Microbiología de los Alimentos 2012

PRACTICA Nº 01

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Y DILUYENTES

UTILIZADOS EN ALIMENTOS

I. INTRODUCCIÓN

Una preparación de material de laboratorio para la utilización en análisis

microbiológico envuelve todas las actividades necesarias para garantizar
que los frascos, utensilios, instrumentos y vidrieria en general, destinados al
contacto con muestras de alimentos, se encuentren totalmente limpios,
estériles y exentos de residuos químicos y orgánicos, en el momento del
análisis. Este trabajo envuelve las actividades de descontaminación,
descarte de residuos contaminantes, lavados, acondicionamiento y
esterilización. (DA SILVA, 1997).

1. Muestreo

El muestreo de alimentos para su análisis microbiológico consiste en la

operación de separar un número determinado de muestras de un lote,
remesa, partida, etc, con el fin de obtener resultados analíticos fiables.

La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente, cuando cabe

a la posibilidad que existan germenes patógenos o sus toxinas,
distribuidos en forma escasa o irregular en un alimento o conjunto de
alimentos del mismo origen, es igualmente necesario saber si una
remesa de productos alimentarios cumple o no las normas
microbiológicas legales establecidas para dichos productos.

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Número de Muestras

Para que el muestreo tenga utilidad estadística se debe realizar sobre

un número apreciable de unidades de un bloque.

El número de muestras destinadas a análisis microbiológicos esta en

relación con la preedición que se desea obtener en los resultados.

Se suele sugerir que el número de muestras se corresponda con la

raíz cuadrada de un número total de unidades constituyentes del lote.
También que, teniendo en cuenta el volumen del lote, se tome el 1 por
100 del total cuando el lote es grande y 10 por 100 cuando el lote es
pequeño.

El método de muestreo aleatorio es uno de los mas utilizados en

muestreo de alimentos consistente en separar del lote un número de
muestras calculado previamente, utilizando las tablas número al azar,
dicha tabla esta integrado por columnas y filas de dígitos obtenidos
mediante cálculos estadísticos.

Material Usado en el muestreo

 Envases para la toma de muestras:

Los envases entran limpios secos y estériles. Su tamaño guardara

reacción con la muestra que se vaya a tomar, serán herméticos y
inasecibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización.
Se pueden utilizar:

 Envases de vidrio de boca ancha, envases de plástico

esterilizables, bolsas de plástico esterilizable, envases metálicos.

 Instrumentos en la apertura de envases:

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 Tijeras estériles, pinzas estériles, cuchillos estériles, sondas

estériles, taladros estériles, cucharas estériles, espátulas
estériles, sierras estériles.

 Etiquetas y material para marcar:

 Etiquetas de cartulina, etiquetas adhesivas de papel, lápiz graso,

rotuladores, bolígrafos.

 Equipos de esterilización

 Autoclave pequeño, horno, mechero, quemador de gas o estufa

eléctrica.

 Refrigeración

 Neveras portátiles, cajas de plástico, aislante para muestra

refrigerada y congelada, congelador portátil

 Liquido desinfectante

 Alcohol etílico al 70%, algodón hidrófilo

 Control de temperatura

 Termómetro que marque -20º a más de 100º C

 Esterilización

 El material de toma de muestra para análisis microbiológicos

debe estar esteril, es necesario que se haya sometido

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previamente a los métodos habituales de esterilización por calor

seco o calor húmedo.

Preparación de la muestra para su envío al laboratorio

Unas ves tomadas las muestras se empaquetan de forma adecuada,

se etiquetaran y se marcaran correctamente cuidando que la etiqueta
esté bien fijadas para evitar que se pierda. La etiqueta ira enumerada
y adecuadamente identificada, debe tener los siguientes datos:

Nombre de la persona que tomo las muestras, nombre y dirección de

la empresa donde se tomo la muestra, fecha lugar y hora, clase de
alimentos, nombre del fabricante, razón por la cual se procedió al
muestreo, número, tamaño y marca, forma de transporte, punto de
origen y lugar de destino, fecha de embarque y llegada, método de
muestreo, temperatura del producto en el muestreo, y temperatura
ambiental de almacenamiento.

Transporte y conservación de la muestra.

