PCR en tiempo real:

La PCR en tiempo real o la PCR cuantitativa en tiempo real es un método

molecular en el que podemos cuantificar el ácido nucleico (ADN o ARN) de
manera eficiente. Incluso la expresión de un gen en un tejido particular también se
puede medir utilizando el método qPCR.
El método se basa en el uso de fluorocromos. Una vez que el oligo marcado con
flúor se une a su secuencia complementaria en el ADN objetivo, emite
fluorescencia. El nivel de fluorescencia emitida se mide mediante el instrumento
de PCR en tiempo real.
La cantidad de fluorescencia emitida es directamente proporcional a la cantidad de
ADN objetivo amplificado.
Se utilizan dos métodos para el análisis cuantitativo.
Método basado en colorantes
Método basado en sondas
En el método basado en colorantes, el colorante se une al ADN bicatenario que
emite fluorescentes que se miden para la cuantificación.
En el método basado en la sonda, la sonda marcada con flúor se une
directamente a la secuencia complementaria en el ADN objetivo.
La fluorescencia liberada por la sonda es directamente proporcional al objetivo
amplificado.
Esta es una idea breve y general detrás de la PCR en tiempo real. Lea nuestro
artículo sobre más detalles de la PCR en tiempo real: PCR en tiempo real:
Principio, procedimiento, ventajas, limitaciones y aplicaciones
Se utilizan tres tipos de sondas en el método de hibridación basado en sondas:
Sondas lineales
Balizas moleculares
Sondas de escorpión
¿Qué es la baliza molecular?
Las balizas moleculares son la sonda TaqMan utilizada en la PCR en tiempo real,
principalmente para aumentar la especificidad de la reacción.
Es una estructura de horquilla oligonucleotídica monocatenaria compuesta de 25 a
30 nucleótidos. En el que los 15 a 20 nucleótidos presentes en el bucle medio son
complementarios a la secuencia de nuestro interés.
Mientras que las secuencias presentes en ambos brazos son complementarias
entre sí. Por lo tanto, permanece limitado entre sí.
Estructura:
Las balizas moleculares constan de 4 partes.
Un tallo, bucle, extremo 3 'y el extremo 5'.
Vástago:
El paso consta de 7 a 9 nucleótidos que son complementarios entre sí. Los
nucleótidos en el paso permanecen unidos entre sí si la baliza está en el estado
relajado.
Lazo:
El bucle es la parte central de las balizas moleculares, lo cual es muy importante,
ya que es complementario a la secuencia objetivo.
La parte central del bucle contiene de 15 a 20 nucleótidos, complementarios a la
secuencia de nuestro interés.
Extremo 3 ':
El extremo 3 'de las balizas moleculares contiene el tinte apagador. Este tinte
apagador en el extremo 3 'está muy cerca del extremo 5', evita la emisión de
fluorescencia.
Extremo 5 ':
El extremo 5 'OH de la sonda contiene el tinte fluorescente. Una vez que la baliza
se une a la secuencia complementaria, el tinte fluorescente se apaga, se libera y
emite la fluorescencia.
¿Cuál es la importancia de las balizas moleculares?
La unión no específica es uno de los principales problemas en cualquier reacción
de PCR, incluso en la PCR en tiempo real también.
El ensayo de cuantificación por PCR en tiempo real es demasiado sensible,
detecta algunas de las plantillas sensibles y lo cuantifica. Es aplicable
principalmente en el campo de diagnóstico, así que imagine lo crítico que es evitar
cualquier error durante la PCR.
¿Cuál es el problema con la sonda lineal TaqMan?
Las sondas lineales TaqMan son secuencias largas de 18 a 20 nucleótidos en las
que un extremo contiene el colorante fluorescente mientras que otro extremo
contiene el colorante apagador.
El problema con esto es si encuentra algunas de las bases complementarias, se
hibrida, el fluorocromo se apaga y libera la fluorescencia.
Por lo tanto, usar una sonda lineal en el punto final en tiempo real o en un ensayo
de PCR en tiempo real no es una buena opción siempre.
Las balizas moleculares son sondas especialmente diseñadas en las que, si no
está unido a ninguna secuencia, se ahorra la mayor parte de su energía
(permanece en el estado de horquilla: estado relajado).
Pero una vez que se une a su secuencia complementaria o en presencia de la
secuencia complementaria, las balizas se despliegan.
El fluorocromo ya no se apaga. Se libera y emite la fluorescencia.
La explicación detallada paso a paso del mecanismo de acción de las balizas
moleculares se muestra en la figura a continuación.

A medida que cada sonda se une a su secuencia complementaria, la cantidad de

fluorescencia emitida se mide en tiempo real.
Dependiendo de eso, se mide la plantilla de ADN.
Después de cada ciclo de PCR, se hibridan más sondas, se emite más
fluorescencia y se cuantifican más plantillas.
Todo el mecanismo de las balizas moleculares se basa en la estabilidad del
híbrido formado durante la amplificación (ADN: híbrido de ADN o RNR: híbrido de
RNR).
La estabilidad de la sonda y el ADN perfectamente adaptados es mayor en
comparación con la estabilidad de la falta de coincidencia. La horquilla hace que el
híbrido de desajuste sea térmicamente menos estable que la coincidencia exacta.
Por lo tanto, la horquilla se abre solo en presencia del híbrido más estable, es
decir, el emparejamiento de bases exacto.
Además, la estabilidad del emparejamiento de base complementario es más en
comparación con la estabilidad del emparejamiento de base del vástago, por lo
tanto, una vez que se encuentra la coincidencia exacta, el vástago se despliega.
[ CITATION Bal19 \l 9226 ]
La imagen muestra cómo se comportan las balizas en presencia de una secuencia complementaria
y

una secuencia no complementaria.

Bibliografía
Baliza molecular: una horquilla que mejora la especificidad de PCR en tiempo real. (26 de 04 de
2019). Obtenido de https://geneticeducation.co.in/molecular-beacon-a-hairpin-that-
enhances-real-time-pcr-specificity/

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mayo de 2020 de https://tecnolab.com.ar/literatura.php?noticia_ID=28
- Dr. Roberto P. Stock Silberman ,Métodos físico-químicos en Biotecnología (2006-II).
Recuperado el día 19de mayo de 2020 de file:///C:/Users/USUARIO-PC/Videos/TALLER
%20MOLECULAR%20PCR/PCR%20TIEMPO%20REAL.pdf