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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA EN HÍGADO

Cubas, Sharon1 Montenegro, Andrés2 Morales, Marín3

Universidad Autónoma de Chiriquí, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Escuela de Química,


Bioquímica (código: Qm 382), Ciudad universitaria-El cabrero, David, Chiriquí, Panamá,
ID: 4-782-20721, 4-742-9122, 4-748-11363; E-mail: sharyanc.18@gmail.com1, andy42_1987@hotmail.com2,
m2marinmorales31@gmail.com3
Resumen
Esta experiencia se realizó con la finalidad de detectar la actividad presentada por la enzima
deshidrogenasa succínica y determinar la capacidad inhibidora que presentan los diferentes tipos de
inhibidores, en este caso se utilizó malonato de sodio, azida de sodio y cianuro de sodio. La enzima
en estudio que fue la deshidrogenasa succínica, es una enzima que se encuentra asociado a la
membrana interna de la mitocondria; en este laboratorio la fuente de mitocondrias fue el hígado de
pollo. El sustrato en este caso es el succinato de sodio 0.2M. Se dispusieron de seis tubos de ensayo
en los cuales se agregó la misma cantidad de homogenizado (enzima), amortiguador y azul de
metileno variando entonces sustrato, agua destilada agregada y los inhibidores de azida, malonato y
cianuro de sodio. En los tubos que contenían los inhibidores de malonato, azida y cianuro de sodio se
obtuvo un tiempo de decoloración de >60 minutos, aproximadamente en una hora y >60 minutos
respectivamente y para los tubos que no contenía sustrato, y que contenían el homogenizado a
temperatura ambiente y a 52°C se obtuvo que en ninguno de los dos se observó decoloración. Con
los resultados se infiere que el inhibidor que presentó mejor inhibición de la actividad enzimática
experimentalmente fue la azida, sin embargo teóricamente se sabe que el cianuro es un inhibidor
altamente efectivo. Por otro lado se observó el efecto que ejerce la temperatura sobre la actividad
enzimática, debido que se observó una mayor disminución de la actividad al someter el homogenizado
a una temperatura de 52°C comparado al homogenizado que se encontraba a temperatura ambiente.
Podemos concluir que la activad enzimática puede verse afectada en una disminución de sus
funciones enzimáticas, debido al efecto de pH, temperatura y también podrá verse afecta por la
presencia de inhibidores.

Objetivos: hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a


 Detectar la actividad enzimática de la otro, según la reacción general:
deshidrogenasa succínica en extractos de
hígado utilizando indicadores redox como
aceptores artificiales de electrones.
 Establecer que sustancias pueden actuar
como inhibidores de la deshidrogenasa
succínica. Figura 1. Reacción general para de óxido
reducción de la succinato deshidrogenasa.
Marco teórico:
Una oxidorreductasa es una enzima que De acuerdo con (Sierra, 2013) dice que las
cataliza la transferencia de electrones desde células de la gran mayorías de los organismos
una molécula donante (el agente reductor) a vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones
otra aceptora (el agente oxidante). Según de óxido reducción mediante la cual la gran
(González, 2010) nos dice que las enzimas cantidad de energía liberada a través de la
oxidorreductasas catalizan reacciones de degradación de moléculas orgánicas es
oxidorreducción, es decir, transferencia de almacenada en moléculas de alto nivel
energético (ATP). La succinato deshidrogenasa
es una enzima clasificada dentro del grupo de Gradilla - 1
las oxidorreductasas, cataliza una reacción Licuadora - 1
muy importante en el metabolismo oxidativo de Baño termostático - 1
Plancha - 1
la célula: la conversión del succinato en
Hígado - 50 g
fumarato. Esta enzima se localiza en
eucariontes en la membrana mitocondrial
Cuadro 2. Reactivos.
interna. El H2 cedido por el succinato puede ser
transferido del FADH2 a un colorante Reactivo Cantidad Toxicidad
susceptible como el azul de metileno que al Provoca ligera irritación
cambiar su estado redox pasa de coloreado a Fosfato en los ojos, se
3 mL
monobásico desconocen otros
incoloro o viceversa. (González, 2010) explica
efectos adversos.
que la coloración de la oxidación y reducción del Este reactivo no
azul de metileno al cambiar su estado redox. Succinato 2.5 mL produce ningún efecto
de sodio perjudicial a la salud
Acción de los inhibidores humana ni al ambiente.
Los inhibidores son sustancias que impiden la Por contacto en los ojos
actividad de las enzimas por combinarse con y piel puede provocar
radicales indispensables para el funcionamiento Malonato irritación leve a grave.
500 µL
enzimático o por ser agentes desnaturalizantes. de sodio No se conoce efectos
por aspiración e
El inhibidor posee una estructura similar a la del
ingesta.
sustrato y compite por situarse en el sitio del
sustrato para formar un complejo enzima- Por ingesta irritación al
inhibidor, disociable, dificultando la formación tracto digestivos y
del complejo enzima-sustrato y por lo tanto la mucosas, por
Azida de aspiración irritación
actividad enzimática. La enzima no tiene acción sodio
500 µL
aguda a vías
sobre el inhibidor, ni el inhibidor competitivo respiratorias. Provoca
desnaturaliza a la enzima; sólo impide su ligera irritación tras
función. (Alvarado, 2013). contacto en ojos y piel.