El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestra y de

comienzo del análisis del laboratorio, debe ser lo mas corto posible,
para que en el resultado de los análisis quede reflejada con las
mayor fidelidad la flora cualitativa y cuantitativa estaban presentes en
el alimento en el momento del muestreo.

2. Preparación de Muestras

A la llegada de muestras al laboratorio, es necesario seguir unos pasos,

dentro de la sistemática analítica, que serán establecidos por el
microbiólogo en cuanto a la clase de alimentos, procedencia y fines de
análisis.

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Estos pasos conducirán a unos resultados que deberán ser

interpretados adecuadamente por el microbiólogo experto.

La operación de preparación de muestras para el análisis microbiológico

exige unas reglas de manipulación aséptica muy estrictas, así como la
utilización del material y diluyentes estériles para evitar la contaminación
exterior del alimento

Trituración y homogenización del alimento

Cuando se trata de alimentos sólidos, es necesario someterlo

previamente a una suspensión utilizando un diluyente estéril.

Toma de muestra para el análisis

La fracción del alimento destinada al análisis microbiológico debe ser

representativa de la totalidad de muestra. En general la muestra
analítica debe estar constituida por 200 gramos de las misma para la
puesta en marcha de las distintas determinaciones se utilizan 100
gramos, el resto sirve de reserva por si es necesario repetir el análisis.

Siempre que sea posible y para lograr una buena representatividad, el

tamaño de las muestra que se prepara para el análisis será toda
voluminosa que permita una buena trituración y homogenización.

Si el alimento esta integrado por diferentes fracciones se tomara

diferentes fracciones de la muestra.

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Pesada de la muestra

Como no resulta fácil pesar la muestra con exactitud sin que pueda
evitar excesiva manipulación, la técnica más sencilla consiste en:

 Tara el recipiente estéril que se vaya a utilizar para la trituración

 Introducir asépticamente una porción de de un volumen adecuado en
dicho recipiente.
 Pesar de nuevo para determinar el peso neto del aliemnto.
 Pesar con probeta graduada estéril, se añadirá la cantidad del
diluyente estéril para lograr la dilución deseada

Por ejemplo, si la suspensión madre debe tener un titulo 1:10, la cifra de

pesada obtenida del alimento se multiplica por nueve y el resultado de la
multiplicación, será el número de mililitro del diluyente que se ha de
incorporar de la muestra para conseguir dicha dilución.

Diluyente

La característica principal de un buen diluyente es que no produzca

diluciones cualitativas, en la flora del alimento que van a ser analizados,
es decir que mantenga los mas fielmente posible la flora de la muestra
sin suprimirla ni favorecer su desarrollo.

La microbiología alimentaría se utilizan varios diluyentes, actualmente

los siguientes:

 Agua peptona con sal

 Solución ringer ¼
 Agua peptonada
 Agua peptonada tamponada

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Este ultimo diluyente se emplea normalmente para la técnica de

Salmonella y a veces para la investigación de Listeria monocytogenes.

Triturado de la muestra:

Se trata de una operación importante dentro de la preparación de la

muestra para su análisis, en el triturado hay que evitar la destrucción de
los gérmenes por rotura de su membrana o por calentamiento excesivo

Además de una perfecta trituración de los alimentos, es necesario

obtener una mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de
los gérmenes y sus toxinas.

Existen varios tipos de trituradores.

 Jarra, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de una

hélice que funciona cuando se adapta aun motor.
 Vástago: provisto de una hélice en su extremo que se introduce en la
mezcle que se va a triturar. Funciona eléctricamente y necesita un
envase de vidrio o acero que se adapte especialmente al vástago.
 Triturador de paletas (Stomacher), que actúa golpeando
rítmicamente la mezcla de alimentos y diluyente que ha sido
introducido previamente, en una bolsa de plástico estéril. Los
choques producidos por las paletas dislaceran el alimento y ponen
las bacterias en suspensión.

3. Transporte de muestras para su análisis:

Como regla general, se debe transportar estas muestras de alimentos de

la misma forma como un producto es normalmente transportado y
repartido en su comercialización: (DA SILVA, 1997).

