métodos de

separación de
muestras:
tema 4:
electroforesis
 ÍNDICE:
1. Nociones previas
2. Bases teóricas del movimiento
iónico en un campo eléctrico
3. Medios de soporte electroforético
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nociones previas
Aminoácidos, péptidos y proteínas, o nucleótidos y
ácidos nucleicos son biomoléculas dotadas de carga
neta y, por ello, sensibles a la presencia de un campo
eléctrico externo.

Por electroforesis se entiende el movimiento de

moléculas o partículas cargadas en un campo
eléctrico.

Se puede realizar con propósitos analíticos de

identificación o de caracterización física de los
componentes de una muestra, o también para su
separación preparativa.

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nociones previas
La electroforesis encuentra su máxima utilidad en los análisis de
composición de mezclas y en la determinación de la pureza
de muestras.
Cuenta con un amplísimo abanico de
aplicaciones que resultan indispensables en
los más variados ámbitos de las biociencias.
Y así, el conjunto de técnicas electroforéticas
se ha erigido en una pieza de recurso
obligado en los estudios de caracterización
de macromoléculas y de determinación de
su pureza, especialmente de ácidos nuclei-
cos y proteínas.

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movimiento de moléculas en la
electroforesis
Las moléculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad opuesta
a la carga neta de la molécula (los cationes se mueven hacia el cátodo y
los aniones hacia el ánodo).
El medio necesita estar amortiguado al pH que produce la dirección y tasa
apropiada de migración.

(–) –
cátodo –
(reducción)

–
+
++ – (+)
––
ánodo
e– (oxidación)

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 bases teóricas
del movimiento
iónico en un
campo eléctrico
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bases teóricas del movimiento iónico en un campo eléctrico

F ánodo
– – +
F’

intensidad del campo = F = E/d . q

E = diferencia de potencial entre
los electrodos  = fuerza del campo
d = distancia entre los electrodos
q = carga de la partícula en tránsito
resistencia por fricción = ecuación de Stokes. F’ = f = 6r
F’= fuerza de arrastre ejercida sobre una partícula esférica
r = radio de la partícula
 = viscosidad de la disolución
 = velocidad de desplazamiento de la partícula
F = F’  E/d . q = 6r  = Eq/d6r = q/6r
movilidad electroforética  =  / = q / 6r
 =  / = q / f = Ze / f
Z = nº unidades de carga de la molécula coeficiente de fricción
e = unidad de carga (del electrón)

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 medios de
soporte
electroforético
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cátodo ánodo

ELECTROFORESIS (de
INTERFASE) LIBRE:
en disolución, poco
resolutiva.

cátodo medio ánodo ELECTROFORESIS DE ZONA:

de sobre un medio de SOPORTE
soporte mecánico sólido y poroso (que
retiene las moléculas).
+- La migración electroforética de
una molécula puede realizarse
dentro de cualquier medio, pero
generalmente es una matriz.

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ELECTROFORESIS (de
INTERFASE) LIBRE o de
FRENTE MÓVIL
En 1937, el bioquímico sueco Arne
Tiselius y sus colaboradores
introdujeron la separación de proteínas
(plasmáticas) mediante electroforesis en
un dispositivo en forma de U conocido
como célula de Tiselius.

Estos trabajos le valieron el premio

Nobel en 1948.
(1902 - 1971)

Premio Nobel a Arne

Tiselius (en 1948) “por su
descubrimiento de la
electroforesis”.

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cátodo ánodo

ELECTROFORESIS (de
INTERFASE) LIBRE:
en disolución, poco
resolutiva.

cátodo medio ánodo ELECTROFORESIS DE ZONA:

de sobre un medio de SOPORTE
soporte mecánico sólido y poroso (que
retiene las moléculas).
+- La migración electroforética de una
molécula puede realizarse dentro
de cualquier medio, pero
generalmente es una matriz.

