UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ INHIBICIÓN ENZIMÁTICA DE LA

DESHIDROGENASA SUCCINÍCA DEL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y
HÍGADO
EXACTAS
Resumen
ESCUELA DE QUÍMICA Esta experiencia se realizó con la finalidad de
determinar la capacidad inhibidora que
presentan los diferentes tipos de inhibidores, en
este caso se utilizó malonato de sodio, azida de
sodio y cianuro de sodio. La enzima en estudio
INFORME DE LABORATORIO fue la deshidrogenasa succínica, es una
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA DE LA enzima que se encuentra asociado a la
DESHIDROGENASA SUCCINÍCA DEL membrana interna de la mitocondria; en este
HÍGADO laboratorio la fuente de mitocondrias fue el
hígado de pollo. El sustrato en este caso es el
succinato de sodio 0.2M. Se dispusieron de
seis tubos de ensayo en los cuales se agregó la
misma cantidad de homogenizado (enzima),
amortiguador y azul de metileno variando
PRESENTADO POR
entonces sustrato, agua destilada agregada y
SHARON CUBAS los inhibidores de azida, malonato y cianuro de
sodio. En los tubos que contenían los
(4-782-2072)
inhibidores de malonato, azida y cianuro de
sodio se obtuvo un tiempo de decoloración de
15.00, 15.18 y >15.30 minutos respectivamente
ESTEBAN ARJONA
y para los tubos que no contenía sustrato, y
(4-779-2316) que contenían el homogenizado a temperatura
ambiente y a 52°C se obtuvo que en el primer
caso no se observó cambios en la coloración;
en el segundo caso se observó una
decoloración a los 11.25 minutos y por último
en el caso del homogenizado a 52°C se obtuvo
PROFESORA un tiempo de 10.58 minutos. Con los resultados
se infiere que el inhibidor que presentó mejor
Mgtra. ALBERTINA MONTENEGRO
inhibición de la actividad enzimática
experimentalmente fue el malonato, sin
embargo teóricamente se sabe que el cianuro
es un inhibidor altamente efectivo. Por otro lado
se observó el efecto que ejerce la temperatura
sobre la actividad enzimática, debido que se
observó una mayor disminución de la actividad
23 DE MAYO DE 2017 al someter el homogenizado a una temperatura
de 52°C comparado al homogenizado que se
encontraba a temperatura ambiente. Podemos
concluir que la activad enzimática puede verse
afectada en una disminución de sus funciones
enzimáticas, debido al efecto de pH,
temperatura y también podrá verse afecta por
la presencia de inhibidores.
Objetivos
Analizar la importancia de los inhibidores
enzimáticos.
Resaltar el mecanismo de inhibición enzimática
sobre la deshidrogenasa succínica.
Explicar el mecanismo de acción de los
inhibidores empleados.
Introducción
Una oxidorreductasa es una enzima que
cataliza la transferencia de electrones desde
una molécula donante (el agente reductor) a
otra aceptora (el agente oxidante). Según
(González, 2010) nos dice que las enzimas
oxidorreductasas catalizan reacciones de
oxidorreducción, es decir, transferencia de
hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a
otro, según la reacción general:
Figura 1. Reacción general para de óxido reducción
de la succinato deshidrogenasa.
De acuerdo con (Sierra, 2013) dice que las
células de la gran mayorías de los organismos
vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones
de óxido reducción mediante la cual la gran
cantidad de energía liberada a través de la
degradación de moléculas orgánicas es