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 Alimentos comercialmente estériles y herméticamente

envasados:

Pueden ser transportados a temperatura ambiente, debiendo ser

protegidos contra la exposición a temperaturas superiores a 45 ºC.
Atención: las latas estufadas deben ser transportadas y mantenidas
en refrigeración. Por otro lado, debe ser destinado al análisis de
confirmación de sospecha de deterioro por bacterias termófilas, en
refrigeración indicada, porque las células vegetativas de esos
microorganismos usualmente mueren en efecto de frío, siendo
común la concurrencia de esporulación en productos enlatados. Las
muestras de refrigerantes embotellados, comercializados a
temperatura ambiente, también pueden ser transportados y
colocados en esas condiciones.

 Alimentos con baja actividad de agua (deshidratada, seca o

concentrada):

Pueden ser transportados y colocados a temperatura ambiente,

debiendo ser protegidos contra la humedad.

 Alimentos perecibles comercializados en forma refrigerada (no

congelada):

Deben ser transportados y mantenidos en refrigeración, hasta el

momento del análisis. Como regla general, esas muestras deben ser
congeladas a tiempo, el recorrido entre la colecta y el análisis de la
muestra, no debe sobrepasar las 36 horas. Dependiendo del tipo de
producto, razón del análisis y microorganismos de investigación,
esas muestras deben estar congeladas, en la posibilidad de proceder
el análisis en un intervalo de tiempo considerado:

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 Muestras de ostras, mejillones, mariscos, etc. (moluscos de

concha) comercializadas en forma refrigerada, sin
congelamiento:

Deben ser analizados dentro de un máximo de 6 horas después de

la colecta, debiendo ser congeladas

 Muestras de agua en general:

Deben ser mantenidas en refrigeración y analizadas dentro de un

máximo de 30 horas después de colectadas, no debiendo ser
congeladas. Las muestras de agua embotelladas pueden ser
transportadas a temperatura ambiente y colocada a temperatura
ambiente, y mantenidas en su envase original, cerrada e intacta. Una
vez abierto el envase de la botella, esa muestra debe ser refrigerada
y analizada en un máximo de 24 horas.

 Muestra de huevo refrigerado:

Deben ser analizadas en lo posible, dentro de las 4 horas después

de la colecta, no se debe congelar.

 Muestra de producto vegetales fermentados o acidificados no

comercialmente estéril:

Deben ser colocados en refrigeración por no más de 24 horas, no

debiendo ser congeladas.

 Muestras destinadas a conteo de Vibrio sp., C. perfringens y

bacterias lácticas:

No deben ser congeladas, debido a la gran susceptibilidad de esos

microorganismos ante el congelamiento.

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 Muestras de alimentos perecibles comercializados en forma

congelada:

Deben ser transportados y mantenidos en congelamiento hasta el

momento del análisis, no deben ser puestos en congelamiento total o
parcial durante su transporte. La temperatura del envase de esas
muestras no debe ser superior a 10ºC.

 Transporte refrigerado de muestras perecibles resfriadas o

congeladas:

Pueden ser hechos en cajas de isopor congelado, siendo

recomendable que la refrigeración sea mantenida dentro de envases
de plástico, para evitar el acumulo de líquidos en las cajas. Las cajas
bien cerradas y con hielo suficiente para envolver todo el envase o el
frasco de muestra pueden mantener temperaturas de refrigeración
adecuadas por hasta 24 horas con hielo seco.

4. Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica

Los diluyentes recomendados para el análisis en la mayoría de

alimentos es el agua peptonada 0.1%, o agua salina peptonada o
tampón fosfato pH 7.2. La dilución inicial recomendada para la mayoría
de los alimentos sólidos es 1:10. En casos especiales en que se
recomienda una utilización de otros diluyentes y otras diluciones
iniciales. Las diferencias más frecuentes son: (DA SILVA, 1997).

 Análisis de derivados de la leche

En los análisis de algunos derivados de la leche el diluyente

recomendado en una solución de citrato de sodio 2% (quesos, leche
en polvo de baja solubilidad, yogurt y otras leches fermentadas) o

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agua destilada estéril (leche en polvo de alta solubilidad, leche

condensada, concentrados u otros evaporados).