Ejemplo de ello es la Deshidrogenasa succínica En la mayoría de los


en presencia de succinato y de un aceptor de casos, una intoxicación
hidrógenos adecuado, convierte el succinato en por cianuro causa en la
piel un cambio de color
fumarato y reduce simultáneamente el aceptor de normal a rojo. Sin
de H. embargo, si se trata de
un daño físico o falta de
Factores que afectan a la actividad enzimática oxígeno, el color de la
Diferentes factores ambientales pueden afectar piel puede ser azulado.
a la actividad enzimática. Como lo son el pH, la Por aspiración el
temperatura y la presencia de inhibidores. producto es corrosivo
Cianuro de
500 µL para las vías
Materiales y reactivos sodio
respiratorias. La
sustancia inhibe la
Cuadro 1. Materiales. respiración celular y
Instrumento Capacidad Cantidad puede provocar
250 mL 4 cambios en la sangre,
Vasos químicos sistema nervioso
100 mL 2
Micropipetas y central y en la tiroides.
1000 µL 2 Por ingesta es
puntas
Tubos de ensayo - 6 altamente tóxico e
Balanza semi- irritante tras contacto en
3 kg 1 los ojos y piel.
analítica
Procedimiento La succinato deshidrogenasa es una enzima
I. Se cortó una porción de 50 g de hígado fresco clasificada dentro del grupo de las
en trozos pequeños y se homogenizó en una oxidorreductasas, cataliza una reacción muy
licuadora con 100 mL de agua destilada. importante en el metabolismo oxidativo de la
II. Se midió 40 mL del homogenizado y se diluyó célula: la conversión del succinato en fumarato.
hasta 200mL de agua destilada. Se agitó la Esta enzima se localiza en eucariontes en la
mezcla vigorosamente.
membrana mitocondrial interna. El H2 cedido
III. Se dispusieron de 6 tubos de ensayo en los
por el succinato puede ser transferido del
cuales se les añadió las siguientes cantidades
de reactivos en mL, como se muestra a FADH2 a un colorante susceptible como el azul
continuación: de metileno que al cambiar su estado redox
pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sustrato 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua
1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0
destilada
Azul de
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
metileno
Malonato de
- - - 0.5 - -
sodio
Azida de sodio - - - - 0.5 -
Figura 3. Reacción entre la succinato
Cianuro de
- - - - - 0.5 deshidrogenasa y el azul de metileno.
sodio
homogenizado 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
En los resultado del tubo 1 como podemos
IV. El homogenizado se agregó de último. El observar no hubo reacción ya que no contenía
homogenizado correspondiente al tubo 3 se sustrato además de que era nuestra sustancia
calentó previamente a una temperatura de 52°C blanco por lo que no hubo inhibición. De esta
por 15 minutos. forma no pudo realizar su conversión de
V. Todos los tubos se agitaron y se les adicionó succinato a fumarato. En el tubo 2 podemos
5 gotas de aceite mineral a cada uno (para observar una decoloración el cual nos indica
evitar interferencia ocasiona por el oxígeno del que hubo inhibición la cual se dio al cabo de
aire). aproximadamente una hora, los que nos señala
VI. Se pusieron posteriormente los tubos en un que succinato deshidrogenada pudo realizar la
baño de agua a temperatura de 36°C, se conversión de succinato a fumarato. Según
observaron los cambios en los diferentes tubos
(Walla, 2000), esto se logra removiendo 2H+ y
y se registró el tiempo en que se decoloraban.
2 electrones del succinato para formar fumarato
Resultados y discusión y la coenzima reducida (FADH2), en este caso
la enzima deshidrogenada succínica reduce al
azul de metileno, ya que este actúa como
aceptor y el azul de metileno reducido es
incoloro.
En el tubo 3 no podemos observar una
decoloración por lo tanto nos asegura que no
hubo inhibición, debido a que la reacción no
procedió por el hecho de calentar previamente
Figura 2. Decoloración de la enzima a temperatura de 520C lo cual un aumento de la
