmente a la microbiota
Gram-positiva. La adición de la solución yodo-yoduro funciona para formar el
tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se
desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras
que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos.
Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia
disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al
medio de cultivo 40.0 g de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la
adición del yodo-yoduro.
Triptona o tripticasa 10 g
Agua destilada 1.0 L
Principio de acción
La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la
diferenciación de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un
aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e
indolacétco.
180
La enzima triptofanasa cataliza la reacción de desaminación del triptofano
produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. El ácido pirúvico puede ser
catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO 2 y agua; el
amoníaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar
nuevos aminoácidos. El indol puede ser detectado si se combina con el
paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinación es un una
quinona de color rojo.
Urea, caldo.
Fosfato monopotásico 9.1 g
Fosfato disódico 9.5 g
Extracto de levadura 0.1 g
Urea de alta pureza (20%) 20.0 g
Rojo fenol 0.01 g
Agua desionizada 1,000 mL
pH 6.8
Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo. Rehidratar con el
agua desionizada. No calentar la solución, con el calor la urea se descompone.
Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121°C durante
15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtración en membrana y agregar al
medio base ya estéril y frío. De manera aséptica distribuír aproximadamente 3.0
mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca.
Principio de acción
El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas
son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima específica, la
ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoniaco. En
solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La
ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la
descomposición de compuestos orgánicos, clasificada como una amidasa. La
ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos
que contienen puestes peptídicos. El indicador rojo de fenol virará a un colo rosa-
rojo intenso cuando la prueba sea positiva.
181
Urea rápido, caldo.
Principio de acción
Ver caldo urea. Para la prueba rápida de la urea el indicador virará a color cereza
(púrpura rojizo), en caso de ser positiva.
Vassiliadis-Rappaport, caldo.
Solución A
Triptona 5.0 g
Cloruro de sodio 8.0 g
Fosfato monobásico de potasio 1.6 g
Agua destilada 1.0 L
Solución B
Cloruro de magnesio hexahidratado 400.0 g
Agua destilada 1.0 L
Solución C
Oxalato de verde de malaquita 0.4 g
Agua destilada 100.0 mL
182
Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en
frasco ámbar a temperatura ambiente.
Solución A 1000.0 mL
Solución B 100.0 mL
Solución C 10.0 mL
Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las
soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estériles en cantidades de
10.0 mL. Esterilizar a 115°C durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para
que al final de la esterilización sea de 5.2. Almacenar en refrigeración.
Principio de acción
Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento
de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede también utilizarse
para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una
cantidad de inóculo pequeña. La formulación se desarrolló denotando cuatro
características que posee Salmonella cuando se compara con la familia
Enterobacteriaceae:
1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmóticas relativamente altas
2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos
3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita
4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos
Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus.
183
Principio de acción
El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el
viraje a amarillo del rojo de fenol, que actúa como indicador de pH. En ambiente
alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompañante Gram-positiva, así
como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del
verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la
sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota
acompañante lactosa-positiva débil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva.
Para la inhibición de Proteus se recomienda la adición de desoxicolato de sodio al
0.2%. La adición de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar
1.0 g de sulfonamida o 0.8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en
la forma habitual.
Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con
lactosa, caldo (Brila).
Xilosa 3.75 g
L-lisina 5.0 g
Lactosa 7.5 g
Sacarosa 7.5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Rojo de fenol 0.08 g
Agar 15.0 g
Desoxicolato de sodio 2.5 g
Citrato férrico amoniacal 0.8 g
Tiosulfato de sodio 6.8 g
Agua destilada 1.0 L
0.2
Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en baño de agua a
55°C, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH a 6.9
0.2. Enfriar a 50°C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El
sobrecalentamiento produce una precipitación, la reactividad del medio puede ser
satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeñas.
Principio de acción
Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificación presuntiva de
Salmonella y Shigella. Basado en la fermentación de la xilosa, la descarboxilación
de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico para la diferenciación inicial entre
Shigella y Salmonella de otras bacterias no patógenas. La Salmonella es
reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el ácido
sulfhídrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un
184
compuesto de color negro. La fermentación rápida de la xilosa es casi universal
entre las bacterias entéricas excepto para los miembros de los géneros Shigella,
Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las
especies del género Shigella pueden identificarse por una reacción negativa. Las
especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patogénicos por la
incorporación de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la
lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reacción presentada por
Shigella. Sin embargo, la presencia de los géneros Salmonella y Edwardsiella se
diferencia de las de Shigella por un indicador de la producción de ácido sulfhídrico.
Por otra parte, la gran concentración de ácido producido por la fermentación de la
lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan
el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de ácido sulfhídrico
no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos
microorganismos hasta después de 18-24 h. de incubación. El desoxicolato de
sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el
desarrollo de Shigella y Salmonella.
185
DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES.
Etanol 70 %.
70.0 mL
Alochol etílico absoluto
Agua destilada 100.0 mL
186
cada monografía, se debe esterilizar a 121°C±1.0°C durante 15 minutos. Después
de la esterilización, los volúmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales.
Reactivo de Kovac’s.
p-dimetilaminobenzaldehído 5g
Alcohol amílico (normal) 75 mL
HCI concentrado 25 mL
Principio de acción
El triptofano es un aminoácido, que por acción de la triptofanasa lo degrada en
indol, escatol y ácido indolacético . Un intermediario importante es el ácido
indolpirúvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile
el ácido indolacètico, se forma el escatol
Reactivos
Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) ó agar triple azúcar hierro
(TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solución
fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión
una gota de tolueno y mezclar enérgicamente unos segundos para liberar la
enzima de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de
solución buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37ºC.
187
positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como
negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo indica que el
organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la
-galactosidasa.
Principio de acción
El ortonitrofenil galactósido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo
que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil.
Reactivo de oxidasa.
N-Tetrametil-p-Fenilendiamina 0.5 g
Agua destilada 100 mL
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Principio de acción
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último
eslabón de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrógeno) al
oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los
microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de
oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la
enzima o son anaerobios obligados.
La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-p-
Fenilendiamina, que acúa como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al
oxígeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de
citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
Plasma de Conejo.
Principio de acción
El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un coágulo de
fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de
calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y ésta última
al encontrarse frente al fibrinógeno, forma un coágulo de fibrina.
189
Rojo de metilo, reactivo.
190
Voges-Proskauer, reactivos (VP).
VP 1
alfa-naftol 5g
Alcohol absoluto 100 g
VP 2
Reactivo A
Alfa-naftilamina 0,5 g
Àcido acètico 5N 100,0 mL
Reactivo B
Reactivo C
Alfa-naftol 1,0 g
Àcido acètico 5N 200,0 mL
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TINCIONES
Gram
Alcohol-acetona
Cristal violeta
Solución A
Cristal violeta 2.0 g
Etanol (95%) 20,0 mL
Solución B
Oxalato de amonio 0.8 g
Agua 80.0 mL
Solución de Yodo
Yodo 1,0 g
Yoduro de potasio 2,0 g
Agua 300,0 mL
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Solución de Safranina
Safranina 0,25 g
Etanol (95%) 10,0 mL
Agua 100,0 mL
Impronta Húmeda
193
Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos.
194
ANEXO II
195
provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco
cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los
casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la cocción completa de la carne
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