 Análisis de Salmonella u otros microorganismos por

enriquecimiento

El análisis de Salmonella u otros microorganismos por

enriquecimientos, una dilución inicial es hecho directamente en el
caldo de enriquecimiento, siendo utilizada una segunda unidad
analítica, para los demás análisis, en el cual se adiciona el diluyente
tradicional. En caso de muestras preparadas por el método de lavada
en superficie o Refregado de superficie, para las cuales no hay
posibilidades, se debe obtener dos unidades analíticas diferentes, en
caso de material diluido en caldo de pre- enriquecimiento para
Salmonella puede ser utilizado para la realización de los demás
análisis.

 Análisis de moluscos en concha (ostras, mejillones, mariscos,

etc.)

La primera dilución debe ser de 1:1 y, en caso sea posible pipetear el

material y diluir a 1:3

 Análisis de condimentos

Puede ser trabajada con una unidad analítica de 11 gramos, diluida

en 99 ml de diluyente.

 Análisis de especies

Pueden ser trabajadas con unidades analíticas de 5 a 12.5 gramos,

siendo recomendable la dilución inicial de 1:100, en función de la alta
viscosidad del material.

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 Homogenización de unidad analítica con un diluyente

La homogenización de unidades analíticas con un diluyente puede

ser hecha de diferentes formas, dependiendo de las características
de la muestra ha analizar.

 Alimentos líquidos concentrados, molidos o en polvo:

Pueden ser homogenizados por simple agitación manual en el frasco

(invirtiendo 25 veces en un arco de 30 cm.) o en un “shaker” rotativo.
Las muestras de condimentos con cáscara o raíz, como la canela en
cáscara, por ejemplo, debe ser previamente molida en un licuificador
(100 gramos, 30 segundos en baja rotación), antes de ser retirada la
unidad analítica, adicionar el diluyente y homogenizar por agitación.

 Alimentos sólidos en piezas

Los alimentos sólidos en piezas, como cortes de carne, quesos

duros, chocolate en barra, etc., pueden ser homogenizados por
trituración en el licuificador, con una rotación de 8000 a 15000 rpm
por 1-2 minutos. Dependiendo de la resistencia del alimento, puede
ser sometida a una cantidad significativa de calor, principalmente si
el tiempo requerido para una trituración completa de la muestra
sobrepasa los 2 minutos. En las situaciones en que esto sea
esperado, se recomienda que el diluyente sea pre enfriado con un
baño de hielo, antes del inicio de la homogenización.

 Alimentos pastosos

Alimentos pastosos como extracto de tomate, pures, quesos molidos,

etc., pueden ser homogenizados por dispersión en “stomacher”,
generalmente requiriendo 30 a 60 segundos para una buena

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homogenización. Las muestras de mayonesa u otras coberturas

similares exige por lo menos 2 minutos y, un análisis de coliformes,
E. coli, Salmonella, S. aureus, Listeria y Yersinia deben ser tratadas
con una solución estéril de NaOH 1N, en cantidades necesarias para
neutralizar la acidez.

 Espesantes

La homogenización de espesantes por agitación, el diluyente debe

ser adicionando al producto, pues eso dificultará la dispersión. La
práctica recomendable es pesar la unidad analítica en un pedazo de
papel de aluminio estéril adicionar los diluyentes, asépticamente, en
constante aplicación. Para promover la aplicación, en ese caso, es
recomendable utilizar un agitador magnético, esterilizando
previamente la barra magnética. Opcionalmente, esas muestras
pueden ser homogenizadas en “stomacher” por 2 minutos.

 Baja solubilidad

Las muestras de alimentos en polvo con baja solubilidad, como el

huevo en polvo y la leche en polvo no instantáneo, también son
mejor homogenizadas por agitación con la ayuda de un agitador
magnético, adicionando el diluyente de a pocos, en constante
agitación.

 Alimentos gordurosos

Para homogenizar los alimentos sólidos con alto grado de gordura (>
20%), como tocino ahumado, por ejemplo, se recomienda utilizar el
diluyente previamente suplementado con 1% (peso/volumen) de
Tergitol 7 aniónico, Tween 80 o Triton X-100, para facilitar la
emulsificación. La homogenización se consigue de 1 a 2 minutos en

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licuificador, a baja rotación (8000 rpm). Esa forma de homogenizar

también puede ser utilizada para muestras con margarina, gorduras y
similares, que alternativamente pueden ser homogenizadas por
fusión en baño (40ºC/ 15 minutos), adicionar el diluyente a 40ºC,
agitar y preparar las diluciones seriadas rápidamente, antes que la
suspensión se enfríe.

