INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ACAPULCO 

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
BIOQUÍMICA  

Materia: Análisis Instrumental

Profesora: Zarate Juarez Monica
Horario: 14:00 – 15:00    10:00 – 13:00

EQ.#6  INTEGRANTES:
1. Bello Tolentino Denisse............................ 19320323
2. Becerra Campos Carlos Alberto..........19320322 
3. De la Cruz Solis Reyna Zaira..................19320341 
4. Orbe Arroyo Cecilia Alexandra..............19320414
5. Parral Ruiz Virginia........................................19320416
Cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC)
 Fundamento
• Este tema trata los cuatro tipos básicos, de cromatografía en los que la
fase móvil es un líquido: (1) la cromatografía de reparto; (2) la
cromatografía de adsorción, o cromatografía líquido-sólido; (3) la
cromatografía iónica; y (4) cromatografía de exclusión por tamaño, o
cromatografía en geles. 
• La mayor parte de este capítulo tiene relación con las aplicaciones de
estos cuatro importantes tipos de cromatografía en columna. 

Sin embargo, el último apartado presenta una breve descripción de la

cromatografía de líquidos en plano, dado que esta técnica proporciona
una forma simple y barata de obtener información acerca de las
condiciones óptimas más probables para llevar a cabo las separaciones
en columna. 
 • En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en
columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm;
en este tipo de columnas realizó Tswett sus trabajos originales. Para
asegurar unos caudales razonables, el diámetro de las partículas de la fase
estacionaria sólida por lo general era de 150 a 200 µm.

 Sin embargo, los intentos para acelerar el procedimiento clásico mediante

la aplicación de vacío o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el
aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima
del mínimo característico que se observa  en las gráficas de la altura de
plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. 
 Instrumentación para cromatografia de
liquidos

• Para alcanzar un caudal eluyente

razonable con rellenos  de tamaño de
partícula entre 2 y 10 μm.

• Se requieren de presiones de kg-

fuerza por centímetro cuadrado.
En este esquema muestra los componentes fundamentales de un
cromatógrafo de líquidos de alta eficacia típica.
 28C-1 Recipientes para la fase movil y sistemas para
el tratamiento de los disolventes
• Los aparatos HPLC están equipados con 1 o mas recipientes de vidrio o de acero inoxidable donde se
contienen de 200 a  1000 mL de un disolvente.
• Equipos que eliminan gases (O, N)
• Burbujas que provocan ensanchamientos de banda  e interfieren en el funcionamiento del detector.
• Un dosificador consiste en un sistema de bombeo de vacío, sistema de destilación, dispositivos para
calentar y agitar los disolventes.
• Dispositivos para la filtración
• Elución isocrática (donde solo se utiliza un disolvente de composición constante)
• Elución congradiente
28-5A  Se inicia con una mezcla
40:60 de los disolventes  y se va
aumentando la concentración de
metanol un 8 por 100/min. 28-5B Metanol/Agua v/v 50/50
 28C-2  Sistemas de bombeo
• 1) La generación de presiones por encima de 6000 psi
• 2) Un flujo libre de pulsaciones 
• 3) Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min
• 4) El control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0.5 por 100 relativo
• 5) Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o teflón)

Tipos de bombas:
• Bombas reciprocas
• Bombas de jeringa o de desplazamiento
• Bombas neumáticas o de presión constante
 Bombas recíprocas
• Se utilizan en aproximadamente el 90 por 100 de los sistemas de HPLC comerciales,
consisten, por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por
el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor de arrastre.
 Desventajas de las bombas recíprocas

• Producen un flujo pulsado, que se ha de amortiguar dado que su presencia se

manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma.

Ventajas de las bombas recíprocas

• Se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 microlitros), sus altas
presiones de salida (por encima de los 10,000 psi), 
• Su fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes, que son
prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad
del disolvente.
 Bombas de desplazamiento
• Consisten por lo general en unas grandes cámaras como una jeringa,
equipadas con un embolo que se activa por un mecanismo de tornillo
accionado mediante un motor paso a paso.
• Producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la
contrapresión. Además, el flujo que resulta esta libre de pulsaciones.

Desventajas:
Incluyen una capacidad de disolvente limitada (aprox 250 mL) y una
notable incomodidad para el cambio de disolventes.
 Bombas
neumáticas
• La fase movil se encuentra en un recipiente
plegable colocado en una vasija que puede
presurizarse mediante gas comprimido.

• Son baratas y estan exentas de impulsos;

aunque tienen una limitada capacidad y
presion de salida y ademas el caudal depende
de la viscosidad del disolvente y de la
contrapresion de la columna.

• No son utilizadas en la elucion con gradiente

y estan limitadas a presiones menores de unos
2000 psi.
 Control del caudal y sistemas de
programación
• Estos son controlados por ordenadores que permiten medir el caudal mediante la
determinacion de la caida de presion a traves de un restrictor colocado en la salida de la
bomba.