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 electroforesis
de zona:
electroforesis en
papel
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electroforesis en papel
componente mezcla componente
ánodo separado aplicada separado cátodo
+ –

papel

cubeta

–
+

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electroforesis sobre papel

– +

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electric supplier

electrohoretic support

electrolyte

start paper filter

Fue el primer soporte electroforético en ser utilizado para practicar separaciones de

compuestos (Tiselius, 1937).
Es un soporte fácil de utilizar para este propósito porque no requiere una preparación
específica para obtener la matriz de separación.
No obstante, su capacidad resolutiva es limitada.
En 1957, Kohn introdujo un nuevo medio de soporte, el acetato de celulosa.
Kohn, J. A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim.
Acta 2:297, 1957.
El acetato de celulosa es preferible al papel porque se trata de un material más
homogéneo, con un tamaño de poro uniforme y que NO adsorbe las proteínas en la
medida en que lo hace el papel.
Este soporte aún conserva algunas aplicaciones concretas, particularmente en el ámbito
de los análisis clínicos de las muestras de suero.

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análisis de proteínas plasmáticas por

electroforesis en acetato de celulosa
punto de aplicación

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS POR

trasELECTROFORESIS
realizar la EN ACETATO DE CELULOSA avance
preparación corriente
eléctrica electroforesis tinción
(– ) (+ )
aplicación de la
-

muestra de
plasma o suero -
 perfil electroforético

absorbancia
  proteinograma albúmina
densitograma
globulinas
  
tira de acetato de celulosa todas las proteínas  
impregnada con tampón de plasmáticas adquieren
pH básico (típicamente 8.6) carga negativa y por ello
distancia avanzada
y sus extremos avanzan hacia el ánodo
sumergidos en las cubetas
de tampón mayor movilidad

mayor carga negativa

menor punto isoeléctrico

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electroforesis en geles horizontales

de acetato de celulosa (cellogel)

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albúmina

muestra

- Avance de las proteínas

+ Avance de las proteínas

Campo eléctrico (V) albúmina

pico de
−globulina

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normal serum “red-flag” proteinogram

proteinogram “M-protein” o “M-spike”

Monoclonal gammopathy:
Patients with multiple myeloma show a
“spike” in the α2, β or γ regions of the serum
protein electrophoresis.

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ventajas de la electroforesis sobre tiras de

acetato de celulosa

fácil manejo y mínimo tratamiento previo de las tiras

ahorro importante de tiempo
tiempos de desarrollo cortos y cortos tiempos de teñido y
desteñido
la factura comercial de las tiras minimiza las diferencias en
las condiciones de electroforesis entre diferentes ensayos
empleo de pequeñas cantidades de muestra
fácil aplicación a otras técnicas analíticas, como la detección
inmunoquímica
el aparataje necesario es simple y no excesivamente caro

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tira de acetato de
celulosa (cellogel) teñida
con el colorante rojo
Ponceau para revelar la
presencia de las bandas
proteicas
al pH de trabajo todas
las proteínas tienen
carga neta negativa y se
desplazan como aniones
punto de aplicación de la
muestra (start point)

densitometrado del
cellogel para cuantificar
la cantidad de cada
grupo de proteínas
séricas

albúmina -globulinas -globulinas -globulinas

cada banda corresponde, en realidad, a muchas especies proteicas diferentes

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electroforesis de bajo voltaje en papel

tapa y asa

papel

+ –

agua para tampón

mantener la
humedad

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electroforesis
de zona:
evolución y
aplicaciones
electroforesis de zona:

electroforesis en gel
 electroforesis en
geles de
poliacrilamida
(PAGE)
Ornstein I (1964) Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann N Y Acad Sci 121:321–349.
cátodo

ánodo
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electroforesis
monodimensional
con tinción de
plata

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intercambio iónico
cromatografía de
fraccionamiento
homogeneizado

cromatografía
cromatografía
de exclusión

de afinidad
molecular
salino
Análisis
electroforético
de una
purificación
proteica
En cada calle se han
depositado 50 g de
muestra. La eficacia de la
purificación se puede
visualizar conforme la
banda de la proteína de
interés se hace más
prominente en
comparación con las
otras bandas.

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utilidad de la SDS-PAGE
para el análisis de la pureza
de muestras

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 electroforesis de
ácidos nucleicos en
geles de agarosa
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electroforesis
en gel del DNA

MÉTODOS EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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electroforesis en geles horizontales

de agarosa
start de
fuente de muestra puente
alimentación gel salino

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¿alguna pregunta?