II. OBJETIVO:

 Adiestrar al alumno en el manejo de preparación de muestras y

utilización de diluyentes en análisis microbiológico de alimentos.

III. MATERIAL:

a) Biológico: Alimentos Diversos.

b) Material de laboratorio: Los de uso común en el laboratorio.

c) Medios de cultivo y reactivos: Agua peptonada, Sol. Ringer ¼,

Solución buffer, Agua peptonada tamponada.

IV. METODO: (Norma ISO 6887-1983)

1. Preparación de la dilución primaria.

a. A partir de muestras líquidas:

Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en

las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o
fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).

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Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o

licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un
tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.

Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea

considerada suficientemente representativa de la muestra total (por
ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a

abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7
segundos. Tomar 1mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente
el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando
el contacto entre la pipeta y el diluyente.
 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas
mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o
99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente.

b. A partir de muestras sólidas o semisólidas.

Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben

descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más
de 24 horas antes de proceder a su análisis.

 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un

recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
 Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una
temperatura similar a la de la muestra.

 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2

minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea
según se indique en la técnica correspondiente para cada
alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe
exceder de 2,5 minutos.

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 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la

cantidad deseada tomando de las capas superiores de la
suspensión.

Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar

más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones
subsecuentes o expresión de resultados.

El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado

para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas
o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado
sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos)
de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con
aquellos obtenidos con licuadora.

2. Preparación de las diluciones decimales adicionales.

 Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución

primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el
volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el
contacto entre la pipeta y el diluyente.
 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la
misma manera que se describe anteriormente.

 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas

que se van a inocular, dependen del número esperado de
microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis
previos y de la información que se obtenga del personal de
inspección que la haya colectado. En ausencia total de información,
trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando

simultáneamente las cantidades que se hayan seleccionado. El
volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la
capacidad total de la pipeta.

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 Si la pipeta es Terminal y se transfiere un volumen de líquido

equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la
pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.

 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe

apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición
vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

 En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una

determinada especie de microorganismos en 0,1 mL o 0,1 g, no es
necesario preparar diluciones mayores.

 El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con

el número de microorganismos esperado es:

 Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde
sea posible demostrar el microorganismo en 10 mL de la dilución
más alta.

 Para la técnica de recuento estándar en placa, considerar

aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un
mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de
bacterias aerobias en placa.

 En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número

especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana
correspondiente.

3. Duración del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas

inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para
inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparación

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PROTOCOLO: ISO 6887-1983

Microbiology General guidance for the preparation of dilutions for

microbiological examination. International Organization for
Standardization

MUESTREO

Envase

Apertura

Etiqueta

Esterilización

Liquido desinfectantes

Almacenaje

Pesada

Diluyente Mtas. Sólidas y Semisólidas

1:10

Mtas. Liquidas
Agua peptonada con sal

Solucion Ringer ¼ : alimentos

Congeladas Tº Ambiente grasos
Agua tamponada peptonada y
fosfatada
Baño Maria 40-45ºC

Triturado Jarra, Vastago, Stomacher

Diluciones

1 ml 19
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1 ml
1 ml

10-2 10-3 10-4

FUNDAMENTO

Posteriormente a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una

dilución primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa
del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de
bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más uniforme
posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis.
Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los
microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven;
para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para
iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así
como para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.
Se encontró el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta
asegurar que después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable,
esto se logra después de realizar tantas diluciones decimales seriadas como
sea necesario, en el mismo diluyente.

V. BIBLIOGRAFIA

 Norma ISO 6887-1983 (E) Microbiology General guidance for the

preparation of dilutions for microbiological examination. International
Organization for Standardization.

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 PASCUAL M. R. 1992 Microbiología Alimentaría Impresiones Lauel

Madrid – España.

 DA SILVA, Nauseli; Manual de Métodos de Análisis de Microbiología

de Alimentos;1997; Ed. Varela; Sao Paulo.

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