deshidrogenasa succínica, por efecto de temperatura provoca la desnaturalización de la
temperatura e inhibidores.
enzima deshidrogenasa la cual trabaja Y por último en el tubo 6 se observó que no
óptimamente a 37 °C. Se utiliza azul de metileno hubo una decoloración por lo tanto no hubo
porque es un indicador redox apropiado para actividad inhibidora en el tiempo estipulado. Sin
estas funcione. Se trata de una sustancia de embargo el cianuro es un inhibidor más efectivo
color azul en su forma oxidada, que al aparecer según (Stryer, 2003). Se puede deducir que no
átomos de hidrógenos del sustrato originan la hubo una actividad inhibidora debido a que no
forma leuco, la cual es incolora (Marks, 2006). se le dejo reaccionar por más tiempo. La función
del cianuro como inhibidor es actuar sobre el
En el tubo 4 no se aprecia una decoloración
Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su
prominente, sin embargo si hubo inhibición
interacción con el oxígeno.
debido a que se observa una decoloración
tenue. El malonato es un inhibidor de Conclusiones:
la respiración celular, porque se une al sitio  Por medio de la reacción de oxidación
activo de la succinato deshidrogenasa en producida entre la deshidrogenasa y el azul
el ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona, de metileno, que es un indicador redox
compitiendo con el succinato. En la reacción apropiado para homogenizados de tejidos,
de fosforilación oxidativa, el malonato es un se pudo evidenciar la actividad enzimática
inhibidor del complejo II que, nuevamente, que presenta la deshidrogenasa succínica
frente al efecto de la temperatura y a la
contiene succinato deshidrogenasa. El
presencia de sustancias inhibidoras como el
malonato es un inhibidor competitivo de la malonato, azida y cianuro de sodio.
deshidrogenasa succínica, de tal manera que la  Podemos concluir que la actividad
presencia de malonato detiene el ciclo de enzimática es de gran importancia debido a
Krebs. La reacción que cataliza la enzima es la que estudia la velocidad de las reacciones
de deshidrogenar al succinato para producir catalizadas por enzimas. Por lo que nos
fumarato y FADH2. Detener el ciclo de Krebs proporcionan información directa acerca del
implica parar la cadena respiratoria y por lo mecanismo de la reacción catalítica y de la
tanto la maquinaria de producción de ATP. especificidad del enzima.
 Inferimos que la velocidad de reacción
Cuando ocurre la inhibición de una enzima que observada en la reacción de oxidación del
se encuentra dentro de una determinada vía azul de metileno y la deshidrogenasa
metabólica, el sustrato de la enzima tiende a succínica es la velocidad máxima de
acumularse, ya que no puede ser transformado reacción, es decir, la velocidad en que se da
en un producto, (Gonzales, 2010). la aparición de los productos o la
desaparición de los reactivos.
En el tubo 5 se observa una decoloración en un  A través de los mecanismo de la acción
trascurso de tiempo parecido al tubo 2 lo cual enzimática se puede aceleran la obtención
nos indica que hubo reacción o inhibición. del equilibrio en un tiempo menor como
Las azidas afectan a la cadena respiratoria. también la reacción ocurre de acuerdo al
Son substancias que se enlazan a alguno de los número de moléculas con suficiente energía
componentes de la cadena de transporte de cinética y adecuada orientación para
electrones bloqueando su capacidad para sobrepasar la energía de activación de la
cambiar de una forma reversible desde la forma reacción.
oxidada a la forma reducida y viceversa. Esta
inhibición resulta en una acumulación de los Bibliografía:
componentes en sus formas reducidas antes -Alvarado, S. (2013). Bioquímica II. Recuperado
del punto de inhibición, y la presencia de las el 7 de noviembre de 2017 de
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