almacenada en moléculas de alto nivel
energético (ATP). La succinato deshidrogenasa
es una enzima clasificada dentro del grupo de
las oxidorreductasas, cataliza una reacción
muy importante en el metabolismo oxidativo de
la célula: la conversión del succinato en
fumarato. Esta enzima se localiza en
eucariontes en la membrana mitocondrial
interna. El H2 cedido por el succinato puede ser
transferido del FADH2 a un colorante
susceptible como el azul de metileno que al
cambiar su estado redox pasa de coloreado a
incoloro o viceversa. (González, 2010) explica
que la coloración de la oxidación y reducción
del azul de metileno al cambiar su estado
redox.
Acción de los inhibidores
Los inhibidores son sustancias que impiden la
actividad de las enzimas por combinarse con
radicales indispensables para el funcionamiento
enzimático o por ser agentes desnaturalizantes.
El inhibidor posee una estructura similar a la del
sustrato y compite por situarse en el sitio del
sustrato para formar un complejo enzima-
inhibidor, disociable, dificultando la formación
del complejo enzima-sustrato y por lo tanto la
actividad enzimática. La enzima no tiene acción
sobre el inhibidor, ni el inhibidor competitivo
desnaturaliza a la enzima; sólo impide su
función. (Alvarado, 2013).
Ejemplo de ello es la Deshidrogenasa succínica
en presencia de succinato y de un aceptor de
hidrógenos adecuado, convierte el succinato en
fumarato y reduce simultáneamente el aceptor
de H.
Factores que afectan a la actividad enzimática
Diferentes factores ambientales pueden afectar
a la actividad enzimática. Como lo son el pH, la
temperatura y la presencia de inhibidores.
Materiales y reactivos
Solución amortiguadora de fosfato monobásico
de sodio 0.1M de pH 7.4, agua destilada,
malonato de sodio 0.1M, succinato de sodio
0.2M, azida de sodio 0.1M, cianuro de sodio
0.1M, hígado fresco, acetona, gradillas, tubos
de ensayo, licuadora, vasos químicos (100-
250ml), varillas de vidrio, micropipetas Labmate
de 100/1000 µL, baño termostático.
Procedimiento
I. Se cortó una porción de 50 g de hígado
fresco en trozos pequeños y se homogenizó en
una licuadora con 100 mL de agua destilada.
II. Se midió 40 mL del homogenizado y se
diluyó hasta 200mL de agua destilada. Se agitó
la mezcla vigorosamente.
III. Se dispusieron de 6 tubos de ensayo en los La succinato deshidrogenasa es una enzima
cuales se les añadió las siguientes cantidades clasificada dentro del grupo de las
de reactivos en mL, como se muestra a oxidorreductasas, cataliza una reacción muy
continuación: importante en el metabolismo oxidativo de la
Tubo 1 2 3 4 5 6 célula: la conversión del succinato en fumarato.
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Esta enzima se localiza en eucariontes en la
Sustrato 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua membrana mitocondrial interna. El H2 cedido
1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0 por el succinato puede ser transferido del
destilada
Azul de FADH2 a un colorante susceptible como el azul
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
metileno de metileno que al cambiar su estado redox
Malonato de pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
- - - 0.5 - -
sodio
Azida de sodio - - - - 0.5 -
Cianuro de
- - - - - 0.5
sodio
homogenizado 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