Diferencias:
Entre la señal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad
del motor de la bomba.
La mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicion del disolvente bien sea
de una forma continua o bien de forma escalonada.
Sistemas de Inyección de muestra

El medio mas simple y antiguo para la introducción de

las muestras implicaba la inyección con un jeringa a
través de un elastómero.
Flujo detenido:  Es un dispositivo de mezcla rápida
utilizado para estudiar la cinética química de
reacciones rápidas en solución. 
Flujo del disolvente : Se refiere al movimiento de
agua a través de una membrana semipermeable,
debido a una diferencia en la osmolaridad o
concentración de solutos a ambos lados de la
membrana, lo que genera una diferencia de presión
osmótica, fuerza necesaria para el movimiento del
agua. Para la Cromatografía de líquidos se usan
los bucles de muestra 
Inyección mediante válvula de 6 vías
Columnas para cromatografía de líquidos
• Columnas analíticas: Es posible encontrar columnas  con forma helicoidal pero hay perdidas de eficacia. 
y  el rango usado del diametro interno es de 4 a 10 mm .

La columna frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, y rellena con

partículas de 5 km. Este tipo de columnas tiene de 40.000 a 60.000 platos/metro. 
 Columnas termostastizadas
Precolumnas
La mayoria de los
instrumentos control
llevan la temperatura de
la columna a las
décimas de grado, desde
la temperatura ambiente
hasta 100 o 150 °C. 

La precolumna sirve para saturar la

fase móvil con la fase estacionaria
y así minimizar las pérdidas de ésta
en la columna analítica. 
Tipos de rellenos de la columna 
• Pelicular: Consiste en bolas de vidrio o de polímero, no
porosas y esféricas con unos diámetros característicos de
30 a 40 pm. 

• Partícula porosa: Están formados por micropartículas  

porosas con diámetros   entre 3 y 10 km y con la menor
dispersión posible con respecto a un tamaño
determinado. 

Detectores
Es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una
propiedad física del eluyente, que deberá depender de la
composición de éste. La detección en cromatografía se realiza,
habitualmente , en continuo, aunque es posible la utilización de los
colectores de fracciones para l identificación y cuantificación de
pequeñas fracciones del eluyente.
Tipos de detectores
Los detectores que se basan en la medida de una
propiedad de la disolución responden a una propiedad del
efluente.

Los detectores basados en una propiedad del soluto

responden  a alguna de las  propiedades del soluto.

Detectores de absorbancia
Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de
doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta
de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su
intensidad. Para comparar las intensidades de los dos
haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. 
Detectores de absorbancia
ultravioleta con filtros

Lo más común en estos casos es aislar la línea

intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos
equipos también se pueden utilizar las líneas a
250, 313, 334 y 365 nm .

Estos dispositivos son especialmente útiles en la

repetición de los análisis cuantitativos cuando se
conoce la composición cualitativa de la muestra,
de tal forma que se puede elegir una secuencia de
filtros apropiados. 
Detectores de absorbancia ultravioleta con
monocromadores
Algunos detectores consisten en un
espectrofotómetro de barrido con una red
entre sus componentes ópticos.

Unos se limitan a la radiación

ultravioleta; y otros abarcan la
radiación ultravioleta y la visible

Los detectores espectrofotométricos de

ultravioleta más potentes son los
instrumentos de diodo en serie
Detectores de absorbancia en el infrarrojo
El detector tiene un barrido de longitud de onda que
proporciona 3 filtros circulares variables

Es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los

instrumentos de transformada de Fourier
Los instrumentos del infrarrojo más sencillos
pueden trabajar a una o más longitudes de
onda, se puede obtener un espectro de los
picos parando el flujo en su tiempo de
elución. 

Los intrumentos con transformada de

Fourier se utilizan de manera análoga a
los instrumentos de diodos en serie para
las medidas de absorbancia ultravioleta 

Una de las desventajas o limitaciones es que

el uso de detectores infrarrojos es la baja
transparencia de disolventes, como por
ejemplo: absorción infrarrojo del agua y de
los alcoholes
 Detectores de fluorescencia
La fluorescencia se detecta por medio de un detector
fotoelectrico colocado perpendicularmente respecto
al haz de exitación. Los detectores más sencillos
utilizan una fuente de excitación de mercurio

Los intrumentos mas sofisticados utilizan una fuente de

xenón y emplean un monocromador de red para aislar la
radiación fluorescente.