IV. El homogenizado se agregó de último. El

homogenizado correspondiente al tubo 3 se
calentó previamente a una temperatura de
52°C por 15 minutos.

V. Todos los tubos se agitaron y se les adicionó
5 gotas de aceite mineral a cada uno (para
evitar interferencia ocasiona por el oxígeno del
aire).
VI. Se pusieron posteriormente los tubos en un
baño de agua a temperatura de 36°C, se
observaron los cambios en los diferentes tubos
y se registró el tiempo en que se decoloraban.
Resultados y discusión
Cuadro 1. Datos obtenidos en el tiempo de
decoloración de cada tubo de ensayo.
Figura 2. Decoloración de la enzima deshidrogenasa
succínica, por efecto de temperatura e inhibidores.
Figura 3. Reacción entre la succinato
deshidrogenasa y el azul de metileno.
En los resultado del tubo 1 como podemos
observar no hubo reacción ya que no contenía
sustrato además de que era nuestra sustancia
blanco por lo tanto no hubo inhibición. Por lo
tanto no pudo realizar su conversión de
succinato a fumarato.
En el tubo 2 podemos observar una
decoloración el cual nos indica que hubo
inhibición la cual se dio al cabo 11.25min, los
que nos señala que succinato deshidrogenada
pudo realizar la conversión de succinato a
fumarato. Según (Walla, 2000). esto se logra
removiendo 2H+ y 2 electrones del succinato
para formar fumarato y la coenzima reducida
(FADH2), en este caso la enzima
deshidrogenada succínica reduce al azul de
metileno, ya que este actúa como aceptor y el
azul de metileno reducido es incoloro.
En el tubo 3 podemos observar una
decoloración por lo tanto nos asegura que
hubo inhibición la cual se dio al cabo de 10.58
minutos, cabe señalar que esta reacción fue la
más rápida debido a que se le agrega calor
calentándolo previamente a temperatura de
520C lo cual un aumento de la temperatura
provoca un aumento en la velocidad de
reacción. Se utiliza azul de metileno porque es
un indicador redox apropiado para estas
funcione. Se trata de una sustancia de color
azul en su forma oxidada, que al aparecer
átomos de hidrógenos del sustrato originan la
forma leuco, la cual es incolora (Marks, 2006).
En el tubo 4 hubo inhibición debido a que hubo
una decoloración al cabo de 15 min. El
malonato es un inhibidor de la respiración
celular, porque se une al sitio activo de
la succinato deshidrogenasa en el ciclo del
ácido cítrico, pero no reacciona, compitiendo
con el succinato. En la reacción de fosforilación
oxidativa, el malonato es un inhibidor del
complejo II que, nuevamente,
contiene succinato deshidrogenasa. El
malonato es un inhibidor competitivo de la
deshidrogenasa succínica, de tal manera que la
presencia de malonato detiene el ciclo de
Krebs. La reacción que cataliza la enzima es la
de deshidrogenar al succinato para producir
fumarato y FADH2. Detener el ciclo de Krebs
implica parar la cadena respiratoria y por lo
tanto la maquinaria de producción de ATP.
Cuando ocurre la inhibición de una enzima que
se encuentra dentro de una determinada vía
metabólica, el sustrato de la enzima tiende a
acumularse, ya que no puede ser transformado
en un producto, (Gonzales, 2010).
En el tubo 5 se observa una decoloración al
cabo de 15.18 min lo cual no indica que hubo
reacción o inhibición. Las azidas afectan a la
cadena respiratoria. Son substancias que se
enlazan a alguno de los componentes de la
cadena de transporte de electrones bloqueando
su capacidad para cambiar de una forma
reversible desde la forma oxidada a la forma
reducida y viceversa.
 Esta inhibición resulta en una acumulación de
los componentes en sus formas reducidas
antes del punto de inhibición, y la presencia de
las formas oxidadas de los componentes de la
Cadena de Transporte de Electrones después
del punto de inhibición.
Y por último en el tubo 6 se observó que no
hubo una decoloración por lo tanto no hubo
actividad inhibidora en el tiempo estipulado. Sin
embargo el cianuro es un inhibidor más
efectivo según (Stryer, 2003). Se puede deducir
que no hubo una actividad inhibidora debido a
que no se le dejo reaccionar por más tiempo.
La función del cianuro como inhibidor es actuar
sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa
impidiendo su interacción con el oxígeno.
Conclusiones:
 Por medio de la reacción de oxidación
producida entre la deshidrogenasa y el azul
de metileno, que es un indicador redox
apropiado para homogenizados de tejidos,
se pudo evidenciar la actividad enzimática
que presenta la deshidrogenasa succínica
frente al efecto de la temperatura y a la
presencia de sustancias inhibidoras como el
malonato, azida y cianuro de sodio.
 Podemos concluir que la actividad
enzimática es de gran importancia debido a
que estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Por lo que nos
proporcionan información directa acerca del
mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificidad del enzima.
 Inferimos que la velocidad de reacción
observada en la reacción de oxidación del
azul de metileno y la deshidrogenasa
succínica es la velocidad máxima de
reacción, es decir, la velocidad en que se
da la aparición de los productos o la
desaparición de los reactivos.
 A través de los mecanismo de la acción
enzimática se puede aceleran la obtención
del equilibrio en un tiempo menor como
también la reacción ocurre de acuerdo al
número de moléculas con suficiente energía
cinética y adecuada orientación para
sobrepasar la energía de activación de la
reacción.
Bibliografía:
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el 21 de mayo de 2017 de
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/
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-Sierra, K. (2013). Actividad enzimática.

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-Stryer, L. (2003). Bioquímica. México: Ed.
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-Walla, M. Marchuk, D. (2000). Activated
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