Las ventajas es la alta sensibilidad que resulta ser más un orden de

magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia y esto
resulta beneficioso para la cromatografia de liquidos que
aprovecha para la separación y determinación de los componentes
fluorescentes de las muestras. 
Detectores de índice de refracción

Los detectores de índice de

refracción son universales Son fiables, sin embargo son muy sensibles a los
análogos por que responden a casi cambios de temperatura
todos los solutos.
Detectores de luz dispersada tras
evaporación
La ventaja es su respuesta resulta
ser aproximadamente la misma
para todos los solutos no volátiles.
Detectores electroquímicos
Se muestran intervalos de
potencial en lo que puede tener
lugar la oxidación o reducción de
16 grupos funcionales orgánicos

Los detectores electroquimicos se basan en la amperometría,

voltamperometría, culombímetria y la conductimetría.
La superficie del electrodo forma parte de un
canal formado al insertar una junta de teflón de
50 micro metros entre dos bloques moldeados de
plástico de Kel-F

El electrodo indicador/trabajo es de platino, oro,

carbón vítreo o de pasta de carbono. 

El electrodo de referencia y a menudo el

contraelectrodo se colocan adelante en el canal de
flujo, después del bloque en el que se encuentra
el electrodo indicador
Detección por espectrometría de masas
Un problema fundamental del acoplamiento de la
cromatografia de liquidos en el enorme contraste entre
los volúmenes grandes de disolvente y los
requerimientos de vacío de la espectrometría de masas

La primera interfase el efluente de la columna se

divide y solo una fracción se introduce en el
espectrómetro de masas

En la segunda interfase  el efluente de la

columna se deposita sobre una cinta o
alambre que se mueve continuamente y
transporta el disolvente y el analito hacia una
camara calorifica para la eliminación del
primero por volatilización. 
 Una nueva interfase que permite obtener espectros
de impacto electrónico como de ionización
química.

La nebulización térmica y la desolvatación

ocurren simultaneamente y producen una
mezcla de particulas del soluto en suspensión
y moléculas gaseosas de la fase móvil.

El aerosol acelera a través de una boquilla de inyección

hacia una zona de vacío donde las moléculas de fase
móvil se bombean hacia el exterior.

Con los detectores de espectrometría de masas, se emplea el control y el almacenamiento

de datos por ordenador.  Se obtienen cromatogramas en tiempo real como los
reconstruidos por ordenador
 CAMPO DE APLICACIÓN DE LA HPLC
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada,
con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de mil millones de dólares. 

La popularidad de esta técnica se debe a:

 Su sensibilidad
  A su fácil adaptación a las determinaciones
cuantitativas exactas
 A su idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles 
  Y a su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial interés en la industria, en muchos campos de
la ciencia y para la sociedad en general.
 APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
 Cromatografía de exclusion por tamaño
Se utiliza para solutos con masas moleculares superiores a 10.000 gr/mol.

Las moléculas se separan de más grandes a

más pequeñas en proporción a su peso
molecular en disolución.

 La cromatografía de filtración en gel

Los componentes básicos son:

 La matriz
 La columna de cromatografía
 Tampón de elución
 Cromatografía de intercambio  iónico  Ablandamiento
Se utiliza para especies iónicas de masa molecular • Se emplea una resina intercambiadora de
mas pequeña.  cationes fuertemente ácida en forma sodio. 
Resinas de intercambio iónico

•Lavanderías
•Calderas domésticas
•Calderas industriales de baja presión
•Industria textil

Descarbonatación
• Los iones de calcio y de magnesio asociados Desmineralización de suero de leche
con estos se pueden eliminar con resinas El suero de leche es un líquido obtenido en el
débilmente ácidas en forma hidrógeno. proceso de fabricación del queso. Contiene
proteínas y tiene varios usos en la industria
alimenticia. Se desmineraliza para aumentar
El agua descarbonatada sirve:
•Para tratar el agua de producción de cerveza y otras bebidas su pureza.
•Para ablandar las aguas de abastecimiento en ciudades y pueblos
•En casa, para filtrar, ablandar y desmineralizar parcialmente el agua para
hacer café o té
  Cromatofrafía de adsorción
Este procedimiento se utiliza muchas veces para la separación de los integrantes de una serie homóloga.
Las tres diferencias clave
1.La absorción es un fenómeno de masa y volumen; la adsorción es un fenómeno
superficial.
2.La absorción es un proceso endotérmico, la adsorción es un proceso exotérmico.
3.En la absorción, el absorbato se distribuye con una concentración homogénea en el
absorbente; en la adsorción, el adsorbato se acumula en la superficie.

La cromatografía de adsorción, aplicada a la Separación de la glicirricina mediante

separación de una mezcla constituida por CCF
dos sustancias. Los extractos diluidos en etanol (50%) de
las muestras se analizarán mediante CCF
para separarlos de otros fitoconstituyentes
Cromatografía en capa fina (CCF)
presentes
La fase estacionaria consiste en una
capa delgada de un adsorbente (como
por ejemplo gel de sílice, alúmina o
celulosa.